FMDV、BTV、PPRV多重RT-PCR檢測(cè)方法的建立

何亞鵬，張 琪，徐麗美，龐文靜，付明哲，許信剛

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

FMDV、BTV、PPRV多重RT-PCR檢測(cè)方法的建立

何亞鵬，張 琪，徐麗美，龐文靜，付明哲，許信剛

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

為建立能夠同時(shí)檢測(cè)并鑒別口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV)、藍(lán)舌病病毒(Bluetongue virus，BTV)和小反芻獸疫病毒(Peste des petits ruminants virus，PPRV)感染的多重RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，Reverse transcription-polymerase chain reaction)方法，根據(jù)3種病毒的基因組全序列和保守區(qū)序列設(shè)計(jì) 3 對(duì)特異性引物，優(yōu)化反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件，建立能夠同時(shí)檢測(cè) 3 種病毒的多重RT-PCR方法。結(jié)果表明，建立的多重RT-PCR檢測(cè)方法敏感性強(qiáng)，對(duì)FMDV、BTV和PPRV的核酸最低檢測(cè)量分別為15.42、6.29、16.50 ng/μL；特異性試驗(yàn)結(jié)果表明所建立方法的特異性良好。建立的多重RT-PCR方法具有敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、快速簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，可以用于臨床上 3 種病毒感染的診斷和鑒別。

口蹄疫病毒；藍(lán)舌病病毒；小反芻獸疫病毒；多重RT-PCR

口蹄疫、藍(lán)舌病、小反芻獸疫分別是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV)、藍(lán)舌病病毒(Bluetongue virus，BTV)、小反芻獸疫病毒(Peste des petits ruminants virus，PPRV)引起的動(dòng)物急性傳染病，這 3 種病毒都可以引起反芻動(dòng)物發(fā)病，且發(fā)病率高，并能夠形成大范圍流行，均被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為法定報(bào)告的動(dòng)物疫病[1-3]，在中國(guó)被列為一類動(dòng)物疫病[4]。臨床上存在 3 種病毒混合感染，患畜均表現(xiàn)出精神沉郁，體溫升高，口腔黏膜、乳頭和蹄部冠狀帶等處發(fā)生水泡及潰瘍，臨床癥狀極為相似[5-7]。目前對(duì)這 3 種疫病的診斷多采用病原分離鑒定及常規(guī)的血清學(xué)方法，所需時(shí)間較長(zhǎng)，普通PCR檢測(cè)需要不同的反應(yīng)體系，耗時(shí)費(fèi)力。因此建立能同時(shí)、快速、精確檢測(cè)并鑒別FMDV、BTV、PPRV 3 種病毒感染的多重RT-PCR方法十分必要。多重PCR技術(shù)是在同一PCR體系中加入多對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增多種目的基因的分子生物學(xué)檢測(cè)方法，具有快速、靈敏、特異等優(yōu)點(diǎn)[8]。本研究針對(duì) 3 種病毒基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物，建立特異、敏感、快速并能同時(shí)檢測(cè)鑒別FMDV、BTV和PPRV感染的多重RT-PCR方法，以期為這 3 種病毒感染的同時(shí)診斷及鑒別提供方法。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 病毒與質(zhì)粒 PPRV疫苗株為新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品；豬瘟兔化弱毒活疫苗(CSFV)為中牧股份有限公司產(chǎn)品；羊口瘡疫苗(ORFV)和山羊痘疫苗(GTPV)為齊魯動(dòng)物保健品有限公司產(chǎn)品；BTV的RNA、FMDV的RNA、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)和Vero細(xì)胞由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 待檢組織或病料 23 份病料是2015年陜西省部分地區(qū)養(yǎng)羊場(chǎng)病羊的痂皮、肝臟、脾臟、肺臟和淋巴結(jié)等組織樣品，每頭羊的各種組織混合為 1 份病料。

