高敏感度酶聯免疫吸附測定法檢測分泌蛋白MPB64對于活動性肺結核診斷的價值

趙冰 侯萍 黃靜 賀文從 歐喜超 劉東鑫 趙雁林

·論著

高敏感度酶聯免疫吸附測定法檢測分泌蛋白
MPB64對于活動性肺結核診斷的價值

趙冰 侯萍 黃靜 賀文從 歐喜超 劉東鑫 趙雁林

目的評價以結核分枝桿菌(MTB)分泌蛋白MPB64為檢測抗原的高敏感度酶聯免疫吸附測定法(high sensitivityenzyme-linked immunosorbent assay，HI-ELISA)用于檢測痰液中MTB的價值。方法選取97份儲存的疑似肺結核患者的痰標本，分別進行BACTEC MGIT 960液體培養(簡稱“MGIT 960培養”)、MTB/利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測系統(Gene Xpert MTB/RIF，簡稱“Xpert檢測”)和HI-ELISA檢測，通過與MGIT 960培養比較來評價HI-ELISA的診斷效能。結果本研究97份痰標本中，MGIT 960培養、HI-ELISA檢測MTB的陽性率分別為36.08%(35/97)、32.99%(32/97)；與MGIT 960培養比較，HI-ELISA的檢測敏感度、特異度、總體符合率分別為88.57%(31/35)、98.39%(61/62)、94.85%(92/97)。在Xpert檢測陽性的66份痰標本中，MGIT 960培養、HI-ELISA檢測MTB的陽性率分別為51.51%(34/66)、48.48%(32/66)；與MGIT 960培養相比，HI-ELISA 的檢測敏感度、特異度、總體符合率分別為91.18%(31/34)、96.88%(31/32)、93.93%(62/66)。Xpert檢測MTB為陰性的31份痰標本中，僅有1份標本的MGIT 960培養陽性而HI-ELISA未能檢測到MTB，其他30份標本檢測結果全部相符，符合率為96.77%(30/31)。結論HI-ELISA可以特異性檢測MTB活菌，對活動性肺結核的診斷及治療評價有很高的應用價值。

分枝桿菌，結核； 分泌蛋白，MPB64； 酶聯免疫吸附測定； 敏感性與特異性； 診斷

結核病(tuberculosis, TB)是一種嚴重危害人類健康的呼吸道傳染性疾病。據世界衛生組織報道僅2015年全球就有1040萬例新發肺結核患者，180萬例因肺結核死亡[1]。結核病的發病率一直呈現上升態勢，已成為一個嚴重的全球性公共衛生問題。快速而準確地檢測患者體內的結核分枝桿菌(MTB)，對于結核病的防控、降低肺結核的發病率和死亡率有著重大意義。

目前，臨床診斷結核病主要依靠痰涂片、抗酸染色鏡檢及液體培養的方法，而上述方法存在敏感度低或耗時長等缺陷，不利于結核病的快速診斷和治療[2-4]。MTB分泌蛋白MPB64是結核分枝桿菌復合群中致病菌(結核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌)所分泌的特異性蛋白，能夠用來區分結核分枝桿菌復合群和非結核分枝桿菌[5]。以MPB64為檢測抗原的高敏感度酶聯免疫吸附測定法(high sensitivityenzyme-linked immunosorbent assay，HI-ELISA)是由TAUNS公司(日本)開發，無需培養，通過酶循環反應來積累大量的被檢測物質硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 (thio-nicotinamide adenine dinucleotide，Thio-NADH)，最終可以高效檢測結核分枝桿菌復合群，診斷結核感染，對結核病的快速診斷具有一定的意義。本研究通過對國家參比實驗室儲存的97份疑似肺結核患者痰標本進行BACTEC MGIT 960液體培養(簡稱“MGIT 960培養”)、MTB/利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測系統(GeneXpert MTB/RIF，簡稱“Xpert檢測”)和HI-ELISA實驗，來評價HI-ELISA方法診斷活動性肺結核的效能。

材料和方法

一、研究材料

1．標本來源：97份儲存痰標本來自2015年4月在首都醫科大學附屬北京胸科醫院就診的部分疑似肺結核患者，且所有患者均簽署知情同意書。

2. 試劑：用于痰液處理的NaOH和枸櫞酸鈉均購自國藥集團化學試劑有限公司，N-乙酸-L-半胱氨酸(N-acetyl L-cysteine，NALC)購自美國Sigma公司；Xpert檢測試劑盒購自美國Cepheid公司；HI-ELISA試劑盒由日本TAUNS公司贈送。

