實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術(shù)在疑似肺結(jié)核早期診斷中的臨床意義

江萬航 衛(wèi)安娜 龐慧敏 譚守勇

·論著

實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術(shù)在疑似肺結(jié)核
早期診斷中的臨床意義

江萬航 衛(wèi)安娜 龐慧敏 譚守勇

目的探討實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術(shù)(simultaneous amplification and testing，SAT)用于疑似肺結(jié)核早期診斷的臨床意義。方法分析2015年7—12月廣州市胸科醫(yī)院收治的呼吸道疾病患者338例，其中疑似肺結(jié)核患者242例(疑似肺結(jié)核組)，臨床已排除肺結(jié)核的肺部其他疾病患者96例(對照組)。所有患者同時進行了痰SAT檢測、抗酸桿菌涂片、分枝桿菌培養(yǎng)和菌種鑒定等檢查；統(tǒng)計疑似肺結(jié)核患者菌種鑒定結(jié)果，對SAT檢測與結(jié)核分枝桿菌(MTB)培養(yǎng)及菌種鑒定結(jié)果的符合率、SAT檢測診斷疑似肺結(jié)核的敏感度和特異度進行分析。結(jié)果疑似肺結(jié)核組242例患者中痰培養(yǎng)陽性233例，菌種鑒定為MTB感染者222例，非結(jié)核分枝桿菌(NTM)感染者11例；痰培養(yǎng)結(jié)果為陰性的患者9例。對照組患者痰培養(yǎng)結(jié)果均為陰性。菌種鑒定為MTB感染者SAT檢測陽性192例，SAT檢測與菌種鑒定符合率為86.5%(192/222)；菌種鑒定為NTM感染者SAT檢測陽性0例(0/11)，與菌種鑒定符合率為100.0%(11/11)；對照組SAT檢測陽性者2例(2.1%，2/96)，與分枝桿菌培養(yǎng)符合率為97.9%(94/96)。SAT在疑似肺結(jié)核患者診斷中的敏感度為86.5%(192/222)，特異度為97.9%(94/96)。結(jié)論在疑似肺結(jié)核患者中開展SAT檢測對肺結(jié)核早期診斷具有重要臨床意義。

結(jié)核，肺； 核酸擴增技術(shù)； 早期診斷； 分枝桿菌感染, 非典型性； 呼吸道疾病

早期、及時、準(zhǔn)確診斷是肺結(jié)核診治的關(guān)鍵，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術(shù)(simultaneous amplification and testing，SAT)進入了結(jié)核病診斷領(lǐng)域，其具有檢測時間短，敏感度、特異度高的特點，逐漸引起臨床重視。有文獻報道，SAT檢測不僅可快速檢測痰標(biāo)本中的結(jié)核分枝桿菌(MTB)，而且可判斷待檢痰液中MTB是否為活菌[1]，2～3 h即可獲得檢測結(jié)果[2]，在耗時和檢測成本上均低于Xpert MTB/RIF法[3]，且試驗要求較熒光PCR擴增法低[4]，可快速、準(zhǔn)確地對肺結(jié)核做出早期診斷[5]。

本研究回顧性分析2015年7—12月廣州市胸科醫(yī)院收治的痰抗酸桿菌涂片連續(xù)3次陽性的疑似肺結(jié)核患者242例，同時納入臨床已排除肺結(jié)核的肺部其他疾病患者96例，進行了痰SAT檢測、分枝桿菌培養(yǎng)和菌種鑒定等檢查，探討在疑似肺結(jié)核患者中開展SAT檢測對肺結(jié)核早期診斷的臨床意義。

對象和方法

一、研究對象

1.疑似肺結(jié)核組：對2015年7—12月在廣州市胸科醫(yī)院結(jié)核科住院的所有呼吸系統(tǒng)疾病患者進行篩查，符合下列條件的患者進入本研究：痰抗酸桿菌涂片連續(xù)3次陽性，同時完成痰SAT檢測、分枝桿菌培養(yǎng)和菌種鑒定等檢查；剔除檢查資料不完整的患者。入組疑似肺結(jié)核患者242例，其中男158例，女84例；年齡18～70歲，平均(47.5±11.6)歲。肺結(jié)核的臨床診斷依據(jù)文獻[6]。

