3 種應用于正畸支抗的金屬材料的細胞毒性和遺傳毒性檢測

張清華 范紅

3種應用于正畸支抗的金屬材料的細胞毒性和遺傳毒性檢測

張清華 范紅

目的初步評價應用于口腔正畸支抗種植體的金屬材料：商業純鈦(cpTi)，鈦合金(Ti6Al4V),醫用316L不銹鋼的生物安全性。方法參考國標GB/T16886.5-2003以及醫療行業標準YY/T0127.2-2009所規定的方法，采用體外細胞毒性實驗，體外遺傳毒性實驗及急性全身毒性實驗對3 種材料進行測試。結果cpTi、 Ti6Al4V和平316L不銹鋼100%浸提液的細胞毒性分別為0 級、1 級、 2 級；DNA OTM分別為2.16±0.09， 9.84±1.78和10.79±0.39; 細胞尾部DNA分別為(0.43±0.01)%、 (0.92±0.43)%和(1.22±0.06)%。小鼠體內急性毒實驗3 種材料顯示毒性體征，未引起小鼠體重變化。結論cpTi生物安全性優于Ti6Al4V和316L。

商業純鈦； 鈦合金； 不銹鋼； 生物安全性

隨著不同類型微型種植支抗釘的不斷涌現，商業純鈦由于其合適的機械性能和出色的生物相容性廣泛應用在種植體市場[1-2]， 然而商業純鈦(cpTi)的抗疲勞強度低于鈦合金(Ti6Al4V)[3]，Ti6Al4V一直是整形外科應用較多的材料，其較純鈦具有更好的機械性能和抗腐蝕性能，并且具有比純鈦更低的彈性模量[4]。然而由于口腔環境存在腐蝕作用，Ti6Al4V釋放的金屬離子可能與臨床上種植體失敗以及一系列毒性反應有關，所以本文將對目前應用于臨床的3 種正畸支抗種植體材料通過體內體外實驗進行生物學安全性評價。目前，廣泛應用于正畸領域的支抗種植體的材料主要有Ti6Al4V，商業純鈦，醫用316L不銹鋼[5],至今未見關于上述三者綜合的生物安全性評價文獻報道，因此，本實驗的目的是通過體內和體外實驗來對3 種應用于正畸支抗種植體的材料進行生物安全性評價。

1 材料與方法

1.1 材料及試樣的制備

試樣制備按照國家標準，將純鈦、鈦合金、不銹鋼(北京有色金屬研究院提供)采用機械加工的方法，分別制備成直徑15 mm，厚1 mm以及直徑10 mm、厚度為1 mm的圓片，金相砂紙打磨至3000目，各組取10 枚鈦片經過丙酮，無水乙醇，去離子水各10 min超聲振蕩清洗。干燥，紫外線雙面照射30 min消毒備用。

1.2 材料浸提液的制備及所需試劑

按照標準CB/T16886.12中所描述的方法進行浸提液的制備。將上述消毒后的樣品浸泡于含有10%小牛血清的DMEM培養基中按照3 cm2/ml比例進行浸提，置于37 ℃培養箱中靜止浸提72 h，制得的浸提液按照實驗需要稀釋成原始濃度的50%,作為實驗組，陰性對照組為10%胎牛血清的DMEM培養液，陽性對照為0.1%的苯酚。置于4 ℃冰箱備用。

1.3 細胞毒性試驗

取對數生長期的人成骨樣細胞MG-63用0.25%的胰蛋白酶消化后制成單細胞懸液，調整細胞濃度為5×103個/ml,加入96孔板進行培養，每個孔200 μl培養液，37 ℃、5%CO2培養24 h。細胞貼壁后，待細胞數目達到80%以后空白對照組用10%胎牛血清的DMEM培養液置換，實驗組分別用100%，50%的浸提液置換，放入培養箱中培養，每組設6復孔。培養后的第1、3、5天各取1 塊96孔板，加入CCK-8,培養1 h,檢測用紫外分光光度計(Muhiscan, Thermo,美國)于450 nm波長處進行檢測，計算細胞相對增殖率(relative growth rate, RGR)。