1.1.3 主要試劑 Fast Quant RT反轉(zhuǎn)錄試劑盒和Trizol Reagent試劑盒為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；Premix rTaqDNA聚合酶為大連寶生物有限公司產(chǎn)品；小量凝膠回收試劑盒Easy Pure Quick Gel Extraction Kit、克隆載體pEASY-T1 Cloning Kit、小量質(zhì)粒提取試劑盒Easy Pure Plasmid Mini Prep Kit為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方 法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)NCBI上公布的 3 種病毒的全基因序列并參考國(guó)內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)[4,9-10]，應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì) 3 對(duì)引物，分別用于擴(kuò)增FMDV的 3D基因、BTV的 NS3基因和PPRV的N基因的保守區(qū)。利用NCBI BLAST對(duì)引物的特異性進(jìn)行比對(duì)， 3 對(duì)引物均具有良好的特異性。引物信息見表1，引物由Invitrogen公司合成。將各引物濃度稀釋至20 μmol/L，-20 ℃保存，備用。

表1 PCR引物信息Table 1 The information of primers for PCR

1.2.2 病毒RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 小反芻獸疫疫苗株RNA的提取按Trizol Regent試劑盒說明進(jìn)行，所提取的RNA溶于DEPC水中。按照Fast Quant RT Kit試劑盒說明書將 3 種病毒RNA分別反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)體系：RNA 2 μg，10×Fast RT Buffer 2 μL，RT Enzyme Mix 1 μL，F(xiàn)Q-RT Primer Mix 2 μL，RNase-Free ddH2O 補(bǔ)至20 μL，反應(yīng)條件：42 ℃孵育15 min，95 ℃孵育 3 min，得到的cDNA于-20 ℃保存，備用。

1.2.3 單項(xiàng)PCR檢測(cè) 分別以合成的FMDV、BTV、PPRV的cDNA進(jìn)行單引物單模板PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為25 μL：Premix rTaqDNA聚合酶混合物12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL(20 μmol/L)，cDNA 2 μL，去離子水9.5 μL。PCR程序：預(yù)變性94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃再延伸10 min。為探索不同退火溫度對(duì)擴(kuò)增效果的影響，將退火溫度設(shè)置51、53、55、57、59 ℃ 5個(gè)梯度，以確定單項(xiàng)PCR擴(kuò)增的最佳退火溫度。

1.2.4 多重RT-PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化 測(cè)定FMDV、BTV、PPRV的cDNA質(zhì)量濃度，統(tǒng)一稀釋至50 μg/L，各取1 μL混合后作為多重PCR模板，建立多重PCR反應(yīng)體系。對(duì)多重PCR退火溫度(51、53、55、57、59 ℃ 5個(gè)梯度)和引物濃度(FMDV、BTV、PPRV上下游各0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μmol/L 5個(gè)梯度)等反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，選擇最佳退火溫度和引物濃度。

1.2.5 多重RT-PCR特異性試驗(yàn) 采用優(yōu)化后的反應(yīng)條件，在反應(yīng)體系中分別加入 3 種病毒的cDNA和 3 種cDNA混合物作為模板，同時(shí)分別加入CSFV的cDNA、PRRSV的cDNA、ORFV的DNA、GTPV的DNA、Vero細(xì)胞的DNA及滅菌雙蒸水作為模板，進(jìn)行多重PCR反應(yīng)。

1.2.6 多重RT-PCR反應(yīng)靈敏性檢測(cè) 測(cè)定FMDV、BTV、PPRV的RNA的質(zhì)量濃度分別為48.2、98.4和51.6 ng/μL。取FMDV、BTV、PPRV的RNA各10 μL進(jìn)行混合，然后將混合物進(jìn)行倍比稀釋(50～56)，分別將不同稀釋倍數(shù)的RNA混合物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系：RNA混合物 3 μL，10×Fast RT Buffer 3 μL，RT Enzyme Mix 1.5 μL，F(xiàn)Q-RT Primer Mix 3 μL，RNase-Free ddH2O 補(bǔ)至30 μL，反應(yīng)條件：42 ℃孵育15 min，95 ℃孵育3 min。得到的cDNA采用優(yōu)化的擴(kuò)增條件進(jìn)行多重RT-PCR擴(kuò)增，檢測(cè)多重RT-PCR反應(yīng)的靈敏性。

