護卵湯對慢性應激超排卵小鼠卵巢TGF-β1，P-Smad3及FSHR mRNA表達的影響

劉碧源，申可佳，申奏秦旋，付靈梅，熊 桀

（湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208）

護卵湯對慢性應激超排卵小鼠卵巢TGF-β1，P-Smad3及FSHR mRNA表達的影響

劉碧源，申可佳*，申奏秦旋，付靈梅，熊 桀

（湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208）

目的觀察護卵湯對慢性應激超排卵小鼠卵巢轉化生長因子-β1（transforming growth factor beta 1,TGF-β1）、信號蛋白P-Smad3及卵泡刺激素受體（follicle-stimulating hormone receptor,FSHR）mRNA表達的影響。方法建立慢性應激小鼠模型，造模成功后，隨機分為模型組、護卵湯組和生長激素組，另設正常組。在超排卵第3天和注射絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin,HCG）24 h后，檢測各組卵巢TGF-β1、P-Smad3及FSHR mRNA表達。結果與模型組比較，在超排卵第 3天，護卵湯組和生長激素組TGF-β1、P-Smad3及 FSHR mRNA表達均顯著升高（P＜0.01或P＜0.05）；注射 HCG 24 h后生長激素組表達升高更明顯（P＜0.01）。結論護卵湯可能通過激活TGF-β/Smads信號通路，發揮促進卵泡發育和改善卵巢功能的作用。

護卵湯；慢性應激；超排卵；卵巢轉化生長因子-β1；P-Smad3；卵泡刺激素受體

現代社會女性身兼家庭工作多重角色，承受的壓力越來越大，長期焦慮、憂郁、憤怒等負面情緒作為應激，不斷刺激下丘腦-垂體-卵巢軸，引起神經內分泌及卵巢功能紊亂，卵巢功能的受損引起女性生殖功能退化，出現月經失調、閉經、不孕等系列疾病，嚴重影響女性的生活質量并加速機體衰老進程。即使在輔助生殖技術如此發達的今天，仍有部分患者因卵巢功能衰退無法獲得足夠的高質量卵子而失去生育的機會，給患者身心及社會經濟帶來巨大的壓力[1-2]。

護卵湯是全國名老中醫尤昭玲教授所創，治療卵巢功能障礙臨床療效好，深受患者歡迎[3-4]。我們的前期基礎研究已證實護卵湯可改善超排卵大鼠卵巢功能，促進其排卵前卵巢微環境轉化生長因子-β （transforming growth factor-beta,TGF-β）等蛋白的表達[5-9]，在本研究中通過模擬人類應激造成卵巢功能紊亂的發病經過，從TGF-β/Smads信號通路進一步探討護卵湯對卵巢功能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 6周齡健康SPF級ICR雌性小鼠80只，體質量為22～25 g。第三周購入成年ICR雄性小鼠40只，均由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，動物合格許可證號：SCXK(湘)2011-0003。

1.1.2 藥物 護卵湯組方：熟地黃10 g，生地黃10 g，沙參 10 g，石斛 10 g，山藥 10 g，蓮子 10 g，桑椹子10 g，覆盆子10 g，菟絲子10 g，月季花10 g，蓮子心3 g，肉蓯蓉10 g，甘草3 g。以上飲片購自湖南中醫藥大學附屬第一醫院藥房，購回后加水浸泡2 h，火上煎煮3次，將3次煎液混合濃縮成濃度1.49 g/mL的護卵湯，4℃冰箱保存供實驗用。來曲唑(letrozole sheets,LE)：由江蘇恒瑞醫藥公司生產。生長激素（growth hormone,GH）：由長春金賽藥業公司生產。阿司匹林：購自沈陽奧吉娜藥業公司。尿促性腺激素 (gonadotropins,Gn)和絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin,HCG）：麗珠制藥廠生產。

