密蒙花顆粒對亞慢性毒性實驗中SD大鼠血液生化指標的分析

覃艮艷，張又瑋，彭曉芳，王 英，彭 俊，彭清華

（湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410007）

密蒙花顆粒對亞慢性毒性實驗中SD大鼠血液生化指標的分析

覃艮艷，張又瑋，彭曉芳，王 英，彭 俊*，彭清華*

（湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410007）

目的觀察密蒙花顆粒對SD大鼠的亞慢性毒性作用及其血液生化指標變化情況。方法80只SD大鼠隨機分為4組（雌雄各半），即空白對照組及密蒙花顆粒低、中、高劑量組，進行為期3個月的亞慢性毒理實驗，其中3個給藥組分別將密蒙花顆粒23.75 g、45 g、95 g溶于100 mL生理鹽水中，灌胃體積為20 mL/kg，空白對照組予以同等灌胃體積生理鹽水灌胃，觀察各實驗組及對照組血常規、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、肌酐、尿素、總膽固醇、甘油三酯、葡萄糖、血鉀、血鈉、血氯、肌酸激酶等指標變化情況，從而進一步評價密蒙花顆粒對SD大鼠血液系統、肝臟、腎臟、心臟等的毒性作用。結果密蒙花顆粒對SD大鼠血液生化相關指標無不良影響。結論密蒙花顆粒對SD大鼠血液生化指標無明顯慢性毒性反應，可在臨床推廣應用。

密蒙花顆粒；亞慢性毒性實驗；SD大鼠；血液指標；生化指標

密蒙花顆粒是彭清華教授治療干眼癥的臨床組方，由密蒙花、枸杞子等6味中藥組成。前期試驗研究表明[1]：雄激素、黃酮類物質均為雜環多酚類化合物，在化學結構上具有相似性，已證明某些黃酮類化合物具有擬雄激素作用，且黃酮可與細胞雄激素受體（AR）結合，密蒙花顆粒的君藥密蒙花有效部位為黃酮類物質，可以和淚腺細胞中AR結合，產生相應的生物學效應，通過擬雄激素效應的途徑，治療雄激素水平下降所致的干眼癥，臨床具有相當的應用價值。但目前國內外研究尚缺乏本方毒理學的數據資料。本研究團隊在初步明確其口服劑型最大給藥量（MFD）無毒性反應的基礎上進行3個月密蒙花顆粒的亞慢性毒理實驗，以進一步評價其應用的安全性。

1 材料與方法

1.1 材料和實驗動物

密蒙花顆粒：由密蒙花、枸杞子等六味中藥組成，均選擇道地藥材，由湖南中醫藥大學第一附屬醫院提供（生產批號：20160406），由湖南國華制藥有限公司制備。

實驗動物：SPF級SD大鼠80只（合格證編號：43004700024634），雌雄各半，每只體質量 80～100g，均由湖南中醫藥大學實驗動物中心提供，動物飼養于湖南中醫藥大學動物實驗中心SPF級動物房，飼養溫度22～25℃，濕度40%～60%，自然采光，定量添加足量的飼料，動物自由攝食，飲用水瓶供應足量的三級飲用水，動物自由飲用，每日更換飲水瓶及飲用水，所有動物到達本實驗室后均要進行檢疫觀察7 d以上，在此時間內，觀察動物的疾病和死亡指征，任何異常現象均向負責人和臨床獸醫報告，異常動物在實驗動物分組給藥前進行剔除，若在給藥前個別動物出現異常，用健康動物進行替換。

1.2 試驗主要設備與試劑

水合氯醛（上海國藥集團生產），真空采血管、一次性采血針，止血鉗、組織剪、有齒鑷，希森美康XN全自動血液分析流水線（XN9000，日本Sysmex公司），羅氏CCM全自動生化免疫流水線（羅氏cobas 8000，瑞士）。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組 將80只SD大鼠按隨機數字表法隨機分為空白對照組、密蒙花顆粒低劑量組、密蒙花顆粒中劑量組、密蒙花顆粒高劑量組4組，每組20只，雌雄各10只。