細胞相對增殖率應用以下計算公式： RGR(%)=(A sample/A control)×100%(A sample：待測樣本的吸光光度值，A control：對照組的吸光光度值)

根據5 級毒性評價標準分級(cytotoxicity grade, CTG)，對各組結果進行評價(表 1)。

表 1 RGR和CTG之間的關系

1.4 遺傳毒性的檢測

單細胞凝膠電泳實驗(SCGE)主要參考Singh等[10]所描述的方法并加以改進。

1.4.1 單細胞懸液的制備 細胞暴露于合金浸提液后，消化細胞，經1 000 r/min離心洗滌后，懸浮于預冷的PBS中，使細胞懸液的細胞密度約為1×106個/ml，同時用臺盼蘭染色技術細胞的存活率，以保證細胞存活率大于95%。

1.4.2 制片 取100 μl 1%正常熔點瓊脂糖鋪在潔凈的黏附載玻片置于4 ℃冰箱中,待瓊脂糖凝固,將10 μl單細胞懸液，約含1×104個細胞，與75 μl 0.65%低熔點瓊脂糖混合均勻,鋪于第一層瓊脂糖上，置于4 ℃冰箱10 min待瓊脂糖凝固。每個樣本制備2 個平行樣本。

1.4.3 細胞的裂解 將載玻片浸入新配置的預冷的細胞裂解液中4 ℃冰箱放置1 h。

1.4.4 電泳 取出載玻片，在蒸餾水中漂洗3 次，去除殘留的細胞消化液，放置于水平電泳槽中，加入新配置的電泳緩沖溶液(pH=13)避光作用20 min，使DNA解旋，在300 mA、20 V條件下電泳20 min(1 V/cm)。

1.4.5 中和染色 用預冷的Tris中和緩沖液浸洗3 次，每次晾干，用溴化乙錠EB(20 μl，25 mg/L)染色，再蓋上蓋玻片，放置于熒光顯微鏡下讀片。

所有步驟黃光下進行，避免額外的DNA損傷。

1.4.6 讀片分析 400 倍熒光顯微鏡(OLYMPUS-BX51)下觀察(熒光激發波長為590 nm),數碼相機(OLYMPUS-DP50)拍攝，每個樣本取200 個細胞，使用CASP軟件分析細胞尾部DNA百分含量(percentage of DNA in the tail,%tail DNA)和Olive尾相(olive tail moment,OTM)作為DNA損傷的指標。

1.5 急性全身毒性實驗

1.5.1 實驗動物 健康成年白化小白鼠35 只，體重150～280 g(山西醫科大學實驗動物中心)，根據實驗材料隨機分成7 組(n=5)。

1.5.2 實驗方法 按照標準ISO 10993-11,2006所描述的全身毒性試驗方法進行(表 2)。

表 2 急性全身毒性分級

2 結 果

2.1 細胞毒性試驗

第1天實驗組及陰性對照組細胞貼壁，隨著時間的增加，DMEM對照組，純鈦組，鈦合金組觀察到鏡下觀察細胞充分伸展，呈長梭形，胞質飽滿。316L不銹鋼組細胞貼壁不完全，視野下細胞數量少(圖 1)。采用CCK-8法檢測各組金屬浸提液是否具有細胞毒性，分別應用試劑盒培養1、3、5 d檢測細胞毒性，結果顯示不銹鋼組3 d和5 d與對照組DMEM組相比吸光度值較低，且具有統計學意義。純鈦組細胞毒性級別為0 級，合金組毒性均為1 級，在第5天時不銹鋼組細胞毒性為2 級，參考表 1純鈦和鈦合金組無毒性，不銹鋼組具有輕度細胞毒性(表 3)。

A: 對照組； B: cpTi組; C: Ti6Al4V組; D: 316 L不銹鋼組

圖 1 細胞一般形態觀察(×400)