1.1.3 主要試劑 PCR試劑盒購自KAPA Biosystems公司，逆轉錄試劑盒購自TAKARA公司。PCR引物由南京金斯瑞生物公司合成，其他常規試劑均為國藥產品分析純。

1.1.4 主要儀器 熒光定量PCR儀 (BIO-RAD公司，Real-Time System 型)，凝膠成像系統（BIO-RAD公司，Universal Hood II型），水平電泳設備 (BIORAD 公司，DYC-31D 型)，離心機（Eppendorf公司，5424 R型），超凈工作臺 （蘇州凈化公司，SW-CJ-2D 型）。

1.2 方法

1.2.1 慢性應激小鼠模型的建立[10]6周齡ICR雌性小鼠正常喂養1周后，稱量并記錄體質量。隨機抽取20只小鼠為正常組，其余小鼠每天上午放入制動器內制動，共制動14 d；第一次制動時間從3 h開始，每天延長30 min，至最長制動時間為每天6 h，造成小鼠慢性應激狀態。制動第10天開始，每天陰道涂片并用瑞氏染色觀察陰道脫落細胞的情況，監測小鼠動情周期的變化。若發現動情周期紊亂無規律交替，或在某期明顯延長或持續停留在間期記為動情周期異常，提示小鼠卵巢功能紊亂和/或減退[11-12]。第14天造模成功制動結束后，再次稱量所有小鼠體質量。

1.2.2 給藥及標本采集 造模成功后，小鼠隨機分為護卵湯組、生長激素組和模型組，另設正常組。護卵湯組：從試驗第1天開始灌胃護卵湯0.029 g/（kg·d）直至實驗結束，1次/d。 生長激素組：從試驗第 8 天開始腹腔注射 GH 0.0005IU/（kg·d），1 次/d，連續12 d；試驗第15天加用阿司匹林0.01 mg/（kg·d）灌胃直至實驗結束，1次/d。正常組和模型組：在同一時間灌胃或注射等量的生理鹽水。4組小鼠均在試驗第15天啟動微刺激超排卵，其方案為：先用 LE 0.65 μg/（kg·d）灌胃，1 次/d，連續 5 d；第21 天腹腔注射 Gn 0.0195U/（kg·d），1 次/d， 連續7 d，于末次應用Gn后，雌雄鼠以2∶1比例合籠，次日晨檢查陰栓，有陰栓者腹腔注射HCG 1.29U/（kg·d）一次。每組小鼠在超排卵啟動后第3天和注射HCG 24 h后這兩個時間段，分別處死10只小鼠獲取卵巢放入液氮罐保存待檢。

1.2.3 實時熒光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測卵巢 TGF-β1，FSHR，P-Smad3 mRNA的表達水平 用Trizol提取卵巢組織的總RNA，紫外分光光度計定量檢測。總RNA逆轉錄成cDNA按照試劑盒說明書操作，然后進行PCR擴增。引物參照文獻設計（見表1），以β-肌動蛋白(β-Actin)為內參分別擴增 TGF-β1，FSHR，PSmad3的基因。反應程序為：95℃預變性3 min；95℃變性5 s；56℃退火10 s；72℃延伸25 s；進行39循環后；65℃維持5 s；95℃維持50 s。數據采用儀器自帶軟件qbase plus分析，基因表達相對量用2-△△Ct表示，用擴增曲線、熔點曲線監測各標本 PCR反應的特異性。

表1 PCR引物序列及長度

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 一般情況及動情周期觀察

正常對照組從實驗開始到實驗結束外觀及活動狀態均無異常，體質量適度增加。其他組小鼠制動開始后逐漸出現進食減少，二便減少，行動遲緩，四肢無力，毛色晦暗無光并出現不同程度的脫落，制動結束后體質量較正常對照組明顯減輕；對動情周期的觀察發現，正常組小鼠均有規律變化的動情周期，模型組小鼠均出現不同程度的動情周期異常，提示慢性制動應激引起小鼠卵巢功能紊亂或減退。制動小鼠在制動結束后逐漸恢復進食及二便，行動變活潑，毛色恢復光澤，體質量增加，到實驗結束時體質量與正常組無明顯區別。

