發菜固氮酶nifH 基因克隆及其干旱脅迫下的差異表達

吳詩杰，王玲霞，劉 陽，嚴奉坤，丁苗苗，李曉旭，梁文裕

(寧夏大學 生命科學學院，銀川 750021)

發菜固氮酶nifH 基因克隆及其干旱脅迫下的差異表達

吳詩杰，王玲霞，劉 陽，嚴奉坤，丁苗苗，李曉旭，梁文裕

(寧夏大學 生命科學學院，銀川 750021)

通過對發菜固氮酶H亞基基因(nifH)全長進行克隆、原核表達和生物信息學分析，采用qRT-PCR技術，分析不同干旱脅迫下發菜固氮酶基因nifH在轉錄水平的表達變化。結果表明，根據特異性引物克隆獲得長度為894 bp的nifH，GenBank 登陸號為BankIt1901364(KU886163)。將nifH在大腸桿菌中表達，獲得約36 ku的外源蛋白。生物信息學分析表明，發菜nifH與已報道的多種藍藻的nifH及推導的氨基酸序列具有較高的相似性，nifH二級結構和三級結構主要由α螺旋、β-折疊、隨機卷曲和β-轉角構成。隨藻體含水量的逐漸降低，發菜nifH在轉錄水平上的表達量逐漸增加，固氮酶活性呈現先增加后下降的趨勢。研究結果為進一步研究發菜固氮酶基因的分子結構和發菜響應干旱脅迫的固氮機制及氮代謝過程奠定基礎。

發菜；固氮酶；基因克隆；生物信息學；差異表達

固氮酶在生物固氮過程中扮演著重要的角色。固氮酶由固氮基因nif編碼，不同物種間基因nif有較高的同源性[1-2]。在鉬鐵固氮酶系統中，nifH基因編碼鐵蛋白，還參與鐵鉬輔因子(FeMoco)生物合成并指導鐵鉬輔因子嵌入鉬鐵蛋白。nifH基因是所有生物固氮物種相對保守的功能基因，目前，已有較多研究通過nifH基因的遺傳多樣性來探討不同生境固氮微生物的群落結構和多樣性，并發現在不同植被和地理條件下存在多樣的nifH基因[3-5]。而在研究固氮藍藻生物固氮分子機制及固氮基因遺傳多樣性等問題方面，固氮酶及其基因信息豐富程度是重要前提。

發菜(NostocflagelliformeBorn. et Flah.)是一種由念珠狀細胞包埋在公共膠質鞘內構成絲狀藻體的陸生藍藻，生長在氮素相當缺乏的干旱、半干旱荒漠草原地區，具有較強的固氮能力[6]。發菜在濕潤狀態下，短時間45 ℃易使固氮酶失去活性；在干燥和高溫55 ℃條件下，其固氮活性保持穩定不變[7]。水分對固氮活性有重要的影響，吸水的發菜中固氮酶活性高于干燥的發菜固氮酶[8]。在“干燥-濕潤”交替的生態條件下，發菜固氮酶活性逐步提高，抗旱能力明顯增強[7]。發菜日生長周期固氮酶活性變化研究發現，在發菜適宜的生長季節，早晨固氮酶活性處于較高水平，中午固氮酶活性急劇下降，傍晚固氮酶活性又逐漸提高[9]。因此，發菜固氮酶活性的變化與其分布區生態環境具有明顯的相關性，但目前發菜固氮酶的研究主要集中在環境條件與酶活性變化等方面[7-9]，固氮酶各亞基基因及固氮酶分子結構信息相對缺乏，干旱脅迫下固氮酶基因的表達及相應調控機制尚不清楚，制約了對發菜生物固氮分子機理的認識。本研究對發菜固氮酶H亞基基因(nifH)全長進行克隆、表達和生物信息學分析，進而分析干旱條件下發菜nifH的差異表達及固氮酶活性變化，為進一步研究發菜固氮酶基因的分子結構和發菜響應干旱脅迫的固氮機理及氮代謝機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理

野生發菜采自寧夏賀蘭山發菜分布區。在溫度25 ℃、持續光照、光照度10 000 lx、無持續風速、相對空氣濕度30%的條件下，模擬自然環境在培養床上對發菜進行3種干旱脅迫處理，分別為A處理：發菜充分吸水并保持4 h的樣品(含水量800%±15%)，B處理：發菜充分吸水后自然失水6 h(含水量200%±8%)，C處理：發菜充分吸水后自然失水48 h(含水量15%±3%)(圖1)。每個樣品3個生物學重復。將樣品用滅菌速凍的錫箔紙迅速包好放入液氮中冷凍，于-80 ℃冰箱保藏，備用。含水量計算公式為[(鮮質量-干質量)/干質量]×100%。

