替加環素對肺炎克雷伯菌的防耐藥突變濃度研究

鐘 雪，陳東科， 許宏濤， 馮婉玉

替加環素對肺炎克雷伯菌的防耐藥突變濃度研究

鐘 雪1，陳東科2， 許宏濤2， 馮婉玉1

目的考察替加環素對肺炎克雷伯菌的潛在耐藥性。方法測定替加環素對于藥敏背景不同的肺炎克雷伯菌防突變濃度（MPC）和最低抑菌濃度（MIC）。比較MIC與MPC之間的相關性，考察是否能用MIC推測MPC值。結合MPC和防耐藥突變窗（MSW）與替加環素藥動學參數評估替加環素單藥治療對于肺炎克雷伯菌的潛在耐藥性。結果碳青霉烯類耐藥、喹諾酮類耐藥組肺炎克雷伯菌對替加環素的MPC較碳青霉烯類敏感、喹諾酮類敏感組高出8倍。替加環素對于肺炎克雷伯菌的MPC范圍在4～512 mg/L，MPC90為64 mg/L，遠高于替加環素血藥濃度。結論替加環素長期單藥治療對于肺炎克雷伯菌的潛在耐藥率較高，不宜單獨使用，提示臨床應加強監測替加環素菌株敏感性及替加環素療效。

替加環素； 肺炎克雷伯菌； 防耐藥突變濃度

近年來耐藥肺炎克雷伯菌的檢出率逐年增高，產ESBL和AmpC酶及碳青霉烯酶（KPC-2酶）肺炎克雷伯菌的抗生素選擇已成為抗感染治療面臨的嚴峻挑戰。替加環素作為新型甘氨酰環素類抗菌藥物在臨床抗多藥耐藥菌感染的治療中發揮了重要作用。但是近年來全世界范圍內陸續檢出對替加環素耐藥的菌株，國外文獻多個案例報道顯示長期單藥治療是產生替加環素耐藥的高危因素[1-11]。自2007年以來陸續有文獻報道在使用替加環素治療鮑曼不動桿菌、大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌感染過程中產生耐藥[1，8-9，12]，究其原因可能與替加環素相對較高的防耐藥突變濃度（mutant prevention concentration，MPC）有關。Zhao等[13]首先提出了MPC和細菌突變選擇窗（mutant selection window， MSW）理論。優選藥物濃度既高于MIC，又高于MPC 的藥物才能達到既能殺滅細菌，又能防止細菌耐藥的治療效果。但當某種抗菌藥物對某類細菌的MPC過高時，藥物濃度落入MSW時間越長，越易引起耐藥突變株選擇性富集擴增。例如Cui等[14]研究替加環素對于鮑曼不動桿菌的MPC，從而評估替加環素是否易對鮑曼不動桿菌存在潛在耐藥性，他們得到結論為：替加環素對鮑曼不動桿菌MSW較寬，從而使替加環素濃度落在MSW時間長，耐藥突變株很易選擇性富集擴增，最終導致鮑曼不動桿菌對替加環素耐藥。但是每種抗菌藥物對不同的致病菌其MSW都是不同的。替加環素針對肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌的MPC尚未見報到，有待進一步研究考察替加環素對其他種屬細菌的潛在耐藥性。

1 材料與方法

1.1 菌株及試劑來源

收集北京醫院臨床分離的肺炎克雷伯菌共91 株。大腸埃希菌 ATCC 25922，金黃色葡萄球菌 ATCC 29213，肺炎克雷伯菌 ATCC BAA-2146作為藥物敏感性試驗的質控菌株。MH培養基、MH肉湯培養基（OXOID公司），替加環素（輝瑞制藥有限公司），亞胺培南、美羅培南、厄他培南、環丙沙星、左氧氟沙星（均產自中國藥品生物制品檢定所）。E試驗條（法國生物梅里埃公司）。