1.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 應(yīng)用建立的多重PCR方法，分別對(duì)FMDV、BTV、PPRV的cDNA及 3 個(gè)cDNA混合陽性樣品、CSFV的cDNA、PRRSV的cDNA、ORFV的DNA、GTPV的DNA、Vero細(xì)胞的DNA及滅菌雙蒸水樣品各 2 份重復(fù)檢測(cè) 3 次，以檢測(cè)所建立方法的重復(fù)性。

1.2.8 臨床樣品檢測(cè) 利用建立的多重RT-PCR方法對(duì)陜西省部分羊場(chǎng)送檢的 23 份病羊的痂皮、肝臟、脾臟、淋巴結(jié)和肺臟組織樣品進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)采用已經(jīng)建立的單項(xiàng)RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行比較[1,9-10]。取疑似病料混合樣品約100 mg，加液氮充分研磨后轉(zhuǎn)入組織勻漿器中，加入10 mmol/L PBS(pH 7.2)1 mL充分勻漿。于-80 ℃反復(fù)凍融 3 次裂解細(xì)胞后，12 000 r/mim離心5 min，上清用于病毒RNA的提取，其余操作按照“1.2.4”已優(yōu)化的檢測(cè)方法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 單項(xiàng)RT-PCR擴(kuò)增

通過單項(xiàng)RT-PCR檢測(cè)，瓊脂糖凝膠電泳可觀察到130 bp(圖1-a，F(xiàn)MDV)、257 bp(圖1-b，BTV)和687 bp(圖1-c，PPRV)的條帶，大小與預(yù)期相符，證明引物特異性良好，5個(gè)退火溫度之間差異較小(圖1)。

a:FMDV；b:BTV；c:PPRV;M.DNA marker DL2000；1～5.退火溫度分別為49、51、53、55和57 ℃ Annealing temperatures were 49 ℃, 51 ℃, 53 ℃, 55 ℃ and 57 ℃ respectively

圖1單項(xiàng)RT-PCR擴(kuò)增及退火溫度優(yōu)化
Fig.1OptimizationforannealingtemperatureofsingleRT-PCR

2.2 多重RT-PCR引物優(yōu)化

取不同濃度的引物組合進(jìn)行多重RT-PCR反應(yīng)，以獲取最佳的引物濃度。結(jié)果表明，F(xiàn)MDV、BTV和PPRV引物濃度為0.4 μmol/L時(shí)多重PCR擴(kuò)增效果最好(圖2)。

M.DNA marker DL2000；1. FMDV、BTV、PPRV引物終濃度都為0.2 μmol/L Primers concentration for FMDV, BTV and PPRV were 0.2 μmol/L;2. FMDV、BTV、PPRV引物終濃度都為0.4 μmol/L Primers concentration for FMDV, BTV and PPRV were 0.4 μmol/L;3.FMDV、BTV、PPRV引物終濃度都為0.6 μmol/L Primers concentration for FMDV, BTV and PPRV were 0.6 μmol/L;4. FMDV、BTV、PPRV引物終濃度都為0.8 μmol/L Primers concentration for FMDV, BTV and PPRV were 0.8 μmol/L;5. FMDV、BTV、PPRV引物終濃度都為1.0 μmol/L Primers concentration for FMDV, BTV and PPRV were 1.0 μmol/L

圖2多重RT-PCR引物濃度優(yōu)化
Fig.2TheprimerconcentrationoptimizationresultsofmultiplexRT-PCR