2.對照組：收集同期廣州市胸科醫(yī)院收治的臨床已排除肺結(jié)核的肺部其他疾病患者96例，其中男55例，女41例，年齡28～68歲，平均(43.3±10.1)歲；包括慢性阻塞性肺疾病58例(60.4%)，肺炎17例(17.7%)，肺癌5例(5.2%)，支氣管擴張9例(9.4%)，肺曲霉菌病5例(5.2%)，塵肺2例(2.1%)。上述患者的診斷均依據(jù)相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[7-8]。

本研究所有患者HIV檢查均為陰性。本研究通過廣州市胸科醫(yī)院倫理委員會的審批。

二、研究方法

標(biāo)本涂片根據(jù)《結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》[9]處理，經(jīng)金胺“O”-羅丹明熒光染色檢測分枝桿菌，應(yīng)用BACTEC MGIT 960 和專用培養(yǎng)基進行分枝桿菌分離培養(yǎng)，采用常規(guī)生化鑒定法和基因芯片法進行菌種鑒定。SAT檢測試劑盒由上海仁度生物科技有限公司提供。

痰標(biāo)本留取：入院后第二天，患者于清晨漱口后，同時留取1次痰SAT檢測標(biāo)本、3次痰抗酸桿菌涂片標(biāo)本、1次痰分枝桿菌培養(yǎng)標(biāo)本，對于培養(yǎng)陽性標(biāo)本進一步行菌種鑒定，陽性報告結(jié)果為MTB生長或非結(jié)核分枝桿菌(NTM)生長。痰涂片及培養(yǎng)操作按《現(xiàn)代結(jié)核病診斷技術(shù)》[10]進行。

菌種鑒定的方法和試劑：對培養(yǎng)陽性的標(biāo)本進行涂片鏡檢，做MPB64分泌蛋白抗原檢測，檢測陽性標(biāo)本加做對硝基苯甲酸(PNB)生長試驗，確認是否為MTB。MPB64分泌蛋白抗原檢測陰性培養(yǎng)物進行晶芯@基因芯片分枝桿菌菌種鑒定[11]。MPB64分泌蛋白抗原檢測試劑盒由杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司提供，晶芯@基因芯片分枝桿菌菌種鑒定試劑盒由北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司提供。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

采用Excel 2007表收集試驗數(shù)據(jù)，使用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%。

結(jié) 果

一、分枝桿菌培養(yǎng)及菌種鑒定結(jié)果

242例疑似肺結(jié)核患者，痰培養(yǎng)陽性233例；其中菌種鑒定結(jié)果為MTB感染者222例，菌種鑒定結(jié)果為NTM感染者11例。痰培養(yǎng)結(jié)果為陰性的患者9例，結(jié)合臨床資料，此9例患者最終確診為涂陽培陰肺結(jié)核患者。對照組患者培養(yǎng)結(jié)果均為陰性。

二、SAT檢測的符合率

疑似肺結(jié)核組以菌種鑒定結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，培養(yǎng)陽性菌種鑒定結(jié)果為MTB感染的222例患者中SAT檢測陽性者192例，SAT檢測結(jié)果與菌種鑒定結(jié)果的符合率為86.5%(192/222)；培養(yǎng)陽性菌種鑒定結(jié)果為NTM感染的11例患者中SAT檢測陽性者0例(0/11)，與菌種鑒定結(jié)果的符合率為100.0%(11/11)；對照組SAT檢測陽性者2例(2.1%，2/96)，均為肺炎患者，與MTB培養(yǎng)的符合率為97.9%(94/96)。

表1 SAT檢測結(jié)果在不同組別患者中與培養(yǎng)及菌種鑒定結(jié)果的比較

注“培養(yǎng)”指痰分枝桿菌培養(yǎng)