1.3.2 試驗方法 空白對照組予以生理鹽水灌胃，灌胃體積為20 mL/kg；實驗組分為密蒙花顆粒低劑量組、密蒙花顆粒中劑量組、密蒙花顆粒高劑量組，分別予以密蒙花顆粒237.5 g/Kg（成人用量53倍）、475 g/Kg（成人用量105倍）、950 g/Kg（成人用量211倍）,溶于100 mL生理鹽水中，灌胃體積為20 mL/kg，每天灌胃1次，連續給藥3個月。在給藥3個月結束后第1天將半數動物麻醉取材送檢。余下動物停藥觀察15 d，觀察時間結束后第1天將剩余動物麻醉取材。(備注：所有動物給藥劑量按“人-動物體表面積等效劑量比值表”折算，折算系數W=0.018，折算公式：W×成人用量（g）/動物體重（kg），其中成人用量參照《中華人民共和國藥典》2015版。)1.3.3 取材 （1）取材時相第1時相：灌胃3個月結束后第1天；第2時相：停藥觀察15 d結束后第1天。（2）取材方法以5%水合氯醛150 mg/kg進行腹腔麻醉，麻醉成功后進行腹主動脈采血，采血成功后立即將血液標本送往湖南中醫藥大學第一附屬醫院醫學檢驗中心進行血常規及血生化相關指標檢測。

1.4 檢測指標

1.4.1 血液學檢查 測定白細胞、紅細胞、血紅蛋白、紅細胞壓積、平均紅細胞體積、平均血紅蛋白濃度、平均血紅蛋白量、RDW-CV、血小板等。

1.4.2 生化指標測定 測定谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、肌酐、尿素、總膽固醇、甘油三酯、葡萄糖、血鉀、血鈉、血氯、肌酸激酶等。1.5 統計學方法

所有數據均采用SPSS 17.0統計軟件進行統計分析。計量資料用“±s”表示，進行正態性檢驗；符合正態分布者，多組計量資料采用單因素方差分析，方差齊者用LSD和SNK法，方差不齊者用Tamhane’s T2或Dunnett’s T3法；不符合正態分布者采用秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 密蒙花顆粒對大鼠血常規的影響

密蒙花顆粒對SD大鼠血常規的影響如表1～2所示，密蒙花顆粒低、中、高劑量組與空白對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。各組用藥后 3個月與停藥觀察15 d后兩個時相比較，各指標差異無統計學意義（P＞0.05）。結果顯示：密蒙花顆粒對SD大鼠血常規相關指標無明顯影響。

2.2 密蒙花顆粒對大鼠血生化相關指標的影響

密蒙花顆粒對SD大鼠血生化指標如表3～4所示，實驗組與空白對照組差異無統計學意義 （P＞0.05）。各組用藥后3個月與停藥觀察15 d兩個時相比較，各指標差異無統計學意義（P＞0.05）。結果顯示：密蒙花顆粒對SD大鼠血生化相關指標無影響。

表1 用藥后3個月大鼠血常規相關指標結果 （±s，n=5）

表1 用藥后3個月大鼠血常規相關指標結果 （±s，n=5）

組別空白對照組低劑量組中劑量組高劑量組F P WBC/×109·L-1 3.93±2.18 3.29±1.73 4.37±2.72 3.64±1.10 0.435 0.729 RBC/×1012·L-1 8.32±0.78 9.01±0.63 9.00±0.92 8.86±0.56 1.35 0.279 HGB/g·L-1 145.5±12.34 147.67±5.50 148.63±13.94 149.00±8.16 0.155 0.925 HCT/%43.78±4.30 46.04±2.80 47.21±4.29 45.29±6.22 0.694 0.564 MCV/fL 52.67±2.24 51.12±2.32 52.54±1.80 53.65±1.78 2.205 0.111 MCHC/g·L-1 332.83±8.38 340.33±8.87 338.50±5.24 336.25±5.55 1.444 0.252 MCH/Pg 17.50±0.56 17.36±0.48 17.76±0.52 17.38±0.31 1.312 0.291 RDW-CV/fL 19.05±2.17 19.56±1.10 19.53±2.81 20.83±1.09 1.195 0.33 PLT/×109·L-1 1035.5±142.03 1044.67±135.11 1098.88±80.99 1062.25±85.78 0.465 0.709

表2 停藥后15 d大鼠血常規相關指標結果 （±s，n=5）

表2 停藥后15 d大鼠血常規相關指標結果 （±s，n=5）

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表3 用藥后3個月大鼠血生化相關指標結果 （±s，n=5）