2.3 多重RT-PCR退火溫度優(yōu)化

選取不同的退火溫度(49～57 ℃)進(jìn)行多重RT-PCR反應(yīng)，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，在53～57 ℃都有較好的擴(kuò)增效果，試驗(yàn)最終選擇55 ℃作為退火溫度(圖3)。

M.DNA marker DL2000；1～5.退火溫度分別為49、51、53、55、57 ℃ Annealing temperatures were 49 ℃, 51 ℃, 53 ℃, 55 ℃ and 57 ℃, respectively

圖3多重RT-PCR退火溫度優(yōu)化
Fig.3TheannealingtemperatureoptimizationresultsofmultiplexRT-PCR

2.4 特異性擴(kuò)增

采用優(yōu)化的PCR反應(yīng)條件，在反應(yīng)體系中分別加入FMDV、BTV和PPRV的cDNA及 3 種cDNA混合物作為模板，同時(shí)分別加入CSFV的cDNA、PRRSV的cDNA、ORFV的DNA、GTPV的DNA、Vero細(xì)胞的DNA及滅菌雙蒸水作為模板，進(jìn)行多重PCR反應(yīng)。結(jié)果表明， 3 種病毒的cDNA模板以及 3 種cDNA混合物作為模板均能擴(kuò)增到相對(duì)應(yīng)的目的條帶，而其他結(jié)果均為陰性，說明此方法特異性好(圖4)。

2.5 靈敏性試驗(yàn)

多重RT-PCR靈敏性試驗(yàn)結(jié)果表明，在FMDV、BTV和PPRV的引物濃度為0.4 μmol/L時(shí)，該多重RT-PCR方法能檢測(cè)出FMDV、BTV和PPRV的最低RNA質(zhì)量濃度分別為15.42、6.29、16.50 ng/μL(圖5)。

M. DNA marker DL2000；1～10. 多重PCR模板分別為FMDV、BTV、PPRV、FMDV+BTV+PPRV、CSFV、PRRSV、GTPV、ORFV、VERO細(xì)胞和ddH2O The template of multiplex PCR were FMDV、BTV、PPRV、FMDV+BTV+PPRV、CSFV、PRRSV、GTPV、ORFV、VERO cell line and ddH2O

圖4多重RT-PCR特異性試驗(yàn)
Fig.4SpecificitytestofthemultiplexRT-PCR

M. DNA marker DL2000；1～7.依次為50～56倍比稀釋的病毒RNA Different dilutions of RNA from 50～56

圖5多重RT-PCR靈敏性試驗(yàn)
Fig.5SensitivitytestofthemultiplexRT-PCR

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

應(yīng)用建立的多重RT-PCR方法在不同時(shí)間對(duì)每份樣品進(jìn)行 3 次重復(fù)檢測(cè)。結(jié)果表明，檢測(cè)結(jié)果一致，說明該方法重復(fù)性良好。

2.7 臨床樣品檢測(cè)

應(yīng)用建立的多重RT-PCR方法對(duì)陜西省部分羊場(chǎng)送檢的 23 份病羊的痂皮、肝臟、肺臟、脾臟和淋巴結(jié)樣品進(jìn)行檢測(cè)，所有樣品檢測(cè)結(jié)果均為陰性，采用已經(jīng)建立的單項(xiàng)RT-PCR檢測(cè)所得結(jié)果也均為陰性。