1.2 肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類、喹諾酮類和替加環素的藥敏試驗

藥敏試驗采用標準瓊脂平皿二倍稀釋法[15]，用倍比稀釋法配制環丙沙星、左氧氟沙星、美羅培南、亞胺培南、厄他培南和替加環素平皿。使用多點接種儀將細菌接種于各濃度的含藥MH瓊脂培養平皿上，將所有接種菌液的含藥MH瓊脂平皿置于35 ℃孵育16～24 h后觀察結果，定義瓊脂平皿上無菌生長的MIC值。替加環素藥敏試驗中質控菌株質控范圍為金黃色葡萄球菌ATCC 29213，0.03～0.25 mg/L；大腸埃希菌ATCC 25922，0.03～0.25 mg/L；參考美國FDA的MIC折點來判斷替加環素的結果，替加環素敏感（S）：≤2 mg/L，中介（I）：4 mg/L，耐藥（R）：≥8 mg/L[15]。根據菌株對碳青霉烯類和喹諾酮類藥物的敏感性不同，將細菌分為4組，分別記錄4組中菌株對替加環素的MIC。其中顯示對替加環素耐藥的菌株采用微量肉湯稀釋法及E試驗法[15]再次確認耐藥性。

1.3 替加環素對肺炎克雷伯菌的MPC測定

在報道過的文獻基礎上加以改良瓊脂平皿稀釋方法測定4組耐藥背景不同肺炎克雷伯菌對替加環素的MPC[16]。根據測定替加環素對各菌株的MIC值大小，將相同或相近MIC值的菌株分組，以各菌株的MIC為基準，倍比遞增替加環素的藥物濃度，制備7個濃度梯度的含藥瓊脂平皿。將終濃度為3×1010cfu/mL的菌液各取0.1 mL分別涂布到一系列含不同濃度替加環素的培養皿上，每個藥物濃度用4個平皿，使每個藥物濃度培養平皿的細菌接種總量為1.2×1010cfu/mL。孵育觀察結果：將所有涂布菌液的培養平皿放于35 ℃溫室孵育，分別于24 h、48 h、72 h后觀察各培養平皿中肺炎克雷伯菌的生長情況，孵育72 h后仍無細菌生長的最小濃度即為暫定的防變異濃度（provisional MPC，MPCpr）， 再以MPCpr為基準，線性增減20%藥物濃度配制含藥瓊脂平皿，重復上述4步操作，以72 h后不出現細菌生長的最低藥物濃度為MPC。MPC值被定義為能完全抑制肺炎克雷伯菌在平皿上生長的最低濃度。從最接近MPC濃度的含藥平皿上篩選單克隆菌株，接種于不含藥平皿上，傳代2次后再接種于原篩選濃度的含藥培養平皿上，若菌株仍能生長則為耐藥突變株。

1.4 MIC與MPC相關性分析

使用SPSS18.0軟件計算測定的MIC與MPC值之間的相關性。分組比較不同耐藥背景下菌株MIC值和MPC值的區別。從而判斷能否由MIC值推測MPC值。

2 結果

2.1 肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類和喹諾酮類的敏感性試驗

根據6種抗菌藥物對91株肺炎克雷伯菌的MIC值大小，判斷細菌對碳青霉烯類藥物和喹諾酮類藥物的敏感性，當細菌對3種碳青霉烯類藥物中的某1種耐藥時則判斷該細菌為碳青霉烯類耐藥菌；當細菌對2種喹諾酮類藥物中的1種耐藥時則判斷該細菌為喹諾酮類耐藥菌。根據對兩大類藥物的耐藥情況將菌株分為4組，分別為：①碳青霉烯類耐藥，喹諾酮類耐藥的肺炎克雷伯菌32株；②碳青霉烯類耐藥，喹諾酮類敏感的肺炎克雷伯菌8株；③碳青霉烯類敏感，喹諾酮類耐藥的肺炎克雷伯菌22株；④碳青霉烯類敏感，喹諾酮類敏感的肺炎克雷伯菌29株。同時將91株細菌根據對替加環素的敏感性不同分為替加環素耐藥和敏感2組。以8 mg/L為替加環素的耐藥折點，共獲得對替加環素耐藥的肺炎克雷伯菌13株，耐藥率為14.3%（13/91）。