三、SAT在疑似肺結(jié)核患者診斷中的意義

SAT對疑似肺結(jié)核患者診斷的敏感度為86.5%(192/222)，特異度為97.9%(94/96)(表1)。

討 論

一、SAT檢測對疑似肺結(jié)核的診斷效率評估

從本研究結(jié)果可以看出，以菌種鑒定結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，非結(jié)核病患者為陰性標(biāo)準(zhǔn)，SAT檢測在疑似肺結(jié)核診斷中的敏感度為86.5%，特異度為97.9%。從檢測時間上看，SAT檢測只需2～3 h就能得到結(jié)果，速度明顯快于培養(yǎng)法[2]，而檢測結(jié)果與培養(yǎng)法一致率達86.5%，說明SAT檢測能夠在較短的時間內(nèi)提供準(zhǔn)確率為86.5%的檢測結(jié)果。本研究9例培養(yǎng)陰性的臨床診斷肺結(jié)核患者的標(biāo)本有2例 SAT檢測為陽性，提示SAT檢測有助于早期快速發(fā)現(xiàn)傳染源、及時診治肺結(jié)核患者，減少結(jié)核病的傳播。

將本研究與蔡杏珊等[11]和黃芳等[12]國內(nèi)同類研究比較，結(jié)果相仿；但崔振玲等[13]研究報道的對于痰涂片陽性的標(biāo)本，SAT檢測對肺結(jié)核的診斷敏感度可達97.6%。本研究222例培養(yǎng)陽性、菌種鑒定為MTB的患者中有30例SAT檢測結(jié)果為陰性，SAT檢測與菌種鑒定的符合率為86.5%，而非100.0%，說明可能產(chǎn)生了假陰性結(jié)果，也可能由于本研究的痰SAT和涂片培養(yǎng)檢測不是同一份痰標(biāo)本，標(biāo)本的異質(zhì)性可能導(dǎo)致不同方法的檢出結(jié)果出現(xiàn)差異。每例患者多份標(biāo)本進行SAT檢測可能會提高陽性檢出率。

崔振玲等[13]研究報道，SAT檢測對臨床確診的肺結(jié)核患者痰標(biāo)本檢出率為54%，高于羅氏培養(yǎng)法(42%)，未發(fā)現(xiàn)假陽性現(xiàn)象；本研究對照組出現(xiàn)2例假陽性，均為肺炎患者。雖然RNA在環(huán)境中極易降解，不容易發(fā)生實驗污染，出現(xiàn)假陽性的概率較低，但本研究中SAT-TB檢查仍有2例假陽性，經(jīng)患者追蹤，此2例肺炎患者經(jīng)抗炎治療后病灶完全吸收，排除肺結(jié)核。提示在實驗室操作環(huán)節(jié)仍有出現(xiàn)標(biāo)本污染的可能，應(yīng)嚴格規(guī)范各項操作，避免人為因素降低其檢驗效能。

將SAT技術(shù)與目前其他分子生物學(xué)診斷方法，如Xpert MTB/RIF進行比較，張青和閆麗萍[14]Meta分析顯示，用Xpert MTB/RIF診斷肺結(jié)核的敏感度為89%，特異度為98%。本研究顯示SAT檢測效能與Xpert MTB/RIF相比，有較高的診斷肺結(jié)核的敏感度和特異度，同時檢查成本較Xpert MTB/RIF更低。

二、SAT檢測在NTM肺病診斷中的應(yīng)用

SAT的檢測周期短，除了和培養(yǎng)法一樣能夠檢測鑒別活菌外，還能區(qū)分MTB與NTM感染。近年來，隨著AIDS的流行，醫(yī)原性感染機會增多，各種免疫抑制劑的使用，人口老齡化等問題，NTM肺病較以前明顯增加，已成為威脅人類健康的重要公共衛(wèi)生問題[15]。單憑涂片法和培養(yǎng)法難以區(qū)分NTM菌株。在無菌種鑒定結(jié)果的情況下，NTM肺病可長期被誤診為結(jié)核病[16]。本研究入組的242例疑似肺結(jié)核患者，痰抗酸桿菌涂片連續(xù)3次陽性并同時進行了痰SAT檢測、MTB培養(yǎng)和菌種鑒定等檢查。菌種鑒定結(jié)果顯示，MTB感染者222例，NTM感染者11例，NTM菌株在疑似肺結(jié)核患者中的檢出率為4.5%(11/242)。劉志輝等[17]報道，1994—2003年10年間廣州市結(jié)核病肺部腫瘤防治所門診患者的NTM分離率在3.51%～10.06%之間，平均分離率為6.28%。羅春明等[18]報道廣州地區(qū)2003—2012年10年間的NTM分離率高達20.00%，年分離率從2003年的12.87%上升至2012年的24.22%。

