原花青素促進三陰乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡的作用機制研究

黃秉一，徐朝軍，宋 嵐

（1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院普外科，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫藥大學第一附屬醫院胸心外科，湖南 長沙 410007；3.湖南中醫藥大學醫學院生物化學與分子生物學教研室，湖南 長沙 410208）

原花青素促進三陰乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡的作用機制研究

黃秉一1，徐朝軍2，宋 嵐3*

（1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院普外科，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫藥大學第一附屬醫院胸心外科，湖南 長沙 410007；3.湖南中醫藥大學醫學院生物化學與分子生物學教研室，湖南 長沙 410208）

目的研究原花青素（Procyanidins,PC）對三陰乳腺癌MDA-MB-231細胞株增殖及細胞凋亡的作用及其機制。方法常規培養細胞，24 h后隨機分為陽性對照組、對照組和PC10、20、40、80、160、320 μg/mL組。MTT法檢測細胞生長抑制率；流式細胞術檢測細胞凋亡；Western blot法檢測FoxA1蛋白及抗凋亡蛋白bcl2、UCP2表達。結果PC各劑量組均可顯著抑制抑制 MDA-MB-231 細胞增殖（P＜0.05）；PC（10-160 μg/mL）組劑量依賴性抑制 MDA-MB-231 細胞增殖（P＜0.05），PC（40-320 μg/mL）可以時間依賴性抑制細胞增殖（P＜0.05）；PC320 μg/mL 組各時間點細胞抑制率與 PC160 μg/mL 組差異無顯著性（P＞0.05）； 160 μg/mL PC 可以時間依賴性促進 MDA-MB-231 細胞凋亡（P＜0.05）；160 μg/mL PC 作用 24 h 后，FoxA1 蛋白表達顯著上升（P＜0.05），同時 bcl2 及 UCP2 表達降低（P＜0.05）。結論PC 抑制 MDA-MB-231 細胞，促進 MDA-MB-231 細胞凋亡，升高其FoxA1表達，同時降低bcl2及UCP2表達，表明PC可能通過促進FoxA1表達發揮促進MDA-MB-231細胞凋亡的作用。

原花青素；MDA-MB-231細胞；三陰乳腺癌；FoxA1細胞凋亡

原花青素（procyandin,PC）是自然界來源豐富的多酚類黃酮植物化合物，由不同數量的兒茶素或表兒茶素結合而成。目前在葡萄籽、荔枝殼等多種植物中含量豐富。研究發現，原花青素具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、心血管保護等多種功能[1-5]。在抗腫瘤方面，近年研究顯示，PC可以抑制包括前列腺癌、肺癌在內的多種癌細胞增殖，尤其對化療藥物耐受的一些腫瘤細胞株也有較好的生長抑制效應[5-7]。

FoxA1是翼狀螺旋轉錄因子家族成員之一，在胚胎形成、細胞分化等方面具有重要的功能。研究顯示FoxA1在乳腺癌的發生發展中也具有重要作用，在不同種類的乳腺癌細胞中，FoxA1表達程度不一，對導致不同種類乳腺癌細胞對雌激素敏感性以及對現在標準的激素治療的效果及預后不同[8-10]。本實驗組前期研究顯示原花青素可以調節包括乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231細胞株在內的多種細胞FoxA1表達。本研究旨在本課題組前期實驗基礎上觀察PC對雌激素不敏感型三陰乳腺癌細胞株MDA-MB-231細胞增殖和凋亡的影響，并初步探討其是否通過FoxA1發揮作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

人三陰乳腺癌MDA-MB-231細胞株購自ATCC；胎牛血清購自杭州四季青生物材料公司；RPMI1640培養基購自Gibco公司；順鉑(DDP)購自江蘇豪森藥業股份有限公司；胰蛋白酶和MTT試劑購自Sigma公司；兔抗人FoxA1抗體購自Abcam公司；鼠抗人B淋巴細胞瘤-2（bcl2）和解偶聯蛋白2（UCP2）抗體購自Abcam公司；GAPDH及相應二抗抗體、BCA試劑盒均購自武漢博士德公司。