2.2 各組小鼠卵巢TGF-β1mRNA表達的比較

在超排卵第3天，模型小鼠卵巢組織中TGF-β1mRNA 表達明顯低于正常組（P＜0.01），隨時間延長其mRNA表達逐漸恢復，但與正常組比較差異仍有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，護卵湯組和生長激素組在該時間點 TGF-β1 mRNA表達均明顯升高 （P＜0.01）。 但注射 HCG 24 h 后護卵湯組其mRNA表達與模型組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。結果見表 2。

2.3 各組小鼠卵巢P-Smad3 mRNA表達的比較

與正常組比較，在超排卵第3天模型組小鼠卵巢組織中 P-Smad3 mRNA 表達明顯降低（P＜0.01），但在注射HCG 24 h后達到正常組水平。經過干預后，護卵湯組和生長激素組在超排卵第3天其mRNA 表達均較模型組明顯升高（P＜0.01）；護卵湯組在注射HCG 24 h后P-Smad3 mRNA表達與模型組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。 見表 3。2.4 各組小鼠卵巢FSHR mRNA表達的比較

表2 各組小鼠卵巢TGF-β1 mRNA表達的比較 （±s,n=10）

表2 各組小鼠卵巢TGF-β1 mRNA表達的比較 （±s,n=10）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01。

組別正常組模型組生長激素組護卵湯組F值P值超排卵第3天1.000±0.085 0.280±0.017**1.199±0.101△△0.578±0.097△△104.5 0.000注射HCG 24 h 1.000±0.116 0.757±0.089*2.109±0.141△△0.612±0.032 192.8 0.000

表3 各組小鼠卵巢P-Smad3 mRNA表達的比較 （±s,n=10）

表3 各組小鼠卵巢P-Smad3 mRNA表達的比較 （±s,n=10）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01。

組別正常組模型組生長激素組護卵湯組F值P值超排卵第3天1.000±0.029 0.228±0.008**2.454±0.041△△0.591±0.070△△246.4 0.000注射HCG24 h 1.000±0.032 1.012±0.022 2.801±0.131△△0.670±0.020 607.7 0.000

在兩個時間點，模型組小鼠卵巢組織中FSHR mRNA 表達均明顯低于正常組 （P＜0.01）；生長激素組其mRNA表達均顯著高于模型組 （P＜0.01）。在超排卵第3天，護卵湯組FSHR mRNA表達較模型組明顯升高 （P＜0.05）， 但在注射 HCG 24 h后其表達與模型組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。 結果見表 4。

表4 各組小鼠卵巢FSHR mRNA表達的比較 （±s,n=10）

表4 各組小鼠卵巢FSHR mRNA表達的比較 （±s,n=10）

注：與正常對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別正常組模型組生長激素組護卵湯組F值P值超排卵第3天1.000±0.080 0.458±0.032**2.071±0.075△△0.563±0.022△934.4 0.000注射HCG 24 h 1.000±0.044 0.635±0.084**2.454±0.173△△0.709±0.020 324.7 0.000

3 討論

卵泡發育包括促性腺激素非依賴性階段和促性腺激素依賴階段。目前認為這種不依賴激素的調節主要由卵巢局部調控，包括卵泡顆粒細胞、卵泡膜細胞及卵母細胞表達分泌的各種細胞因子及其受體、激素類分子，以及具有支持營養作用的其他蛋白分子。有研究發現TGF-β1在始基卵泡的募集及始基卵泡池的維持方面起重要調控作用[13]。而TGF-β超家族對卵泡發育的調節作用是通過與卵泡細胞上相應受體結合，啟動多條信號轉導通路來傳遞生物信息。其中TGF-β/Smads信號通路已被證實在卵泡存在。Smads蛋白家族是TGF-β超家族受體作用的底物，將信息傳遞到細胞核內，調控相關靶基因的表達。通過定向敲除Smads蛋白，出現年齡依賴的不孕不育，并出現卵泡的閉鎖增加，卵泡發育障礙，激素合成受阻，排卵障礙等。可見Smads蛋白家族在卵泡發育過程中發揮重要作用。其中Smad2/Smad3主要參與TGF-β的信號轉導[14]。