3.引物：用于菌種鑒定的正向引物5′-GGCCTAACCCTCGGGAGGGAG-3′和反向引物5′-CCCGAGGCATATCGCAGCCTC-3′由北京擎科生物科技公司合成。

二、研究方法

將儲存的所有痰標本在室溫下放置至充分融化后取3 ml痰標本，然后平均分為3份，進行以下3種檢測。

1. MGIT 960培養檢測：MGIT 960培養操作按《結核病診斷實驗室檢驗規程》[6]進行。將標本經過NALC-4%NaOH處理后，靜置15 min，然后加入0.067 mol/L pH 6.8的磷酸鹽緩沖液(PBS)行3000×g低溫離心15 min，棄上清。最后將所得菌懸液加入到BACTEC MGIT 960培養管中進行培養，孵育42 d，實時監測并讀取結果。

2. Xpert檢測：具體實驗操作按照《現代結核病診斷技術》[7]進行。將Xpert試劑盒配套的處理液加入含有標本的離心管中，震蕩后靜置15 min，將處理后樣品由加樣孔緩慢加入到反應盒內。然后上機，反應2 h后讀取結果。

3.HI-ELISA檢測：具體實驗操作按照HI-ELISA試劑盒說明書進行，檢測實驗的操作程序見圖1。

4.菌種鑒定：采用16S～23S rDNA間隔區序列分析來鑒定菌株是否為MTB[8]。將MGIT 960培養陽性的菌株離心收集，100 ℃加熱20 min后提取DNA，以提取的細菌DNA作為模板，按照如下配制50 μl反應體系：5 μl 10×PCR緩沖液、200 μmol dNTP、上下游引物(0.2 μmol)各1 μl，1 U HotStarTaq DNA聚合酶(Qiagen)，適量模板DNA，去離子水補齊反應體系。將配置好的體系置于PCR儀，擴增條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，58 ℃復性1 min，72 ℃延伸2 min，35個循環；最后72 ℃延伸10 min。擴增產物送上海生工生物技術有限公司測序，測序結果與美國國立生物技術信息中心(NCBI)中的序列進行比對，進行菌種鑒定。

三、結果判定

1. MGIT 960培養結果判定：判斷標準參考《結核病實驗室檢驗規程》[9]。根據儀器報告結果及菌種鑒定結果來判定。當儀器報告有陽性結果并且菌種鑒定為MTB，則該標本為陽性。當第42 天培養結果儀器報告培養管為陰性結果或報告為陽性結果而菌種鑒定不是MTB時，則該份標本為陰性。

圖1 HI-ELISA操作程序

2. Xpert檢測結果判定：判斷標準參照Xpert MTB/RIF試劑盒說明書[10]。根據儀器報告結果，當結果顯示為MTB檢出(檢出量高、中、低、極低均視為檢出)，則認為該份標本為陽性；當結果顯示為MTB未檢出，則該份標本為陰性。

3. HI-ELISA結果判定：判斷標準參照HI-ELISA試劑盒說明書。與空白對照相比，待測樣本與空白對照吸光度的差≥0.05A(吸光度值)，即為陽性，否則為陰性。

四、統計學分析

采用SPSS 18.0軟件對結果數據進行統計學處理，采用四格表的形式計算敏感度、特異度和符合率。經配對卡方檢驗(McNemar test)，比較HI-ELISA與MGIT 960培養(金標準)MTB陽性檢出率差異。采用Excel 2010繪制Venn Diagram(韋恩圖)。敏感度=真陽性數/(真陽性數+假陰性數)×100%；特異度=真陰性數/(真陰性數+假陽性數)×100%；陽性預測值=真陽性數/(真陽性數+假陽性數)×100%；陰性預測值=真陰性數/(真陰性數+假陰性數)×100%；陽性似然比=敏感度/(1-特異度)；陰性似然比=(1-敏感度)/特異度；符合率=(真陽性數+真陰性數)/所有檢測患者例數。

結 果

1.MGIT 960培養及菌種鑒定：97份痰標本經MGIT 960培養，有36份(37.11%)標本陽性，將培養陽性菌株提取核酸后進行16S～23S rDNA間隔區序列分析；除1株為非結核分枝桿菌(NTM)外，其余35株為MTB，陽性檢出率為36.08%(35/97)。