圖1 干旱脅迫條件下發菜藻體Fig.1 Colonies of N.flagelliforme under different drought stress

1.2 方 法

1.2.1 發菜DNA提取及nifH的克隆 發菜基因組DNA提取參照梁文裕等[10]DNA提取方法。根據發菜同源性較高物種的nifH序列設計特異性引物P1和P2(表1)。按照94 ℃ 8 min；94 ℃ 45 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，30個循環；最后72 ℃，11 min的程序進行PCR反應。產物用TIANGEN DNA純化回收試劑盒回收純化，并和pMD18-T Vector在16 ℃連接12 h，反應結束后，立即轉化和測序。測序結果提交NCBI，并應用BLAST程序在GenBank上進行相似性比較。

表1 nifH 擴增、原核表達及qRT-PCR引物序列Table 1 Primer sequences of amplification, prokaryotic expression and qRT-PCR of nifH

1.2.2 發菜nifH的原核表達 根據發菜nifH的測序結果，設計擴增nifH的特異性引物EP1和EP2，并在上、下游游引物5′末端分別添加限制性酶切位點BamHⅠ和XhoⅠ(單下劃線所示)，兩端加保護性堿基CGC和CCG(雙下劃線所示)(表1)。以含有nifH的陽性菌液為模板，進行PCR擴增(94 ℃ 8 min；94 ℃ 45 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s 30個循環；72 ℃ 11 min)。

37 ℃下將PCR產物和質粒pET28a(+)用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切2 h，回收目的片段，16 ℃連接12 h，轉化大腸桿菌DH5a，Kan篩選陽性克隆子，37 ℃，180 r/min振蕩培養后進行PCR驗證。將驗證成功的陽性菌液培養12 h提取質粒DNA，使用限制性內切酶BamHⅠ和XhoⅠ分別對pET28a質粒和經PCR擴增得到nifH基因進行雙酶切處理。雙酶切驗證成功的陽性克隆菌液進行測序。IPTG誘導表達和SDS-PAGE電泳檢測等參照梁文裕等[10]的方法。

1.2.3nifH誘導表達產物的Western blotting 鑒定 SDS-PAGE后，用半干轉移儀將蛋白從凝膠轉移到PVDF膜上，20 mL 5 g/L (W/V)脫脂奶粉封閉。一抗為1∶2 000兔抗nifH多克隆抗體，二抗為1∶4 000羊抗兔IgG。用化學顯色蛋白免疫印跡法進行Western blotting分析。

1.2.4 生物信息學分析方法 采用生物信息學分析方法對發菜nifH核苷酸序列及推譯的氨基酸序列進行分析(表2)。

表2 生物信息學分析方法Table 2 Bioinformatics methods

1.2.5 發菜RNA反轉錄及熒光定量PCR反應 按照TIANGEN多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取發菜總RNA。cDNA第一鏈的合成參照TaKaRa Super RT Kit說明書。經檢測合格并定量的總RNA逆轉錄成cDNA。設計qRT-PCR引物RT-PCR-P1和RT-PCR-P2，16S rRNA qRT-PCR引物16S rRNA-P1和16S rRNA-P2為內標引物(表1)，在BioRad icycler iQ熒光定量PCR儀進行擴增(95 ℃，10 min；94 ℃ 15 s，57 ℃ 15 s ，72 ℃ 25 s，35個循環)。

1.2.6 干旱脅迫條件下發菜固氮酶活性檢測 參照Stewart等[11]的方法對發菜固氮酶活性進行檢測。分別取不同干旱脅迫處理的0.2 g 發菜樣品置于50 mL玻璃瓶中，密閉后注入氬氣保持10～15 min，然后將樣品在25 ℃、40 μmol/(m2·s) 10% C2H2條件下孵育3 h，氣相色譜(HP-6890)檢測C2H4的生成量。固氮酶活性根據C2H4生成量換算。

1.2.7 數據處理 采用Sigmaplot 12.5進行方差分析，檢驗數據的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 發菜nifH 的克隆

以發菜基因組DNA為模板，PCR擴增得到894 bp的目的條帶(圖2)。陽性單菌落PCR鑒定，擴增產物在894 bp處出現特異性條帶(圖3)，表明外源目的片段已成功克隆。將測序結果提交NCBI，GenBank登錄號分別為：BankIt 1901364(KU886163)。