A: Control group; B: cpTi group; C: Ti6Al4V group; D: 316L stainless steel group

Fig 1 Cell morphology observed by optical microscope(×400)

Tab 3 The absorbance value and RGR of MG-63 cells and the cytotoxicity grade of the samples (n=6，±s，%)

注： ①Plt;0.05, 與空白組相比較

2.2 遺傳毒性試驗

彗星實驗結果顯示，陽性苯酚組及316L不銹鋼組均有彗尾，純鈦組，陰性對照組及鈦合金組均未見明顯彗尾(圖 2)。表 4中結果顯示，316L不銹鋼浸提液組的尾部DNA百分量高于陰性對照組，但低于陽性對照組，差異均具有顯著性，由此說明316L不銹鋼組具有輕微的遺傳毒性。

2.3 急性全身毒性實驗結果比較

經觀察各組實驗動物的一般狀態，肉眼觀察未見明顯的毒性表現，動物活躍，反應敏捷，毛色光亮，進食正常，無動物死亡顯像，但各組動物的體重變化顯示不同實驗組對小鼠的體重無一定的影響(表 5)。

A： cpTi組； B： 陽性苯酚組； C： 316L不銹鋼組； D： 空白對照組； E： Ti6Al4V組

圖 2 單細胞凝膠電泳(彗星)實驗(×400)

A： cpTi； B： Phenol； C： 316L stainless steel； D： Blank； E： Ti6Al4V

Fig 2 Single-cell gel(comet) assay(×400)

Tab 4 Olive tail moment and percentage of DNA in the OTM tail of the different extracts (n=3, ±s)

注： OTM(Olive tail moment)： 尾部DNA占總DNA的百分比與頭、尾部中心間距的乘積； %tail DNA: 尾部DNA百分量，尾部和總彗星熒光百分比

表 5 小鼠實驗前后體重(g,n=5)

Tab 5 Weights of the mice before and after test (g, n=5)

3 討 論

不同材料組成的正畸材料將會在口腔環境中釋放不同的金屬離子[6]，材料的這種性能可能與其生物安全性有關，這種生物安全性是一種相對的、實用意義上的安全概念，指在一定接觸水平下，其伴隨的毒性很低或其危險程度在人們能接受的范圍內。種植體失敗的原因很多，已經有大量文獻對其進行了報道，因此種植體材料組成是否與種植體失敗有關還具有爭論。

3.1 細胞毒性實驗

研究生物材料的細胞毒性及對成骨細胞形態、黏附能力的影響是檢測生物材料相容性的重要指標[7-8]。細胞培養技術作為一種快速，簡便，重復性好的方法，廣泛應用于生物安全性評價試驗中，目前很多方法應用于檢測細胞毒性，其中CCK-8法可用于簡便而準確的細胞增殖和毒性分析[9]。因CCK-8法具有簡單易操作靈敏度高等優點，本實驗采用此法對3 種金屬的細胞毒性進行評價。 骨肉瘤細胞系MG-63被廣泛應用于醫學材料以及藥物研究中[10-11]。本實驗中選擇了人成骨細胞系MG-63作為實驗對象。本實驗制作3 種金屬的浸提液，按照100%、50%的濃度進行細胞培養，同時以添加血清的高糖DMEM細胞培養液作為陰性對照組。各個樣本的細胞相對增殖率可通過公式得出。從檢測結果看，純鈦浸提液組和陰性對照組對細胞的毒性為0 級，兩者之間無統計學差異(Pgt;0.05)，各個樣本的細胞相對增殖率可通過公式得出。從時間點的檢測結果和計算所得的RGR得到純鈦組細胞毒性等級為0 級，隨著時間增長，細胞的相對增殖率升高。不銹鋼組隨時間增長細胞的增殖率增長不明顯，第5天有降低的趨勢，計算所得第5天100%不銹鋼浸提液對細胞毒性等級為2級，表明對細胞有輕微毒性,鈦合金組結果表明隨著時間的增長，細胞增殖率升高，但其相對增殖率結果顯示其細胞毒性為1 級，對細胞無毒，但細胞活性低于純鈦和陰性組，這可能和鈦合金浸提液中析出的Al離子和V離子的濃度有關[12-13]。以上結果說明316L不銹鋼具有輕微的細胞毒性，而純鈦及鈦合金對細胞無毒性，其中純鈦的生物相容性較好。這一結果為臨床選擇支抗種植體的材料提供了參考，應盡量選擇無細胞毒性的材料。