本研究發現模型組小鼠卵巢組織 TGF-β1、FSHR及P-Smad3的mRNA表達明顯低于正常組，提示慢性制動應激可能通過抑制卵巢TGF-β/Smads信號通路使小鼠卵巢功能受損；護卵湯組和生長激素組小鼠的相關指標表達較模型組明顯增高，提示護卵湯和生長激素/阿司匹林可上調慢性制動小鼠超排卵過程中卵巢 TGF-β1、FSHR及 P-Smad3的mRNA表達。已證實TGF-β1可作用于卵巢顆粒細胞、卵泡膜細胞和卵母細胞，啟動細胞內Smads信號通路，激活Smad2/Smad3使之磷酸化，活化的Smad2/Smad3與Smad4形成多聚體，進入核內調控靶基因的轉錄，最終可促進芳香化酶、FSHR和黃體生成素受體（LHR）等表達及雌二醇（E2）和孕酮（P）的分泌，從而調控卵泡的發育[15-16]。故本實驗結果提示護卵湯和生長激素/阿司匹林可通過TGF-β1信號通路改善卵巢功能，促進卵泡發育。同時，實驗發現生長激素組在注射HCG 24 h后小鼠卵巢TGF-β1、FSHR及P-Smad3的mRNA表達更高，但護卵湯的作用不明顯，提示生長激素/阿司匹林對卵巢功能的改善可能更優于中藥護卵湯，當然，這需要進一步的動物及臨床實驗去判斷和驗證。

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（本文編輯 楊 瑛）

Effects of Huluan Decoction on mRNA Expression of TGF-β1,P-Smad3 and FSHR in Super Ovulation Mice with Chronic Stress

LIU Biyuan,SHEN Kejia*,SHEN Zouqinxuan,FU Lingmei,XIONG Jie
(1.Affiliated Hospital of Hunan Academy of traditional Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410006,China;(Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China)

ObjectiveTo investigate the effects of Huluan decoction on mRNA expression of TGF-β1,P-Smad3 and FSHR in super ovulation mice with chronic stress.MethodsChronic stress mice models were established.After modeling,the mice were randomly divided into model group,Huluan decoction group,growth hormone group,and normal group(no movement limit)was also assigned.On the third day of the super ovulation and after 24 hours of injection HCG,ovaries were taken from mice of each group for mRNA analysis of TGF-β1,P-Smad3 and FSHR.ResultsCompared with the model group,on the third day of the super ovulation,the mRNA expression levels of TGF-1,P-Smad3 and FSHR in growth hormone group and Huluan decoction group were significantly higher than those in the model group (P＜0.01 orP＜0.05),but growth hormone group increased significantly after 24 hours of the injection HCG (P＜0.01).ConclusionHuluan decoction could activate TGF-beta/Smads signaling pathway to promote the follicular development and improve ovarian function in super ovulation mice with chronic stress.

Huluan decoction;chronic stress;super ovulation;TGF-β1;P-Smad3;FSHR

R285.5；R711.75

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2017.11.006

本文引用：劉碧源，申可佳，申奏秦旋，付靈梅，熊 桀.護卵湯對慢性應激超排卵小鼠卵巢TGF-β1，P-Smad3及FSHR mRNA表達的影響[J].湖南中醫藥大學學報，2017，37（11）：1192-1195.

2017-01-17

國家自然科學基金項目資助（81303003，81403427）。

劉碧源，女，副教授，主要從事醫學免疫學的基礎研究。

*申可佳，女，副教授，主要從事中西醫結合治療不孕不育的基礎研究，E-mail:shen_kejia@163.com。