2.2 替加環素對肺炎克雷伯菌的 MIC和MPC結果

替加環素對91株肺炎克雷伯菌的MIC 和MPC值分布情況見圖1，可以看出替加環素對肺炎克雷伯菌的MIC范圍為0.25～32 mg/L，多數集中在1 mg/L；MPC范圍為4～512 mg/L，多數集中在16 mg/L。各組不同耐藥背景菌株MIC90、MPC90和MIC、MPC范圍見表1。替加環素對91株肺炎克雷伯菌的MPC高于敏感折點（2 mg/L）2～256倍，見表2。其中替加環素耐藥組的細菌MPC90高于敏感組8倍。碳青霉烯類和喹諾酮類雙耐藥組MPC90值高于碳青霉烯類和喹諾酮類雙敏感組8倍。然而，碳青霉烯類耐藥和喹諾酮類敏感組與碳青霉烯類敏感和喹諾酮類耐藥組之間MPC90值無明顯差別。

圖1 最低抑菌濃度和防耐藥突變濃度的分布Figure 1 Distribution of minimum inhibitory concentrations and mutant prevention concentrations of tigecycline against K. pneumoniae

表1 比較4種不同耐藥背景的肺炎克雷伯菌突變前后的最低抑菌濃度和防耐藥突變濃度Table 1 Minimum inhibitory concentrations before and after mutation and mutant prevention concentrations of tigecycline against K.pneumoniae isolates with four different resistance profiles（mg/L）

2.3 MIC與MPC相關性分析

表2中比較了不同MIC情況下MPC值的大小分布，由此可以看出當菌株間MIC 值相同時，MPC值分布并不相同。如MIC為2 mg/L的肺炎克雷伯菌有18株，然而其MPC值分別為4 mg/L（2株），8 mg/L（3株），16 mg/L（8株），32 mg/L（3株），64 mg/L（1株），128 mg/L（1株），共跨越6個2倍稀釋數。使用SPSS計算MIC和MPC相關性，得到91株肺炎克雷伯菌（r2=0.53），13株替加環素耐藥的肺炎克雷伯菌（r2=0.32），78株替加環素敏感的肺炎克雷伯菌 （r2=0.29）。

表2 替加環素對91株臨床分離的肺炎克雷伯菌的最低抑菌濃度和防耐藥突變濃度分布Table 2 The distribution of minimum inhibitory concentration and mutant prevention concentration of tigecycline for 91 clinical isolates of K. pneumoniae

3 討論

MPC是防止細菌耐藥突變株選擇性富集擴增所需的最低抗菌藥物濃度。MIC與MPC間的濃度范圍定義為MSW，藥物落入MSW內時，耐藥突變株可被選擇性富集擴增，MPC值越高或MSW越寬，細菌耐藥突變株越容易選擇性富集擴增。每種抗菌藥物對不同的致病菌其MPC均不同，本研究通過測定替加環素對肺炎克雷伯菌的MPC，并且將MPC值與替加環素的Cmax值比較，從而評估替加環素單藥治療條件下的潛在耐藥性。通過91株肺炎克雷伯菌進行MIC和MPC測定，肺炎克雷伯菌對替加環素的耐藥率已達14.3%，替加環素僅上市數年時間，耐藥菌株已逐漸被檢出，值得臨床關注。通過對其潛在耐藥性的研究，從而根據藥物特點制定合理的給藥方案，可達到保證藥物的使用壽命，延緩耐藥進展。

因為MPC值的測定方法相對比較復雜，我們試圖找到MIC值與MPC值的關聯性，從而通過測定MIC值來推算MPC值的大小。通過對替加環素MIC和MPC 相關性的分析，本研究的數據顯示兩者相關性較差，這與之前報道是一致的[17]。說明不能簡單通過MIC值來推測MPC值的大小。