1.nifH ；M.DL2000

1.nifH陽性轉化子(DH5a)nifHpositive transformant(DH5a/nifH)；2.陰性對照 Negative control； M.DL2000

圖3nifH陽性轉化子(DH5a)的PCR檢測
Fig.3PCRidentifieationofpositivetransformant(DH5a/nifH)

2.2 原核表達與驗證

構建的nifH表達載體pET28a-nifH雙酶切后，在894 bp處出現一條與預期片段大小一致的特異性條帶(圖4)，說明nifH表達載體構建成功。將pET28a-nifH質粒轉化到大腸桿菌BL21(Kan抗性)中，IPTG誘導nifH蛋白表達，SDS-PAGE 電泳檢測發現有大量外源蛋白表達，分子質量約為36 ku(圖5)，經凝膠掃描測定，IPTG誘導5 h后外源蛋白約占細菌蛋白總量的45%。

M.DL15000+DL2 000；1.pET28a-nifH

圖4重組表達載體pET28a-nifH的酶切
Fig.4RestrictionanalysisofrecombinantplasmidpET28a-nifH

M. 蛋白分子質量標準 Protein marker；1. IPTG 誘導的空質粒轉化子 IPTG induced negative transformant；2. 未誘導的空質粒轉化子 IPTG uninduced negative transformant；3. 未誘導的陽性質粒轉化子 IPTG uninduced positive transformant with pET28a-nifH；4. IPTG 誘導 1 h 的陽性質粒轉化子 IPTG induced positive transformant with pET28a-nifHafter 1 h；5. IPTG 誘導 5 h 的陽性質粒轉化子 IPTG induced positive transformant with pET28a-nifHafter 5 h；6. IPTG 誘導 3 h 的陽性質粒轉化子 IPTG induced positive transformant with pET28a-nifHafter 3 h;圖6同 The same as fig.6

圖5nifH蛋白在大腸桿菌中表達的SDS-PAGE電泳圖譜
Fig.5SDS-PAGEimageofnifHexpressedinE.coli

應用nifH蛋白多克隆抗體對克隆的nifH大腸桿菌表達產物的進行Western blot檢測，轉入大腸桿菌的nifH在IPTG誘導后的細菌中有預期大小的顯色條帶(圖6)，證明表達的外源蛋白確實為nifH蛋白。

圖6 nifH蛋白Western blot 雜交圖譜Fig.6 Western blot profile of nifH expressed in E.coli

2.3 發菜nifH 基因生物信息學分析

用NCBI里OFR Finder分析結果表明，nifH具有完整的開放閱讀框(ORF)，其全長894 bp，編碼297個氨基酸，等電點(pI)為4.56，起始氨基酸為甲硫氨酸，終止氨基酸為絲氨酸(圖7)。

發菜nifH CDS區包含19種氨基酸，谷氨酸(Glu)數目最多，為30個，占整個氨基酸組成的10.1%；組氨酸(His)和半胱氨酸(Cys)僅為3個，所占比例最低，為1.68%，不含色氨酸(圖8)。

對發菜nifH的核苷酸序列進行同源性分析，發現發菜與點形念珠藻(NostocpunctiformePCC 73102)和地木耳(Nostoccommune)的相似性最高，分別為95%和94%，與靜水筒藻(CylindrospermumstagnalePCC 7417)為94%，與球形念珠藻(Nostocsp. PCC 7107)、球腥藻(Anabaenasp. L-31)和多變魚腥藻(AnabaenavariabilisATCC 29413)均為89%，與念珠藻(Nostocsp. PCC 7120)為88%，與池型念珠藻(NostocpiscinaleCENA21)僅為88%(圖9)。

將nifH推譯的氨基酸序列與其他藻類進行同源性比較，發現發菜和點形念珠藻(NostocpunctiformePCC 73102)的同源性最高，為99%，與地木耳(Nostoccommune)為97%，與靜水筒藻(CylindrospermumstagnalePCC 7417)為94%，與球形念珠藻(Nostocsp. PCC 7107)為91%，與池型念珠藻(NostocpiscinaleCENA21)、球腥藻(Anabaenasp. L-31)和多變魚腥藻(AnabaenavariabilisATCC 29413)均為89%，而與念珠藻(Nostocsp. PCC 7120)僅為87%(圖10)。