表3 用藥后3個月大鼠血生化相關指標結果 （±s，n=5）

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表4 停藥后15 d大鼠血生化相關指標結果 （±s，n=5）

表4 停藥后15 d大鼠血生化相關指標結果 （±s，n=5）

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續表4

3 討論

干眼癥是最常見的眼表疾病，為近年眼科的研究重點、熱點及難點。干眼癥發病率極高，2007年國際干眼工作組（DWES）調查顯示：全球平均發病率為14～33%[2]。相關研究發現，我國干眼癥發病率最高可達59.1%[3]，已嚴重影響國民的生活質量，因此，干眼癥的防治問題亟待解決。

干眼癥發病原因復雜，目前西醫的治療方法均不理想，各類西藥存在各自的局限性，療效不滿意，甚至造成許多難以避免的副作用[4-5]，因此，擁有豐富天然藥物資源的中醫藥在干眼癥治療領域擁有廣闊的前景，有發現創新藥物的巨大潛力。干眼癥屬于中醫“白澀癥”“神水將枯”、“干澀昏花癥”范疇，《審視瑤函》謂其“視珠外神水枯澀，而不潤瑩”。本課題組根據多年臨床經驗，以密蒙花為君藥創制密蒙花顆粒，臨床療效確切。前期臨床及實驗研究表明[6-8]，密蒙花總黃酮制劑，能夠有效提高患者和實驗動物的淚液基礎分泌量，維持淚膜穩定性；體外細胞學實驗表明，密蒙花總黃酮可明顯抑制淚腺上皮細胞（LGEC）的局部炎癥反應和細胞凋亡，對TGF-β1、Bcl-2等關鍵細胞因子產生影響。前期臨床及實驗研究說明本方值得臨床推廣[9]，但目前國內外研究尚缺乏關于本方的毒性學數據資料。

課題組通過為期3個月的密蒙花顆粒亞慢性毒性實驗研究發現，同一時相密蒙花顆粒低、中、高劑量組與對照組比較，白細胞（WBC）、紅細胞(RBC)、血紅蛋白（HGB）、紅細胞壓積（HCT）、平均紅細胞體積（MCV）、平均血紅蛋白濃度(MCHC)、平均血紅蛋白量（MCH）、RDW-CV、血小板（PLT）等差異無明顯統計學意義（P＞0.05），說明密蒙花顆粒對SD大鼠血液系統無毒副作用；谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）差異無明顯統計學意義（P＞0.05），說明密蒙花顆粒對SD大鼠肝功能影響不大；肌酐（CREA）、尿素（UREA）比較差異無統計學意義（P＞0.05），說明密蒙花顆粒對SD大鼠腎功能影響不大；肌酸激酶（CK）等差異無統計學意義（P＞0.05）,說明密蒙花顆粒對SD大鼠心功能影響不大；血鉀（K）、血鈉（Na）、血氯（Cl）等差異無統計學意義（P＞0.05），說明密蒙花顆粒對SD大鼠電解質無影響；總膽固醇（CHOL）、甘油三酯（TG）、葡萄糖（GLU）等差異無統計學意義（P＞0.05），說明密蒙花顆粒對SD大鼠血脂、血糖等代謝指標無影響。

不同時相密蒙花顆粒低、中、高劑量組與對照組比較，白細胞（WBC）、紅細胞(RBC)、血紅蛋白（HGB）、紅細胞壓積（HCT）、平均血紅蛋白量（MCH）、RDWCV、血小板（PLT）、谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、肌酐（CREA）、尿素（UREA）、肌酸激酶（CK）、血鉀（K）、血鈉（Na）、血氯（Cl）、總膽固醇（CHOL）、甘油三酯（TG）、葡萄糖（GLU）等差異無統計學意義（P＞0.05），說明密蒙花顆粒對SD大鼠血液系統、肝腎功能、心功能、電解質、血脂、血糖等無影響或影響甚微。

綜上所述，密蒙花顆粒對SD大鼠血常規和血生化相關指標影響極小，均未出現明顯毒性反應，提示其不良反應小，安全度高，可在臨床推廣應用。

[1]彭清華,姚小磊,吳權龍,等.密蒙花提取物滴眼劑對實驗性干眼癥大鼠淚腺組織雄激素受體數量的影響[J].中國中西醫結合雜志,2012,32（1）:72-75,114.