3.2 遺傳毒性實驗

正畸支抗釘的遺傳毒性研究少見報道， Piozzi等[14]將純鈦的微種植體植入大鼠的脛骨內，分別于30、60、180 d取大鼠的腎臟，肝臟，肺臟組織，對其進行組織學分析以及遺傳毒理學研究，得出結論純鈦微種植體不會引起大鼠組織學改變以及DNA的損傷，為Ni-Ti合金、商業純鈦和316L不銹鋼的遺傳毒性通過電子顯微鏡原位末端標記法(EM-ISEL)對不同試樣制備的浸提液引起的外周血淋細胞DNA損傷進行檢測，實驗結果顯示Ni-Ti合金和商業純鈦無遺傳毒性，而316L不銹鋼有遺傳毒性。應用彗星實驗進行遺傳毒性評價具有操作簡便，精確度高可以從分子水平對遺傳毒性進行分析，明顯優于微核試驗，染色體畸變實驗[14]。本實驗通過檢測3 種金屬浸提液對MG-63細胞的DNA損傷來評價其遺傳毒性，從圖中可見過氧化氫陽性組有較為明顯的彗尾，通過比較尾部DNA含量(%tail DNA)與尾相(OTM)與陰性對照組比較[15]，純鈦浸提液組，鈦合金組與陰性對照組相比無明顯差別(Pgt;0.05)，而從實驗數據可以看出，316L不銹鋼浸提液組尾部DNA百分量明顯高于陰性對照組，但低于陽性對照組，說明其對細胞的DNA具有一定的損傷，由此我們可以推斷316L不銹鋼組具有輕微的遺傳毒性。

3.3 急性全身毒性實驗

本實驗根據YY/T0127口腔行業標準對3 種材料進行急性全身毒性評價，采用靜脈注射途徑給藥，陰性對照組及實驗組小鼠均未見死亡及毒性反應，3 種金屬浸提液注射的小鼠其體重前后變化進行比較分析，通過統計學分析注射前后體重無明顯差異(Pgt;0.05)。

對生物材料的生物相容和遺傳毒性的研究與評價，不僅要從整體水平去觀察材料對生物體的影響，從細胞水平去觀察對細胞形態和生長能力的影響，還要深入到分子水平從DNA的改變來評價這種生物材料的生物相容性，本實驗綜合體內體外實驗，通過細胞水平和分子水平觀察，系統的評價了3 種應用于正畸支抗種植體領域的金屬材料的生物安全性，為臨床應用提供了科學依據。

4 結 論

本實驗得出316L不銹鋼具有輕微的細胞毒性及遺傳毒性，而純鈦和鈦合金的生物相容性好，體內體外實驗檢測均無毒，為以后這3 種金屬的臨床應用提供參考。

[1] Aparicio C, Gil FJ, Fonseca C, et al. Corrosion behaviour of commercially pure titanium shot blasted with different materials and sizes of shot particles for dental implant applications[J]. Biomaterials, 2003, 24(2): 263-273.

[2] Latysh V, Krallics G, Alexandrov I, et al. Application of bulk nanostructured materials in medicine[J]. Curr Appl Phys, 2006, 6(2): 262-266.

[3] 劉鎖剛，劉莉.純鈦在細胞培養液中的腐蝕性能研究[J]實用口腔醫學雜志， 2013(5):630-633.