1.2 實驗分組

常規培養人三陰乳腺癌MDA-MB-231細胞，取對數生長期細胞，隨機分為對照組、陽性對照組（順鉑組）和 PC 組（10、20、40、80、160、320 μg/mL）。

1.3 MTT法檢測PC對MDA-MB-231細胞的生長抑制作用

對數生長期細胞常規消化洗滌后，以1×105/孔接種于96孔培養板，置于5%CO2、37℃二氧化碳培養箱培養24 h后，按實驗分組分別加入生理鹽水、順鉑、不同濃度PC。繼續培養，分別于24 h、48 h、72 h后收集細胞，按照常規進行MTT實驗，加入MTT后繼續培養4 h，酶標儀測定各孔570 nm吸光度值（A570）。計算細胞抑制率，細胞抑制率=[（1-實驗組 A570）/對照組 A570]×100%。每組設6個復孔，實驗重復3次。

1.4 流式細胞術檢測MDA-MB-231細胞凋亡

取對數生長期細胞，按密度1×106/瓶接種于25 mL細胞培養瓶，置于二氧化碳培養箱24 h后加入PC，使其終濃度分別為160 μg/mL。并按前述實驗分組設置陽性對照組（順鉑組）和對照組。繼續培養48 h后棄去培養液，pH7.4 PBS漂洗細胞，70%酒精固定，-20℃孵育 2 h以上，250 g離心5 min收集細胞。細胞重懸于1 mL PBS中，室溫放置10 min，250g離心5 min后細胞重懸于500 μL PBS （含 0.2%RNase A），37 ℃孵育 30 min。 4 ℃20 g/L碘化丙啶染色30 min，上機檢測細胞凋亡率。

1.5 Western-blot檢測相關蛋白表達

取對數生長期細胞，按密度1×106/瓶接種于25 mL細胞培養瓶，置于二氧化碳培養箱24 h后加入PC，使其終濃度分別為160 μg/mL。于預設時間點收集細胞，加入細胞裂解液，離心后收集上清，采用BCA法測定蛋白濃度。蛋白質與上樣緩沖液混勻后煮沸 10 min。20 μg/孔上樣，12%SDS-PAGE 電泳分離蛋白質，轉膜后5%脫脂奶粉封閉2 h，加入相應一抗，室溫孵育4 h后洗滌3次，加入相應二抗室溫孵育30 min后DAB顯色。

1.6 統計學分析

2 實驗結果

2.1 PC對MDA-MB-231細胞增殖的抑制作用

實驗結果顯示，PC不同實驗濃度組與對照組比較，MDA-MB-231細胞抑制率明顯提高，差異具有統計學意義（P＜0.05）；PC10、20、40、80、160 μg/mL 組同一時間點不同劑量的PC作用于細胞后，隨PC濃度增高，細胞生長抑制率與前一較低濃度比較亦明顯升高，差異具有統計學意義（P＜0.05）；PC40、80、160、320 μg/mL組對細胞增殖的抑制作用隨著時間增長而升高，具有時間依賴性（P＜0.05）；但是 320 μg/mL的PC作用于細胞后細胞各時間點細胞抑制率與160 μg/mL 組差異無統計學意義（P>0.05）。 故后續實驗PC濃度采用160 μg/mL展開。見表1。

表1 PC對MDA-MB231細胞增殖的影響 （n=3，±s）

表1 PC對MDA-MB231細胞增殖的影響 （n=3，±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；同一時間點PC組與前一低濃度比較，#P＜0.05；同一 PC 組與前一時間點比較，△P＜0.05。