臨床確診NTM肺病的金標(biāo)準(zhǔn)是分枝桿菌培養(yǎng)和菌種鑒定，耗時長且需要使用不同類型的培養(yǎng)基和培養(yǎng)溫度使細菌獲得最優(yōu)生長[19]，不能滿足臨床早期快速診斷的需要，有一定的局限性。

建議對于痰抗酸桿菌涂片陽性患者，有胸部影像學(xué)檢查結(jié)果支持，考慮診斷為肺結(jié)核前，可行SAT檢測協(xié)助診斷，并行分枝桿菌培養(yǎng)及菌種鑒定。SAT檢測陽性，支持肺結(jié)核的診斷，再開始進行抗結(jié)核治療；SAT檢測陰性，需排除NTM肺病，等待分枝桿菌培養(yǎng)及菌種鑒定結(jié)果。采用此方法，可降低耗時和檢測成本，對于早期避免誤診和漏診具有重要意義。

三、小結(jié)

綜上所述，SAT檢測在2～3 h內(nèi)可以準(zhǔn)確獲得檢測結(jié)果，在臨床簡單易行，在疑似肺結(jié)核患者中開展SAT檢測，對肺結(jié)核早期診斷及減少漏診、誤診具有重要臨床意義。

[1] 中國防癆協(xié)會臨床專業(yè)委員會．結(jié)核病臨床診治進展年度報告(2012年)(第一部分 結(jié)核病臨床診斷)．中國防癆雜志，2013，35(6)：405-426．

[2] 范琳，王鵬，楊妍，等．RNA恒溫擴增實時熒光檢測技術(shù)檢測支氣管肺泡灌洗液對涂陰肺結(jié)核的快速診斷價值. 中國防癆雜志，2015，37(2)：140-144．

[3] 宋世森．恒溫擴增熒光檢測法檢測痰標(biāo)本結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸的應(yīng)用分析．結(jié)核病與肺部健康雜志，2016，5(1)：42-46．

[4] 白廣紅，朱蕾，高漫．7種實驗方法診斷結(jié)核病的臨床應(yīng)用價值．臨床薈萃，2014，29(6)：608-611，720．

[5] 許光輝，趙柳嬋，陳華，等．實時熒光核酸恒溫擴增技術(shù)在肺結(jié)核診斷中的價值分析．臨床肺科雜志，2015，20(8)：1487-1489．

[6] 中華人民共和國衛(wèi)生部疾病預(yù)防控制局，中華人民共和國衛(wèi)生部醫(yī)政司，中國疾病預(yù)防控制中心．中國結(jié)核病防治規(guī)劃實施工作指南(2008年版)．北京：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社，2009：25-27．

[7] 中華醫(yī)學(xué)會．臨床診療指南：呼吸病學(xué)分冊．北京：人民衛(wèi)生出版社，2009．

[8] 中華醫(yī)學(xué)會結(jié)核病學(xué)分會．非結(jié)核分支桿菌病診斷與處理指南．中華結(jié)核和呼吸雜志，2000，23(11)：650-653．

[9] 中國防癆協(xié)會基礎(chǔ)專業(yè)委員會．結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程．北京：中國教育文化出版社，2006：30-96．

[10] 張賀秋，趙雁林．現(xiàn)代結(jié)核病診斷技術(shù)．北京：人民衛(wèi)生出版社，2013：47-66．

[11] 蔡杏珊，馬品云，張院良，等．實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術(shù)在結(jié)核病診斷中的臨床應(yīng)用．中國防癆雜志，2014，36(6)：458-461．

[12] 黃芳，黨麗云，孫惠平，等．三種分子生物學(xué)診斷技術(shù)對結(jié)核病診斷價值的比較．中華結(jié)核和呼吸雜志，2015，38(9)：680-685．