此外，體外試驗的MPC值可與體內試驗的藥動學參數Cmax進行比較，評估替加環素對于肺炎克雷伯菌的潛在耐藥性。當MPC值大于Cmax說明替加環素對肺炎克雷伯菌的潛在耐藥性大；當MPC值小于Cmax則相反。Conte等[18]的研究顯示每12小時靜脈注射替加環素50 mg后，其在血液中的濃度和細胞內液中的濃度分別為（0.38±0.06 ）mg/L和（15.2±7.6）mg/L。這是由于替加環素在組織中分布濃度較高，其血漿分布容積7～10 L/ kg，在骨組織、脾組織、腎組織中濃度為血漿中8倍，而在皮膚組織及肺組織中濃度為血漿中的3倍。本研究數據顯示碳青霉烯類耐藥和喹諾酮類耐藥組替加環素對肺炎克雷伯菌的MPC90值為128 mg/ L，碳青霉烯類敏感和喹諾酮類敏感組替加環素對肺炎克雷伯菌的MPC90值為32 mg/L。而已發表的[18-20]有關替加環素不同給藥劑量下體液或各組織中藥物濃度顯示替加環素說明書中推薦的常規劑量 （首劑100 mg，后每12 小時給藥50 mg），給藥達穩態后，血漿中替加環素的Cmax僅有（0.38±0.06） mg/L，在肺泡細胞內達最大濃度時也僅有（15.2±7.6） mg/L。替加環素對肺炎克雷伯菌的MPC值遠高于其在血液中及肺組織中的藥物濃度。說明肺炎克雷伯菌對替加環素的潛在耐藥性很大，因此，在推薦的劑量下，替加環素的濃度很容易落在MSW內，很可能導致耐藥突變株的富集擴增。提示目前臨床使用的替加環素劑量在長期使用過程中會導致細菌產生耐藥突變。

但隨著給藥劑量的增加，在某些部位替加環素的最大濃度可超過MPC值，說明不能單憑血藥濃度來推測藥物在感染部位的濃度，這是由替加環素獨特的藥動學特征決定的，因為組織藥物濃度高，用血藥濃度反映實際感染部位的藥物濃度不適宜。也可以說感染部位的濃度比血藥濃度能給臨床提供更多的信息參考。加大給藥劑量后在感染部位實際藥物濃度可能超過健康受試者中得到的數據。本研究在某種程度上證明對于醫院獲得性肺炎（HAP）、呼吸機相關性肺炎（VAP），替加環素現有說明書中的給藥劑量不足，需要增加給藥劑量。

同時對于MPC值較高，MSW窗較寬的藥物，除了增加藥物劑量外，聯合用藥也不失為一種有效手段。不同作用部位的藥物聯合使用可以提供一種關閉MSW的途徑，即使聯合的藥物各自都具有較高的MPC值。聯合治療的關鍵是選擇藥動圖完全同步的兩種藥物聯合，這樣既能達到治療的目的，又不至于出現耐藥突變選擇。適宜與替加環素聯合的藥物有待進一步研究考察。

本研究有一定的不足，首先收集的菌株來源單一，增加研究結果的偏倚，其次Choi等[21]發現外排泵的上調與替加環素的耐藥相關，我們下一步計劃針對外排泵進行深入研究。

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Research on the mutant prevention concentration of tigecycline for Klebsiella pneumoniae

ZHONG Xue, CHEN Dongke, XU Hongtao, FENG Wanyu.
（Department of Pharmacy, Peking University People's Hospital, Beijing100044, China）

ObjectiveTo investigate the potential tigecycline resistance ofKlebsiella pneumoniaeduring treatment.MethodsThe minimum inhibitory concentrations (MICs) and the mutant prevention concentrations (MPCs) of tigecycline were determined forK. pneumoniaeisolates with four different resistant profiles. Correlations between MICs and MPCs were analyzed.We combined with the pharmacokinetic parameters of tigecycline to estimate the potential of emerging resistance to tigecycline monotherapy inK. pneumoniae.ResultsThe MPCs of tigecycline for the carbapenem- and fluoroquinolone-resistant isolates were found to be 8-fold higher than those for carbapenem- and quinolones-susceptible isolates. Our data showed that the MPCs range and MPC90values of tigecycline were 4-512 mg/L and 64 mg/L, respectively, which were much higher than the therapeutic concentrations of tigecycline in serum and tissues. Conclusions Long-term tigecycline monotherapy may predispose the emergence of resistance inK. pneumoniae, which is not recommended. It is desirable to carry out ongoing monitoring ofK. pneumoniaesusceptibility and tigecycline treatment effect.

tigecycline;Klebsiella pneumoniae; mutant prevention concentration

R978.1

A

1009-7708 ( 2017 ) 06-0643-05

10.16718/j.1009-7708.2017.06.006

1. 北京大學人民醫院藥劑科，北京 100044；2. 北京醫院檢驗科。

鐘雪（1988—），女，博士研究生，主管藥師，主要從事抗感染與慢病管理。

馮婉玉，E-mail：renminyaojike@sina.com。

2017-04-26 修回日期：2017-05-25