組別細胞生長抑制率（%）24 h 48 h 72 h對照組PC 10 μg/mL 組PC 20 μg/mL 組PC 40 μg/mL 組PC 80 μg/mL 組PC 160 μg/mL 組PC 320 μg/mL 組順鉑組1.5±0.09 23.6±1.24*30.4±1.72*#35.3±1.66*#40.1±2.31*#44.6±1.87*#45.1±1.53*51.2±1.33*2.1±0.02 25.3±1.17*32.1±1.41*#39.6±1.38*#△45.2±2.65*#△50.1±2.50*#△51.4±1.82*△52.9±2.41*2.4±+0.02 26.8±1.45*35.2±1.27*#45.3±2.15*#△50.5±1.91*#△54.2±3.16*#△55.0±1.27*△54.8±1.73*

2.2 160 μg/mL PC對MDA-MB-231細胞凋亡的影響

采用 160 μg/mL的 PC與 MDA-MB-231細胞孵育24 h、48 h和72 h后采用流式細胞術檢測細胞凋亡，結果顯示：與對照組比較PC160 μg/mL組和順鉑組細胞凋亡率顯著上升，差異具有統計學意義（P＜0.05）。隨PC作用時間延長，細胞凋亡率亦上升，具有時間依賴性（P＜0.05）。 見表 2。

表2 160 μg/mL PC對MDA-MB231細胞凋亡的影響（%，n=3，±s）

表2 160 μg/mL PC對MDA-MB231細胞凋亡的影響（%，n=3，±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與同組前一時間點比較，#P＜0.05。

組別對照組PC160 μg/mL 組順鉑組24 h 1.46±0.04 20.32±2.51*25.17±1.39*48 h 1.85±0.03 38.01±2.01*#38.95±1.26*#72 h 2.69±0.05 60.57±2.18*#65.16±1.94*#

2.3 160 μg/mL PC 對 MDA-MB-231 細胞 FoxA1、bcl2和ucp2表達的影響

采用western-blot檢測MDA-MB-231細胞FoxA1、bcl2和ucp2蛋白表達。結果顯示：與0 h比較，160 μg/mL的PC作用于MDA-MB-231細胞后24、48、72 h，FoxA1 表達均顯著上升，差異有統計學意義（P＜0.05），并且隨PC作用時間延長，FoxA1表達上升具有時間依賴性 （每一時間點與前一時間點比較，P＜0.05）；而 bcl2和 UCP2表達則明顯下降，也具有時間依賴性，差異有顯著性 （與0 h比較P＜0.05，每一時間點與前一時間點比較，P＜0.05）。見圖1和表3。

圖 1 western-blot檢測 160 μg/mL PC對 MDA-MB231細胞FoxA1、bcl2及UCP2蛋白表達的影響

表 3 160 μg/mL PC 對 MDA-MB231細胞 FoxA1、bcl2及UCP2 蛋白表達的影響（相對灰度值，n=3，±s）

表 3 160 μg/mL PC 對 MDA-MB231細胞 FoxA1、bcl2及UCP2 蛋白表達的影響（相對灰度值，n=3，±s）

注：與 0 h 比較，*P＜0.05；與前一時間點比較，#P＜0.05。

FoxA1 bcl2 UCP2 0 h 1.0±0.05 1.0±0.03 1.0±0.05 24 h 1.34±0.021*0.85±0.017*0.75±0.092*48 h 1.87±0.025*#0.56±0.008*#0.62±0.073*#72 h 2.31±0.232*#0.38±0.033*#0.58±0.054*#

3 討論

三陰乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)是一種特殊的乳腺癌亞型，TNBC系雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體 (progesterone receptor，PR)和人類表皮生長因子受體一2(human epidermal growth factor receptor.2，Her.2) 表達均陰性的乳腺癌，侵襲性強、預后差，近年來受到廣泛關注。我國TNBC發病率約占乳腺癌的1／4[11]。TNBC患者的5年無病生存率 (disease free survival，DFS)和總生存率 (overall survival，OS)均顯著低于非TNBC患者[12]。TNBC易復發、易轉移、生存率低，在臨床治療中有一定的難度。由于缺乏有效的內分泌治療及靶向治療，目前以蒽環類為基礎的化療為主，但療效欠佳，容易早期局部復發和遠處轉移，因此尋找有效的藥物治療是目前亟待解決的問題。