2.HI-ELISA的檢測結果：97份痰標本經HI-ELISA 檢測，有32份標本為陽性，陽性率為32.99%(32/97)，65份標本為陰性。HI-ELISA和MGIT 960培養(金標準)檢測MTB的陽性檢出率差異無統計學意義(χ2=0.80，P=0.375)。與MGIT 960培養結果相比，HI-ELISA的敏感度為88.57%(31/35)，特異度為98.39%(61/62)，符合率達94.85%(92/97)(表1)。

3.Xpert檢測結果：經Xpert檢測，97份標本中有66份標本MTB檢測結果為陽性，根據Xpert結果，檢出含有MTB的痰標本66份，但僅有34份標本培養陽性，陽性檢出率為51.51%(34/66)。在66份陽性標本中，經HI-ELISA檢測有32份陽性，陽性檢出率為48.48%(32/66)，HI-ELISA和MGIT 960培養(金標準)檢測MTB的陽性檢出率差異未見統計學意義(χ2=0.25，P=0.625)；與MGIT 960培養相比較，HI-ELISA的敏感度是91.18%(31/34)，特異度是96.88%(31/32)，符合率達到93.93%(62/66)(表2)。Xpert未檢出MTB的31份標本中，僅有1份標本MGIT 960培養陽性而HI-ELISA未能檢出MTB，其他30份標本檢測結果全部相符，符合率高達96.77%(30/31)(表3)。在GeneXpert檢測陰性的31份痰標本中，由于四格表2項結果為0，敏感度、特異度結果不可信。

4.Xpert和HI-ELISA檢測結果均為陽性的31例樣本的檢測情況：韋恩圖比較直觀地顯示出Xpert和HI-ELISA共同檢測的31例陽性樣本中，MGIT 960培養也是陽性，詳見圖2。

討 論

自1976年Naussau建立了以ELISA方法檢測結核病患者血清中抗結核分枝桿菌抗體的方法以來[11]，ELISA方法在診斷結核病方面得到了越來越多的應用，但是目前諸如結核分枝桿菌抗體快速免疫色譜檢測法(rapid immunochromatographic assay of TB，ICT-TB)，以及常規ELISA等方法大多是血清學檢測，不能直接檢測痰液中MTB抗原，且敏感度

表1 HI-ELISA檢測97份痰標本的結果

注敏感度=真陽性數/(真陽性數+假陰性數)×100%，即a/(a+c)×100%；特異度=真陰性數/(真陰性數+假陽性數)×100%，即d/(b+d)×100%；符合率=(真陽性數+真陰性數)/(真陽性數+真陰性數+假陽性數+假陰性數)，即(a+d)/(a+b+c+d)；陽性預測值=真陽性數/(真陽性數+假陽性數)×100%，即a/(a+b)×100%；陰性預測值=真陰性數/(真陰性數+假陰性數)×100%，即d/(c+d)×100%；陽性似然比=敏感度/(1-特異度)；陰性似然比=(1-敏感度)/特異度

表2 66例Xpert檢測陽性標本的HI-ELISA與MGIT 960培養的檢測結果

注敏感度=真陽性數/(真陽性數+假陰性數)×100%，即a/(a+c)×100%；特異度=真陰性數/(真陰性數+假陽性數)×100%，即d/(b+d)×100%；符合率=(真陽性數+真陰性數)/(真陽性數+真陰性數+假陽性數+假陰性數)，即(a+d)/(a+b+c+d)；陽性預測值=真陽性數/(真陽性數+假陽性數)×100%，即a/(a+b)×100%；陰性預測值=真陰性數/(真陰性數+假陰性數)×100%，即d/(c+d)×100%；陽性似然比=敏感度/(1-特異度)；陰性似然比=(1-敏感度)/特異度和特異度均不理想[12]，在臨床檢測中存在一定的局限性。賈文青和劉瑩[13]以及張梅等[14]研究表明，在免疫力低下且并發結核性胸膜炎的患者中結核感染T細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)檢測的敏感度只有79.63%；李偉霞等[15]研究表明，MTB抗體快速免疫色譜檢測法和常規ELISA檢測法的敏感度分別為51.14%和70.45%，由此可見血清學檢測方法的敏感度較低。

