羥基紅花黃色素A對雌激素效應相關蛋白表達的影響

陳 夢，趙丕文，孫麗萍，武虹波，趙 笛

(北京中醫藥大學中醫學院，北京 100029)

羥基紅花黃色素A對雌激素效應相關蛋白表達的影響

陳 夢，趙丕文*，孫麗萍，武虹波，趙 笛

(北京中醫藥大學中醫學院，北京 100029)

目的探討羥基紅花黃色素A（hydroxysafflor yellow A，HSYA）對雌激素效應相關蛋白表達的影響。方法 培養雌激素受體陽性細胞T47D和特異性雌激素受體（estrogen receptor，ER）陰性細胞 SK-BR-3，將 1×10-7mol/L-1×10-9mol/L三種梯度濃度的HSYA作用于兩種細胞，通過蛋白質免疫印跡法檢測雌激素受體ERα及ERβ、細胞外調解蛋白激酶1/2（ERK1/2）及p-ERK1/2、孕激素受體（progesterone receptor,PR）、抑癌基因P27等蛋白的表達情況。結果與空白對照組相比，在T47D細胞中，高濃度的 HSYA 促進了 ERα、ERβ、ERK1/2、p-ERK1/2、PR 的表達，抑制了 P27 的表達（P＜0.01）；在 SK-BR-3 細胞中，HSYA顯著抑制了ERK1/2的表達，但對p-ERK1/2的表達影響不明顯（P＞0.05）。結論HSYA在細胞內影響雌激素效應相關蛋白的表達情況不同，可能是通過調節ER表達及激活ERK信號通路而發揮雌激素樣作用。

羥基紅花黃色素A；Western Blot；T47D細胞；SK-BR-3細胞

雌激素是人體內關鍵的調節激素，對女性健康尤為重要，主要來源于女性卵泡內膜細胞和卵泡顆粒細胞[1]，主要成分為17β-雌二醇，通過與特異性雌激素受體（estrogen receptor，ER）結合，將受體活化并遷移至細胞核中形成二聚體復合物，該復合物與特定的DNA序列結合，啟動靶基因轉錄表達[2]。ER有α和β兩種亞型[3]。

植物雌激素（phytoestrogen，PE）與內源性雌激素結構和功能類似，羥基紅花黃色素A（hydroxysafflor yellow A，HSYA）屬于PE的一種，是紅花的主要活性成分，為查爾酮類化合物。研究表明，HSYA具有抗炎、抗腫瘤、抗心血管疾病等作用[4-7]。筆者前期對其在細胞內的作用機制進行研究，發現具有弱雌激素效應[8]，因此本文擬從蛋白水平繼續進行深入研究。以人乳腺癌細胞T47D（ER+）和SK-BR-3（ER-）為載體，檢測 HSYA 作用下，ERα、ERβ、孕激素受體（progesterone receptor,PR），細胞周期依賴性蛋白激酶抑制劑P27，以及MAPK信號通路中細胞外調節蛋白激酶 （extracellular regulated protein kinases,ERK1/2）及其磷酸化 ERK1/2（P-ERK1/2）的表達情況。SK-BR-3細胞有膜受體G蛋白偶聯雌激素受體 1 （G protein-coupled estrogen receptor，GPER1），諸多研究發現，GPER1參與了雌激素在體內的轉導過程，因此通過檢測MAPK信號通路中ERK1/2、p-ERK1/2兩種蛋白表達的影響[9-10]，推測HSYA在體內的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 HSYA購自中國藥品生物制品檢定所；17β-雌二醇購自Sigma公司。均用無水乙醇溶解至所需濃度。

1.1.2 細胞株 人乳腺癌細胞株 T47D、SK-BR-3購自北京協和細胞資源中心。

1.1.3 主要試劑與儀器 培養基RPMI1640購自邁晨公司；Western Blot相關試劑購自普利萊基因有限公司； 一抗： ERα、ERβ、ERK1/2、p-ERK1/2、PR、P27、β-actin 購自 Santa Cruz公司；二抗：Anti-Rabbit IgG/HRP和Anti-Goat IgG/HRP購自北京康為世紀生物科技有限公司。