研究顯示，原花青素可以通過抗氧化和清除自由基、抗炎、調節NF-κB及其目標基因、促進腫瘤細胞凋亡、細胞周期阻滯和抑制血管生成等機制起到抗癌作用。而且體內和體外腫瘤模型實驗均證明原花青素對各種腫瘤均有抑制作用[5-7]。有研究顯示，原花青素可以通過caspase途徑促進乳腺癌MCF-7細胞凋亡[13]。但是目前尚未見其對TNBC細胞株MDA-MB-231細胞凋亡的影響。

本實驗結果表明實驗用原花青素能顯著抑制MDA-MB231細胞增殖，并促進MDA-MB-231細胞凋亡。為探討研究原花青素誘導MDA-MB-231細胞凋亡的機制，課題組檢測了FoxA1蛋白及凋亡相關蛋白的表達，結果顯示原花青素作用24小時后FoxA1蛋白表達顯著上升，而抗凋亡基因bcl2及UCP2表達降低。以前的研究顯示FoxA1在多種腫瘤細胞中可以抑制bcl2和UCP2基因的表達[14-15]。因此推測，在MDA-MB-231細胞中原花青素可能通過升高FoxA1表達并進一步抑制bcl2和UCP2表達，從而抑制MDA-MB-231細胞增殖，促進其凋亡。詳細作用機制還需要離體及在體進一步研究。

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（本文編輯 匡靜之）

Effect of Procyanidin in Promoting Apoptosis of MDA-MB-231 Triple-Negative Breast Cancer Cell Lines

HUANG Bingyi1,XU Zhaojun2,SONG Lan3*
（1.General Surgery,the First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007,China；2.Department of Cardiothoracic Surgery,the First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007,China;3.Department of Biochemistry and Molecular Biology,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China）

ObjectiveTo study the effect and mechanism of procyanidins(PC)on the proliferation and apoptosis of MDAMB-231 breast cancer cell line.MethodsThe cells were randomly divided into positive control group,control group and PC(10,20,4.,80,160,320 μg/mL)groups.Growth inhibiting rate of MDA-MB-231 cell was detected by MTT assay.Apoptosis was detected by flow cytometry,and the expression of FoxA1 protein and anti apoptotic protein (UCP2 and bcl2)were detected by Western blot.ResultsDifferent doses of PC could infinicantly inhibited the proliferation of MDA-MB-231 cells(P＜0.05).The inhibition rate of cell growth in the range of 10-160 μg/mL was dose-dependent(P＜0.05),and the inhibition rate of cell growth in the range of 40-320 μg/mL was time-dependent （P＜0.05).However,there was no significant between 160 μg/mL group and 320 μg/mL group in the inhibition rate of cell growth (P＞0.05).160 μg/mL PC could promote the apoptosis of MDA-MB-231 cells in the time-dependent(P＜0.05).The expression of FoxA1 protein significantly increased after 160 g/mL PC for 24 h (P＜0.05),while the expression of UCP2 and bcl2 decreased (P＜0.05).ConclusionPC could promote the apoptosis of MDA-MB-231 cells and decrease the expression of bc12 and UCP2,which may through promoting the expression of FoxA1.

procyandin;MDA-MB-231 cell;breast cancer;FoxA1;apoptosis

R286

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2017.11.007

本文引用：黃秉一，徐朝軍，宋 嵐.原花青素促進三陰乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡的作用機制研究[J].湖南中醫藥大學學報，2017，37（11）：1196-1199.

2016-12-11

湖南省教育廳課題（13C691）。

黃秉一，男，副主任醫師，主要從事乳腺及腹部外科疾病研究。

* 宋 嵐，女，副教授，碩士研究生導師，E-mail：344069980@qq.com。