表3 HI-ELISA檢測與MGIT 960培養在Xpert檢測陰性結果標本中的符合情況

注符合率=(真陽性數+真陰性數)/(真陽性數+真陰性數+假陽性數+假陰性數)×100%，即 (a+d)/(a+b+c+d)×100%

31a表示67份標本中，有31份標本僅Gene Xpert檢測結果為陽性，而HI-ELISA與MGIT 960培養檢測結果為陰性；1b表示有1份標本GeneXpert和HI-ELISA檢測結果為陽性，MGIT 960培養檢測結果為陰性；3c表示3份標本GeneXpert和MGIT 960培養檢測結果為陽性，而HI-ELISA檢測結果為陰性；31d表示31份標本以上3種檢測方法檢測結果均為陽性；0e表示GeneXpert或MGIT 960培養結果為陽性的標本，其HI-ELISA檢測結果也為陽性；0f表示HI-ELISA或MGIT 960培養檢測結果為陽性的標本，其GeneXpert檢測結果也為陽性；1g表示僅1份標本MGIT 960培養檢測結果為陽性，而GeneXpert和HI-ELISA檢測的結果為陰性圖2 3種檢測方法檢測結果的韋恩圖

MPB64是MTB早期分泌蛋白的主要成分，由Rv1980c基因編碼，含有228個氨基酸，是結核分枝桿菌復合群中結核分枝桿菌、牛分枝桿菌和非洲分枝桿菌特有的分泌蛋白[16-17]。本研究中采用TAUNS公司自主研發的高敏感度ELISA試劑盒，以檢測疑似肺結核患者痰液中MTB分泌的MPB64蛋白為基礎，無需培養，通過高敏感度的酶循環顯色試劑進行顯色反應，根據反應孔中吸光度值來判斷標本中是否存在活的MTB，從而達到快速診斷活動性肺結核的目的。但因HI-ELISA為新研制用于快速診斷結核的試劑盒，并沒有對其進行相應研究和評估的相關文獻可供參考。本研究結果顯示，與MGIT 960培養相比較，HI-ELISA操作簡單、耗時短，對MTB的檢出率差異未見統計學意義(P=0.375)，且檢測MTB的敏感度為88.57%(31/35)，特異度為98.39%(61/62)，與MGIT 960培養的總體符合率為94.85%(92/97)，說明HI-ELISA具有快速準確診斷結核病的效能；且敏感度明顯高于痰涂片(20%～60%)[18]，分析原因一方面可能與痰涂片抗酸染色鏡檢原理和MTB排出規律有關：一般來說，痰液中至少含有5000個細菌/ml才得出陽性結果，同時MTB屬于間歇性排菌，從而導致痰涂片檢測的敏感度低[19]；另一方面可能受周圍環境和操作人員水平的影響，導致痰涂片檢測的敏感度明顯低于HI-ELISA。

Xpert檢測是世界衛生組織推薦的MTB的分子學檢測方法。有大量研究表明，Xpert檢測可以非常準確地高敏感度地檢測出標本中是否存在MTB[20]，但Xpert檢測技術僅能檢測MTB的DNA，不能區分樣本中所含MTB是死菌還是活菌。本研究引入Xpert檢測方法的主要目的是根據Xpert檢測及液體培養結果將樣本分為死菌(Xpert檢測陽性，培養陰性結果)和活菌(Xpert檢測陽性，培養陽性結果)兩類，然后采用HI-ELISA檢測兩類樣本，檢測結果與MGIT 960培養結果比較，意在說明HI-ELISA不僅對于不含MTB的樣本呈現陰性結果，對于含有MTB但為死菌的樣本也會呈現陰性結果，充分體現了HI-ELISA只可以檢測活的MTB的優勢。本研究Xpert檢測出66份痰標本為陽性，可認為這66份標本都含有MTB，但僅有34份標本的MGIT 960培養結果為陽性，提示34份標本含有可培養的活菌。32份標本培養陰性的原因可能一是樣本中含有死菌或者培養管中的一些物質抑制了細菌的生長，但本研究由于所用的BACTEC MGIT 960液體培養管為同一批次，保證了樣本處理和培養條件完全相同，且觀察時間均定為42 d，即使細菌代謝緩慢也足以達到可檢測的水平，可排除抑菌物質的影響；其二是Xpert檢測的下限為131菌落形成單位(CFU)/ml，而MGIT 960培養的檢測下限為10～100 CFU/ml，理論上如果Xpert檢測結果為陽性，則液體培養的檢測結果也必為陽性，由此判定32份陰性標本中MTB為死菌。在這66份標本中HI-ELSIA檢測結果與MGIT 960培養相比，敏感度、特異度、符合率分別為91.18%(31/34)、96.88%(31/32)、93.93%(62/66)，說明HI-ELISA可以有效地區分MTB是死菌還是活菌，可有效評價患者的治療效果。此外有1份痰標本MGIT 960培養陽性但菌種鑒定結果為非結核分枝桿菌，經HI-ELISA檢測結果為陰性；由于本研究中僅分離到1株非結核分枝桿菌菌株，對于確定HI-ELISA檢測是否可以區分非結核分枝桿菌還是MTB，以及是否對非結核分枝桿菌具有診斷效果，還需要更大量含有非結核分枝桿菌的樣本來驗證。