對nifH磷酸化位點分析表明，Ser有4個磷酸化位點，Thr有3個磷酸化位點，Tyr有2個磷酸化位點(圖11)。

圖7 發菜nifH 的核苷酸序列(上)和推導氨基酸序列(下)Fig.7 Nucleotide sequence(upper lines) and its deduced amino acid sequence(lower lines) of the nifH from N.flagelliforme

圖8 發菜nifH 氨基酸組成預測Fig.8 Putative amino acid composition of nifH from N.flagelliforme

圖9 發菜nifH 的核苷酸序列同源樹Fig.9 Homologous tree of nucleotide sequences of nifH from N.flagelliforme

圖10 發菜nifH 的氨基酸序列同源樹Fig.10 The homologous tree of amino acid sequences of nifH from N.flagelliforme

綠色代表絲氨酸 Green represent Serine;藍色代表蘇氨酸 Blue represent Threonine；粉色代表酪氨酸 Pink represent Tyrosine

圖11nifH蛋白磷酸化位點在序列中的位置
Fig.11PredictedphosphyorylationsitesinsequenceofnifHfromN.flagelliforme

對發菜nifH的氨基酸序列做疏水性分析，發現多肽鏈第240位的丙氨酸親水性最強，第273位的谷氨酸疏水性最強。

發菜nifH蛋白的氨基酸序列跨膜區分析表明，nifH為膜外蛋白(圖12)。

對發菜nifH 二級結構進行預測，表明發菜nifH 主要由α-螺旋、β-折疊、隨機卷曲和β-轉角構成(表3)。運用swissmodel服務器對發菜nifH進行建模分析，并用PyMOL 軟件繪制蛋白三級結構圖，顯示這些α-螺旋、β-折疊、隨機卷曲和β-轉角構成通過延伸鏈連接折疊成不對稱的三維空間結構(圖13)。

圖12 nifH 跨膜區分析Fig.12 The TMHMM posterior probabilities for sequence of nifH from N.flagelliforme

表3 發菜nifH 二級結構預測結果Table 3 Secondary structure prediction of nifH from N.flagelliforme

注：# 氨基酸數目；## 占總氨基酸的百分比。

Note：# amount of amino acid; ## amino acid in total percentage.

2.4 發菜nifH qRT-PCR分析

提取的發菜總RNA經檢測，OD260/OD280在1.9～2.0。qRT-PCR結果表明，在干旱脅迫條件下，發菜nifH在轉錄水平上呈現上調表達趨勢，B處理和C處理發菜nifH基因的表達量較對照組的nifH均表現為增加，且存在顯著差異(Plt;0.05)。其中，C處理的發菜nifH表達量為對照組(A)發菜的1.82倍(圖14)。

不同小寫字母表示差異顯著(Plt;0.05)。圖15同。

Different lowercase letters mean significant difference(Plt;0.05).The smae as fig.15.

圖14干旱脅迫下nifH相對表達量
Fig.14RelativeexpressionofnifHrelativegeneinN.flagelliformeunderdroughtstress

2.5 干旱脅迫下發菜固氮酶活性的變化

發菜在充分吸水條件下(A)，固氮酶活性達7.5 μmol/(g·h)，當干燥失水6 h(B)時，固氮酶活性顯著高于充分吸水時固氮酶活性(Plt;0.05)，而失水干燥48 h時(C)，固氮酶活性降低，小于充分吸水和干燥失水6 h(B)時固氮酶活性(Plt;0.05)(圖15)。

圖15 干旱脅迫下發菜固氮酶活性的變化Fig.15 Changes of nitrogenase activities in N.flagelliforme under drought stress

3 討論與結論

目前，藍藻固氮酶基因信息尚不豐富，NCBI數據庫中具有固氮酶基因信息的藍藻主要為水生種類，而陸生耐旱藍藻由于其對分布區具有重要的拓荒固氮的生態作用，基因分子信息的豐富程度對認識其由水生到陸生再到干旱的荒漠草原環境的進化及其生物固氮機制具有重要意義。本研究通過特異性引物克隆獲得全長為894 bp的發菜nifH基因信息及原核表達產物，這為認識發菜進化機制及其響應干旱脅迫的固氮機理和氮代謝機理提供信息及試驗基礎。此外，Gao等[12]對發菜與幾種藍藻的分子水平檢測后認為，發菜與點形念珠藻具有很近的親緣關系。本研究通過核苷酸和氨基酸序列同源比對，表明發菜與已知其他藍藻一致性都在88%以上，表明發菜nifH和nifH均較保守。系統進化樹分析結果表明，發菜nifH和nifH最先與點形念珠藻聚類，其次與地木耳、靜水筒藻等物種聚類合并，這也進一步證明了發菜與點形念珠藻親緣關系較近。