[13] 崔振玲，沙巍，黃曉辰，等．RNA恒溫擴增技術(shù)快速檢測痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌的研究．中華結(jié)核和呼吸雜志，2011，34(12)：894-897．

[14] 張青，閆麗萍．三種核酸擴增方法用于診斷肺結(jié)核的Meta分析．中國防癆雜志，2017，39(1)：57-70．

[15] 中華醫(yī)學(xué)會結(jié)核病學(xué)分會，《中華結(jié)核和呼吸雜志》編輯委員會．非結(jié)核分枝桿菌病診斷與治療專家共識．中華結(jié)核和呼吸雜志，2012，35(8)：572-580．

[16] 肖和平．關(guān)注非結(jié)核分枝桿菌感染的危害性．中華結(jié)核和呼吸雜志，2012，35(8)：563．

[17] 劉志輝，羅春明，蔡杏姍.廣州市舊城區(qū)1994—2003年非結(jié)核分枝桿菌流行狀況分析.中華流行病學(xué)雜志，2005，26(6)：424-427.

[18] 羅春明，鄒桂敏，劉國標(biāo)，等．廣州市2003—2012年非結(jié)核分枝桿菌菌種鑒定結(jié)果分析.結(jié)核病與肺部健康雜志，2014，3(1)：15-20.

[19] 中華醫(yī)學(xué)會結(jié)核病學(xué)分會，非結(jié)核分枝桿菌病實驗室診斷專家共識編寫組．非結(jié)核分枝桿菌病實驗室診斷專家共識．中華結(jié)核和呼吸雜志，2016，39(6)：438-443.

2017-05-10)

(本文編輯：郭萌)

Clinicalsignificanceofusingthesimultaneousamplificationandtestingmethod(SAT)intheearlydiagnosisofsuspectedpulmonarytuberculosis

JIANGWan-hang,WEIAn-na,PANGHui-min,TANShou-yong.

GuangzhouChestHospital,Guangzhou510095,China

TANShou-yong,Email: 13802930679@163.com

ObjectiveTo investigate the clinical significance of using the simultaneous amplification and testing method (SAT) in the early diagnosis of suspected pulmonary tuberculosis.MethodsThree hundred and thirty-eight cases with respiratory disease (including 242 cases with suspected pulmonary tuberculosis and 96 cases with non-tubercular and other lung diseases) admitted in Guangzhou Chest Hospital from July to December 2015 were recruited in the study. Sputum samples were submitted for testing for SAT, smear, culture and strain identification. The number of cases of infection withMycobacteriumtuberculosis, and non-tuberculosis mycobacteria were determined. The coincidence rate of SAT and MTB culture, SAT and strain identification were calculated, and the sensitivity and specificity of SAT in the detection of suspected pulmonary tuberculosis was determined.ResultsOf the 242 cases with suspected pulmonary tuberculosis, 233 cases were sputum culture positive, 222 cases were infected withMycobacteriumtuberculosis, and 11 cases with non-tubercular mycobacteria, 96 cases with non-tubercular and other lung diseases were sputum culture negative. In the MTB group, 192 cases were SAT positive, and the coincidence rate of SAT and strain identification was 86.5% (192/222). In the NTM group, no case (0/11) were SAT positive, and the coincidence rate of SAT and strain identification was 100.0% (11/11). Of the 96 cases with non-tubercular and other lung diseases, 2 cases were SAT positive (2.1%, 2/96), and the coincidence rate of SAT with MTB culture and strain identification was 97.9% (94/96). The sensitivity of SAT in the diagnosis of suspected pulmonary tuberculosis was 86.5% (192/222), and the specificity was 97.9% (94/96).ConclusionThe use of the SAT assay has important clinical significance for the early diagnosis of suspected pulmonary tuberculosis.

Tuberculosis, pulmonary; Nucleic acid amplification techniques; Early diagnosis; Mycobacterium infections, atypical; Respiratory tract diseases

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.12.011

廣州市科技計劃課題(155700012)

510095 廣州市胸科醫(yī)院

譚守勇，Email：tanshouyong@163.com