3 討 論

近年來，中國(guó)口蹄疫疫情不斷發(fā)生，給養(yǎng)殖戶造成重大損失，再加上周邊國(guó)家口蹄疫疫情復(fù)雜、流行毒株跨境傳播的威脅進(jìn)一步加大中國(guó)口蹄疫防控的復(fù)雜性和難度[5]。中國(guó)云南省(1979)、湖北省(1983)、安徽省(1985)、四川省(1988)、山西省(1993)、廣西壯族自治區(qū)(1985)等地均報(bào)道藍(lán)舌病的爆發(fā)。吉林省、遼寧省、新疆維吾爾自治區(qū)和西藏自治區(qū)也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)藍(lán)舌病的存在[6,11]。小反芻獸疫作為外來病，近期再次在中國(guó)部分省份發(fā)生和流行，提示必須加強(qiáng)對(duì)小反芻獸疫的防控工作[12]。所以，應(yīng)建立完善的防控體系，及時(shí)快速地診斷、凈化、隔離，建立免疫緩沖帶，這樣才能消除國(guó)內(nèi)的疫情和阻止國(guó)外疫情向中國(guó)蔓延。目前，用于診斷這 3 種疾病的方法主要有病原分離鑒定、ELISA、常規(guī)RT-PCR、膠體金免疫試驗(yàn)等。病原的分離鑒定雖然可靠但耗時(shí)長(zhǎng)且過程繁瑣，不宜用于大規(guī)模疾病的臨床診斷。血清學(xué)試驗(yàn)方法是國(guó)內(nèi)主要使用的檢測(cè)手段，但其存在相對(duì)滯后、成本高的缺陷。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，PCR方法已經(jīng)成為眾多病原檢測(cè)和分析的主要手段，但目前還未見能一次性檢測(cè)和鑒別口蹄疫、藍(lán)舌病、小反芻獸疫的RT-PCR方法的報(bào)道。盡快開發(fā)出可鑒別這 3 種疫病的快速、特異且敏感的診斷方法，對(duì)控制這些具有嚴(yán)重危害的傳染病在中國(guó)流行具有十分重要的意義。

多重PCR(multiplex PCR)方法具有高效、系統(tǒng)、經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，是在同一個(gè)PCR反應(yīng)體系中加入2對(duì)或2對(duì)以上的引物，能同時(shí)擴(kuò)增出對(duì)應(yīng)的多個(gè)核酸片段的PCR方法。多種病原體在同一反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)被檢出將大大節(jié)省時(shí)間、試劑、經(jīng)費(fèi)。該技術(shù)主要用于多種病原微生物的同時(shí)檢測(cè)或鑒定某些遺傳病及癌基因的分型鑒定等。本研究針對(duì)中國(guó)面臨的口蹄疫、藍(lán)舌病和小反芻獸疫疫情的嚴(yán)峻形勢(shì)，建立多重RT-PCR方法，旨在對(duì)這 3 種疫病的快速精確診斷、為防控疫情爭(zhēng)取有利條件。所建立的多重RT-PCR方法能在同一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)檢測(cè)出FMDV、BTV和PPRV 3 種病毒的核酸，省時(shí)省力。通過對(duì)檢測(cè)方法特異性、敏感性的考察及對(duì)樣品的檢測(cè)，初步表明該方法可以應(yīng)用于口蹄疫、藍(lán)舌病和小反芻獸疫單純感染和混合感染的檢測(cè)。

建立一種多重PCR檢測(cè)方法須經(jīng)一步步的條件優(yōu)化才能達(dá)到預(yù)期的效果。本試驗(yàn)過程中，經(jīng)過對(duì) FMDV、BTV 和 PPRV 引物濃度和退火溫度的優(yōu)化，各目的片段能夠被有效擴(kuò)增。敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法能檢測(cè)出FMDV、BTV 和 PPRV 的最低 RNA質(zhì)量濃度分別為15.42、6.29、16.50 ng/μL，敏感性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，并且已經(jīng)可以滿足臨床檢測(cè)和監(jiān)測(cè)的需要。本試驗(yàn)中目的片段均間隔120 bp以上，擴(kuò)增結(jié)果顯示目的條帶在瓊脂糖凝膠電泳后易于區(qū)分且無非特異性擴(kuò)增出現(xiàn)。應(yīng)用本研究建立的多重PCR方法對(duì) 23 份臨床病料進(jìn)行檢測(cè)，從檢測(cè)結(jié)果可以看出均未能檢出相應(yīng)病毒核酸，與已建立的單項(xiàng)RT-PCR檢測(cè)所得結(jié)果一致，表明在檢測(cè)的病料中不存在這些重要的Ⅰ類病原感染，下一步將增加對(duì)臨床樣品檢測(cè)數(shù)量，以進(jìn)一步豐富檢測(cè)數(shù)據(jù)并為流行病學(xué)調(diào)查提供資料。此外，引起羊發(fā)病的還有綿羊痘病毒、山羊痘病毒、羊口瘡病毒等DNA病毒以及支原體，所以建立能同時(shí)檢測(cè)羊常見DNA和RNA病毒以及支原體混合感染的多重PCR方法是進(jìn)一步研究的重點(diǎn)。