固氮酶是生物固氮的關鍵酶。一般認為，固氮酶的基因表達水平受到外界復雜的環境因素影響[13]。在海洋環境中，單細胞固氮藍藻nifH基因的表達水平隨晝夜光照和水體鹽分含量的變化而變化，但在土壤環境中，土壤中肥料的含量和晝夜光照變化對固氮群落中nifH的表達水平無顯著影響[14]。本研究結果表明，發菜nifH基因在轉錄水平隨藻體水分散失程度的加深而增加，說明干旱脅迫可能誘導nifH基因表達水平增加。Liang等[8]研究表明，與充分吸收水分的發菜藻體相比，失水48 h的發菜其nifH蛋白表達量和固氮酶活性均下降，但NH3含量卻逐漸增加。本研究表明，隨著發菜干旱脅迫程度的增加，固氮酶活性呈現先增加后下降的趨勢。分析認為，從基因到蛋白的生物學過程受到轉錄水平的調控和翻譯水平的調控等諸多水平的精確調控和影響，僅僅轉錄水平的上調還不能直接導致翻譯的蛋白表達量增加。同時，理論上固氮酶活性強，促進固氮反應；固氮酶活性下降，固氮反應減弱，然而固氮酶活性受多種因素綜合調控[15]，尤其nifM是調節固氮酶活性的重要基因，其產物構成固氮酶活性中心的一部分，并調節nifD和nifK的活性，而nifM和nifS產物調節nifH的活性[16-17]。因此，在干旱脅迫條件下發菜nifH表達調控機制以及nifM和nifS是如何調節nifH的表達尚需進一步研究。

綜上所述，發菜nifH基因全長為894 bp，與已報道的多種藍藻的nifH及推導的氨基酸序列具有較高的相似性，nifH二級結構和三級結構主要由α-螺旋、β-折疊、隨機卷曲和β-轉角構成。干旱脅迫導致發菜nifH差異表達和固氮酶活性的變化。

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CorrespondingauthorLIANG Wenyu,male,Ph.D,professor. Research area:environmental botany and protection and utilization of plant resources.E-mail：liangwy2009@163.com

(責任編輯：史亞歌Responsibleeditor:SHIYage)

CloningofnifHfromN.flagelliformeandItsDifferentialExpressionPatternunderDroughtStress

WU Shijie, WANG Lingxia, LIU Yang, YAN Fengkun, DING Miaomiao, LI Xiaoxu and LIANG Wenyu

(School of Life Sciences, Ningxia University, Yinchuan 750021, China)

N.flagelliformeis a kind of terrestrial nitrogen-fixing cyanobacterium, which is distribute in arid or semiarid steppes and has important ecological value. Full length ofnifHwas cloned by specific primer,nifHwas expressed inE.coli, DNA sequence and its encoded protein was analyzed by bioinformatics methods, differential expression in transcriptional level was also tested by qRT-PCR. The results indicated that full length ofnifHis 894 bp (GenBank access number is BankIt1901364 (KU886163). Heterologous protein (36 ku) was expressed inE.coli.The nucleotide sequence and the encoded amino acid sequence ofnifHwere highly homologous to other cyanobacteria species. The secondary structure and tertiary structure were made up ofα-helix,β-sheet, random coil andβ-turn. In addition, expression level ofnifHgradually increased in transcriptional level with the decrease of water content in colonies ofN.flagelliforme, and changes of nitrogenase activities incresed firstly and then decreased under drought stress. The results laid a foundation for further research on structure of nitrogenase gene and molecular mechanism of nitrogen-fixing forN.flagelliformein response for drought stress.

N.flagelliforme; Nitrogenase; Gene cloning; Bioinformatics; Differential expression

2017-01-11

2017-02-21

Natural Science Grant of Ningxia(No.NZ1608).

WU Shijie, female,master student.Research area:environmental botany.E-mail：398538403@qq.com

日期：2017-11-17

網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20171117.1101.012.html

2017-01-11

2017-02-21

寧夏自然科學基金(NZ1608)。

吳詩杰，女，碩士研究生，研究方向為環境植物學。E-mail：398538403@qq.com

梁文裕，男，博士，教授，研究方向為環境植物學及植物資源保護和利用。E-mail：liangwy2009@163.com

Q78

A

1004-1389(2017)11-1639-09