[4] Correa DR, Vicente FB, Donato TA, et al. The effect of the solute on the structure, selected mechanical properties, and biocompatibility of Ti-Zr system alloys for dental applications[J]. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl, 2014, 34: 354-359.

[5] Talha M, Behera CK, Sinha OP. A review on nickel-free nitrogen containing austenitic stainless steels for biomedical applications[J]. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl, 2013, 33(7): 3563-3575.

[6] Amini F, Jafari A, Amini P, et al. Metal ion release from fixed orthodontic appliances-aninvivostudy[J]. Eur J Orthod, 2012, 34(1): 126-130.

[7] Ma Z, Yao M, Liu R, et al. Study on antibacterial activity and cytocompatibility of Ti-6Al-4V-5Cu alloy[J]. Mater Tech, 2015, 30(B2): B80-B85.

[8] Prachar P, Bartakova S, Brezina V, et al. Cytocompatibility of implants coated with titanium nitride and zirconium nitride[J]. Bratisl Lek Listy, 2014, 116(3): 154-156.

[9] Wang J, Zhou J, Long HY, et al. Tribological, anti-corrosive properties and biocompatibility of the micro-and nano-crystalline diamond coated Ti6Al4V[J]. Surf Coat Technol, 2014, 258: 1032-1038.

[10]龐慧芳， 許琮， 蕈華， 等. 新型ZrCuFeAlAg非晶態合金的體外細胞毒性[J]. 生物醫學工程學雜志, 2015, 32(2): 380-386.

[11]Kazek-K?sik A, Krok-Borkowicz M, Pamua E, et al. Electrochemical and biological characterization of coatings formed on Ti-15Mo alloy by plasma electrolytic oxidation[J]. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl: C, 2014, 43: 172-181.

[12]Karahalil B, Kadioglu E, Tuzuner-Oncul AM, et al. Micronucleus assay assessment of possible genotoxic effects in patients treated with titanium alloy endosseous implants or miniplates[J]. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen, 2014, 760: 70-72.

[13]Gomes CC, Moreira LM, Santos VJSV, et al. Assessment of the genetic risks of a metallic alloy used in medical implants[J]. Genet Mol Biol, 2011, 34(1): 116-121.

[14]Piozzi R, Ribeiro DA, Padovan LEM, et al. Genotoxicity and cytotoxicity in multiple organs induced by titanium miniplates in Wistar rats[J]. J Biomed Mater Res A, 2009, 88(2): 342-347.

[15]Singh NP, McCoy MT, Tice RR, et al. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells[J]. Exp Cell Res, 1988, 175(1): 184-191.

(收稿： 2016-09-23 修回： 2016-12-08)

Comparisonofthebiologicalsafetyofthreemetaldentalmaterials

ZHANGQinghua,FANHong.

030012Taiyuan,ShanxiProvincialPeople'sHospital,China

Objective: To evaluate the biological safety of commercial pure Ti(cpTi), Ti alloy Ti6Al4V and stainless steel 316L.MethodsAccording to the GB/T16886.5-2003 and YY/T0127.2-2009 standards, the extraction of the 3 materials was respectively prepared, cck-8 assay was used to test their cytotoxicity，single cell gel electrophoresis was used to test their genotoxicity，andinvivotest was used to test their acute systemic toxicity.ResultsThe cytotoxicity of 100% extractions of 316L, Ti6Al4V and cpTi was graded to 2, 1 and 0, the olive tal moment(OTM) 10.79±0.39, 9.84±1.78 and 0.92±1.43, the percentage of tail DNA (1.22±0.06)%, (0.92±0.43)% and (0.43±0.01)% respectively. No systemic toxicity and no body weight change was observed in the acute systemic toxicity test in mice.ConclusioncpTi has better biologic safety than Ti6Al4V and 316L.

PureTi;Tialloy;Stainlesssteel;Biologicalsafety

030012 太原， 山西省人民醫院

張清華 E-mail: 861828704@qq.com

R783.1

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.02.008