[2]Lemp MA.The definition and classification of dry eye disease:report of the Definition and Classification Subcommittee of the International Dry Eye WorkShop(2007)[J].Ocular Surface,2007,5(2):75-92.

[3]NN Liu,L Liu,J Li,et al.Prevalence of and risk factors for dry eye symptom in mainland china:a systematic review and metaanalysis[J].Journal of Ophthalmology,2014，2014:1-8.ID：748654.

[4] 劉祖國,陳家祺,等.眼表疾病學[M].北京:人民衛生出版社,2003，286-294.

[5]曾金雄.中老年男子雄激素部分缺乏與中藥可能干預途徑的探討[J].中國中醫藥信息雜志,2003，10(5):3-5.

[6]李海中,彭清華,王 芬,等.密蒙花總黃酮對去勢雄鼠角膜組織Fas、FasL 表達的影響[J].眼科新進展,2013,33（12）:1110-1114.

[7]彭清華,王 芬,彭 俊.近年來中醫治療干眼的研究進展[J].中華中醫藥學刊,2011,29（5）:941-945.

[8]王 方,彭清華,姚小磊,等.密蒙花總黃酮對去勢導致干眼癥雄鼠淚腺Bax mRNA、Bcl-2 mRNA表達的影響 [J].眼科新進展,2010,30（3）:201-206.

[9]彭 俊,歐陽云,譚涵宇，等.密蒙花滴眼液對去勢雄兔干眼癥淚腺細胞炎癥因子TNF-α、IL-1β的影響[J].湖南中醫藥大學學報,2017,37（5）:469-472.

（本文編輯 李 杰）

Sub-chronic Toxicity Study of Buddleja Officinalis Granules on Indexes of Hematology and Serum Biochemistry in SD Rats

QIN Genyan,ZHANG Youwei,PENG Xiaofang,WANG Ying,PENG Jun*,PENG Qinghua*
（Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China）

ObjectiveTo observe the chronic toxicity effects of Buddleja Officinalis granules and the changes of indexes about hematology and serum biochemistry in SD rats.Methods80 SD rats were randomly divided into 4 groups (male and female are fifty-fifty),including the control group and experiment groups.Experiment groups were divided into low,middle and high dose which were fed with 23.75 g,45 g and 95 g of Buddleja Officinalis granules mixed with 100 mL physiological saline for the three months'subchronic toxicity test.The gavage administration was 20 mL/kg,and the control group was given equivalent physiological saline.The indexes of white blood cell,red blood cell,hemoglobin,hematokrit,Mch,RDW-CV,blood platelet,glutamic-pyruvic transaminase,glutamic-oxalacetic transaminase,creatinine,urea,creatine kinase,kalium,serum sodium,blood chloride,cholesterol total,glycerin trimyristate,blood glucose were observed in four groups to evaluate the toxic and side effect of buddleja Officinalis granules on blood system,liver,kidney,heart.ResultsBuddleja Officinalis granules had no bad influence on the indexes of hematology and serum biochemistry.ConclusionBuddleja Officinalis Granules have no chronic toxicity on SD rats and can be extended to application in clinic.

Buddleja Officinalis granules;chronic toxicity experiment;SD rats;hematology;biochemical index

R289.5；R392

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2017.11.005

本文引用：覃艮艷，張又瑋，彭曉芳，王 英，彭 俊，彭清華.密蒙花顆粒對亞慢性毒性實驗中SD大鼠血液生化指標的分析[J].湖南中醫藥大學學報，2017，37（11）：1188-1191.

2017-5-30

國家自然科學基金面上資助項目（30772824，81574031）；湖南省高層次衛生人才“225”工程培養項目資助；湖南省科技廳科研基金資助項目（2015SF2016-6）；湖南省發展改革委科研基金資助項目（湘發改投資[2014]658號）；長沙市科技計劃重大專項（K1501014-31）；湖南中醫藥大學研究生創新項目（2016CX19）；國家中醫藥管理局中醫眼科學重點學科建設項目；湖南省中醫五官科學重點學科建設項目。

覃艮艷，在讀碩士，研究方向：眼表疾病、青光眼、眼底病。

* 彭清華，二級教授，主任醫師，博士生導師，E-mail：pqh410007@126.com；彭 俊，男，碩士，E-mail：154451101@qq.com。