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JIANG K Y.Application progress in diagnostic method of Peste Des Petits Ruminants[J].ModernJournalofAnimalHusbandryamp;VeterinaryMedicine,2014(5):53-57(in Chinese with English abstract).

CorrespondingauthorXU Xingang,male,Ph.D,associate professor.Research area:molecular etiology.E-mail: 286567031@qq.com FU Mingzhe, male, senior veterinary officer. Research area: sheep and goat disease. E-mail：1692831800@qq.com

(責(zé)任編輯：顧玉蘭Responsibleeditor:GUYulan)

EstablishmentofMultiplexRT-PCRMethodforDetectingFMDV,BTVandPPRV

HE Yapeng, ZHANG Qi, XU Limei, PANG Wenjing, FU Mingzhe and XU Xingang

(College of Veterinary Medicine, Northwest Aamp;F University, Yangling Shaanxi 712100, China)

In order to develop multiplex RT-PCR method for the clinical detection of FMDV, BTV and PPRV infection of goats and sheep, three pairs of primers were designed and synthesized according to the highly conserved regions of FMDV, BTV and PPRV genome sequence in GenBank. The multiplex RT-PCR reaction condition was optimized and the multiplex RT-PCR method for detecting FMDV, BTV and PPRV infection was established. The results showed that the newly-established method had high sensitivity. The lowest levels of the three viruses were 15.42 ng/μL,6.29 ng/μL and 16.50 ng/μL, respectively. The specificity test showed that the newly-established method has high specificity. The result indicated multiplex RT-PCR method had specificity, sensitivity, repetitive characteristics and it has applied value in detection of FMDV, BTV and PPRV infection．

FMDV(Foot-and-mouth disease virus); BTV(Bluetongue virus); PPRV(Peste des petits ruminants virus); Multiplex RT-PCR

2016-05-26

2016-06-14

Scientific and Technological Projects of Shaanxi Province(No.2016NY-092); Major Industrial Innovation Chain Projects of Shaanxi Province(No.2016KTZDNY02-06)； Technology Achievement Project of Demonstration Station(Base) of Northwest Aamp;F University(No.TGZX2015-32).

HE Yapeng, male, master student.Research area: molecular etiology and immunology. E-mail:879533817@qq.com

日期：2017-11-17

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20171117.1101.002.html

2016-05-26

2016-06-14

陜西省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新與攻關(guān)(2016NY-092)；陜西省重點(diǎn)產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新鏈(2016KTZDNY02-06)；西北農(nóng)林科技大學(xué)試驗(yàn)示范站(基地)科技成果推廣(TGZX2015-32)。

何亞鵬，男，碩士研究生，從事分子病原學(xué)與免疫學(xué)研究。E-mail：879533817@qq.com

許信剛，男，博士，副教授，主要從事分子病原學(xué)研究。E-mail：286567031@qq.com 付明哲，男，高級(jí)獸醫(yī)師，主要從事羊病研究。E-mail：1692831800@qq.com

S855.3

A

1004-1389(2017)11-1584-06