煙草的組織培養與植株再生

梁程　李一鵬

摘要：在MS培養基上，接種煙草無菌苗的葉片，分別放在光照和黑暗條件下誘導愈傷組織，接種于MS分化培養基上，在光照下分化再生植株。結果表明：光照和植物生長調節劑對植物愈傷組織的誘導和植株再生產生影響。

關鍵詞：煙草；愈傷組織；植株再生

一、 實驗目的

1. 掌握植物組織培養的方法和要點。

2. 學習培養基配制方法、步驟及葉片培養環節中，外植體滅菌、接種、培養觀察等技術環節。

3. 了解外植體脫分化及再生過程。

二、 材料與器材

1. 植物材料：煙草葉片。

2. 實驗藥品：MS培養基、蔗糖、瓊脂、升汞、NAA、6-BA、NaOH。

3. 儀器設備：高壓滅菌鍋、光照培養箱、天平、pH計、超經工作臺、酒精燈。

4. 器械及用具：鑷子、手術刀、記號筆等。

5. 玻璃器皿：培養瓶、量筒、容量瓶等。

三、 實驗步驟

（一） MS培養基母液配制

大量元素配成50倍母液，使用時每1L培養基需要從母液中取20mL。配制母液時應做到分別稱量，充分溶解，在混合次序上應最后加入Ca2+，混合時要邊加邊混合。

微量元素配成100倍母液，使用時每配制1L培養基從母液中取10mL，配制時應注意充分溶解后再依次混合。

鐵鹽單獨配制，與其他元素混合易造成沉淀。一般采用螯合鐵，即FeSO4與EDTA鈉鹽的混合物，一般擴大100倍。EDTA鈉鹽須用溫水溶解，然后與FeSO4液混合，在75℃～80℃之間讓其螯合1h。使用螯合鐵的目的是避免沉淀，并使培養基能緩慢不斷地供應Fe2+。有機物質可配成100倍濃縮液，使用時每1L培養基加10mL。（本次實驗采用培養基粉末代替較為方便）

（二） 培養基的配制

取1000mL燒杯，先加入500mL的蒸餾水，然后根據培養基成分及用量，吸取各種母液加入燒杯，稱取蔗糖（一般用量3%）、瓊脂（一般6～8g/L），按需要的濃度加入植物激素，加水至800mL，加熱使瓊脂融化，定容到1000mL，用1NNaOH或HCl調pH至5.8。

（三） 培養基滅菌

將配好的培養基迅速分裝至50mL三角瓶中，用牛皮紙或報紙包扎封口。放入滅菌鍋121℃，滅菌20min。

（四） 外植體取材、消毒及接種

自大田或溫室取材時應選擇無病、無蟲、生長健壯的外植體。對于難消毒的材料，如有茸毛的、粗糙不平的材料等，在消毒前，一般先用自來水沖凈，在70%酒精中浸30s，再加入消毒劑。不同的材料消毒的方式和所需時間不一樣，研究者應根據不同材料確定具體消毒方案。外植體消毒的一般順序為：外植體——自來水多次沖洗——消毒液處理（75%乙醇30s，消毒液xmin）——無菌水沖洗——無菌濾紙吸干——接種。

（五） 無菌操作

操作前把準備好的培養基、待消毒材料、無菌水、無菌燒杯及其他必需玻璃器皿、無菌操作工具、70%酒精等放到超凈工作臺上，然后打開超凈工作臺和紫外燈，讓其運行 30min 后再進行操作，在超凈工作臺上打開燒杯和無菌水瓶蓋，將HgCl2（0.1%）倒入有待消毒材料的燒杯中，10min后取出另一盛有無菌水的燒杯中，無菌水沖洗3～4次，然后將材料取出切割后接種在培養基中，封口，放入培養室培養。

四、 結果分析

根據不同時期的觀察圖片可發現煙草的組織培養與植株再生實驗基本上比較成功，煙草的離體組織經過脫分化形成愈傷組織，經過一段時間的再分化形成不定芽等過程。從不同角度、類型的照片可觀察到該離體組織的再生能力較強，具有細胞全能性。

五、 心得體會

通過這次組培實驗課的機會，我基本上成功地了解開展組培實驗需要的基本條件，整個過程使我自身受益匪淺，同時我也學到了很多實用的東西。從最基礎的稱量藥品到比較復雜的制作培養基、植物接種等等，都在漸漸地學習著。雖然由于時間的緣故，我學到只是組培最基本的過程，但我希望在以后可以有機會學到更多關于植物組織培養的操作技術。在培養基的配制過程中我們攪拌要注意不能讓瓊脂黏在玻璃杯底部變黑，要不停地攪拌。而且必須使之沸騰才能在移液后使培養基凝固以便于下一步的操作。并且，如果沒有加入這個課程實驗，我可能不會接觸到植物的接種。在接種過程中，個人非常緊張，因為一旦外植體被污染，后續實驗會相繼失敗，但是經歷了一次接種外植體的過程后，我認為只要我們保持冷靜的頭腦再加上具備一定基礎的組培實驗知識就能把這個步驟做好。

在四周的觀察期間，第一次我是懷著忐忑的心情去觀察的，因為這是我自身的第一次組培成果，當看到我的葉片變黃變白了我趕緊請教老師是不是我的葉片被污染了，在老師細心、詳細講解這個現象后我才知道這個是正常的現象，也逐漸安心下來。接下來幾次我都及時記錄拍攝煙草離體組織的生長狀況。總而言之，我認為組培實驗能夠良好地培養學生的動手能力和操作能力，不僅如此，在整個實驗過程中還收獲了不少樂趣，伴隨著煙草離體組織的成長歷程，我也了解并掌握了組培實驗各個過程及相關知識，收獲了很多比如每周堅持不懈觀察的毅力、細致的觀察、精確的實驗操作技術。

六、 注意事項

1. 實驗所使用的器材要嚴格滅菌，注意無菌操作，避免因染菌導致實驗失敗。

2. 配制貯存母液時，要算好各種成分逐次加入，等第一種成分完全溶解后再加入第二種成分，切忌“一鍋煮”。有機物質配好以后要裝入棕色瓶放入電冰箱內保存，其他三種母液可在常溫下保存但最多不能超過一個月。

3. pH值對培養基的硬度有影響，pH過高培養基變硬，pH過低培養基不能凝固，所以要調整好培養基的pH值。

4. 材料脫毒時不要在酒精中停留過長時間，以免材料被殺死。

5. 接種后進行培養時，為確保實驗成功，可以首先進行7～10d的暗培養，然后再進行光照培養。

6. 無菌操作時應注意下面幾個問題：整個操作過程一切用具必須始終保持無菌狀態；無菌操作前必須用肥皂洗手，然后用70%酒精消毒；操作時無菌器皿一旦打開，應盡量避免手再從其上橫過；避免強呼吸，呼吸時應將臉移開超凈臺；每次重新操作都要把工具在火焰上消毒，避免交叉污染。

作者簡介：

梁程，李一鵬，浙江省金華市，浙江師范大學。endprint