總之，基于檢測分泌型蛋白MPB64和酶循環反應的HI-ELISA是一種敏感度能夠與MGIT 960培養法相媲美的快速診斷活動性肺結核的方法，將HI-ELISA應用于肺結核的臨床檢測，不僅可以對活動性肺結核的診斷有幫助，更對肺結核治療方法及其療效的評價有著重要意義。

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2017-08-02)

(本文編輯：孟莉 薛愛華)

Diagnosticvalueofhigh-sensitivityELISAinactivetuberculosisthroughdetectingthesecretionproteinMPB64

ZHAOBing*,HOUPing,HUANGJing,HEWen-cong,OUXi-chao,LIUDong-xin,ZHAOYan-lin.

*NationalTuberculosisReferenceLaboratory,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China

ZHAOYan-lin,Email:zhaoyanlin@chinatb.org

ObjectiveThe aim of this study was to evaluate the value of high-sensitivity-ELISA test (HI-ELISA) in detectingMycobacteriumtuberculosis(MTB) in sputum, which is based on detecting the secretory protein MPB64.MethodsNinety-seven stored sputum specimens from suspected tuberculosis patients were subjected to cultivation in BACTEC MGIT 960 tubes, Xpert MTB/RIF test and HI-ELISA test, respectively, the results of HI-ELISA test and 960-liquid-culture test were compared to evaluate the diagnostic efficacy of HI-ELISA method.ResultsAmong the 97 sputum specimens collected in this study, the positive rates of detecting MTB of 960-liquid-culture method and HI-ELISA method were 36.08% (35/97) and 32.99% (32/97) respectively. When compared with liquid-culture, the sensitivity of HI-ELISA was 88.57% (31/35), the specificity of HI-ELISA was 98.39% (61/62) and the overall coincidence rate was 94.85% (92/97). Of the 66 positives putum specimens using Xpert MTB/RIF, the positive rate of 960-liquid-culture method and HI-ELISA method in detecting MTB were 51.51% (34/66) and 48.48% (32/66), respectively; furthermore, compared with 960-liquid-culture,the sensitivity of HI-ELISA was 91.18% (31/34), the specificity was 96.88% (31/32) and the coincidence rate was 93.93% (62/66). Among the 31 negative sample stested by Xpert MTB/RIF, MTB was detected in only one sample by 960-liquid-culture method but HI-ELISA method failed to detect it, however, in the other 30 sputum samples, the results of HI-ELISA method were entirely consistent with the results of 960-liquid-culture method and the coincidence rate was 96.77% (30/31).ConclusionHI-ELISA assay was able to detecting viable MTB with high sensitivity and specificity, it was of high evaluate in diagnosis and treatment of active tuberculosis.

Mycobacteriumtuberculosis; Secretory protein, MPB64; Enzyme-linked immunosorbentassay; Sensitivity and specificity; Diagnosis

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.12.010

國家科技重大專項(2014ZX10003002)

102206 北京，中國疾病預防控制中心國家結核病參比實驗室(趙冰、歐喜超、趙雁林)；哈爾濱市結核病防治所檢驗科(侯萍)；新疆生產建設兵團第八師152團醫院(黃靜)；中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所結核室(賀文從、劉東鑫)

趙雁林，Email：zhaoyanlin@chinatb.org

注：趙冰和侯萍對本研究具有同等貢獻，為并列第一作者