TS100普通倒置顯微鏡（NIKON）；3K15低溫離心機（SIGMA）；DYY-6C電泳儀電源（北京市六一儀器廠）；Mini-PROTEAN Tetra Cell單垂直電泳槽（BIO-RAD）；Mini-PROTEAN II轉移電泳槽 （BIORAD）。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制 10%分離膠，5%濃縮膠， 電泳緩沖液，轉膜緩沖液，PBST封閉緩沖液（現配現用），封閉液，PMSF儲存液。

1.2.2 細胞培養 T47D細胞的培養條件為含10%

胎牛血清的RPMI1640培養基，37℃、5%CO2，相對飽和濕度。取對數生長期細胞，以5×105個/瓶的密度接種于塑料培養瓶中。待細胞貼壁后，換為含受試物 HSYA（1×10-7mol/L-1×10-9mol/L）、陽性對照藥物（1×10-8mol/L雌二醇）的培養液繼續培養，同時設置空白對照組，48 h終止培養。SK-BR-3細胞的培養條件、操作方法同上。

1.2.3 蛋白提取及定量 細胞終止培養，棄培養基。用預冷的PBS沖洗兩遍，加入0.25%胰酶進行消化，收集細胞混懸液，1 000 r/min離心1 min，小心吸棄上清液，將離心管置于冰上。加入預冷的蛋白裂解液（RIPA∶PMSF=100∶1），置于冰上，不斷混勻。 20 min后轉到1.5 mL離心管中，4 ℃，12 000 r/min， 離心15 min。取上清液，保存溫度為-20℃。選用BCA蛋白定量試劑盒進行檢測。

1.2.4 Western Blot分析蛋白表達 安裝實驗儀器，在兩層玻璃板之間灌膠，下層灌注10%分離膠約40 min后凝固，在上層灌注5%濃縮膠。蛋白變性后迅速入冰冷卻，加入5×Loading buffer調節樣品，再上樣。80 V恒壓電泳1 h，待條帶至濃縮膠與分離膠界面時，電壓改為120 V。剪裁PVDF膜，60V恒壓濕法轉膜2 h。室溫下封閉1 h。加一抗1 μg/mL，4℃過夜。次日用PBST洗膜3次，每次10 min。加二抗室溫下振搖1 h。PBST洗膜3次，每次10 min。ECL發光，暗室曝光，顯影定影得X光片。掃描X光片，用Quantity One軟件（BIO-RAD）進行灰度分析，以受試藥物組的條帶與內參β-actin條帶灰度平均值的比值作為目的蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 HSYA對T47D細胞蛋白表達的影響

與空白對照組相比，雌二醇促進了ERα、ERβ、ERK1/2、p-ERK1/2四種蛋白的表達，顯著抑制了P27、PR兩種蛋白的表達,并且ERα/ERβ的比值低于空白對照組，表明雌二醇促進ERβ的表達更明顯。ERK1/2與p-ERK1/2的比值低于空白對照組，表明雌二醇促其磷酸化活化的作用更顯著。HSYA促進ERα及ERβ蛋白表達，其干預組ERα/ERβ的比值高于空白對照組，表明HSYA促進ERα的表達更明顯。在MAPK信號通路中ERK1/2磷酸化進行信號轉導。高濃度 （1×10-7mol/L）HSYA顯著促進ERK1/2及 p-ERK1/2的表達，且促進其磷酸化活化。HSYA作用下抑癌基因P27的表達顯著低于空白對照組，且濃度高時抑制作用最顯著。高濃度HSYA促進PR表達，低濃度HSYA與雌二醇作用相似，顯著抑制了 PR 表達（P＜0.01）。 如圖 1，表 1。

圖1 T47D細胞蛋白自顯影結果

表1 T47D細胞蛋白的相對表達量 （±s,n=8）

表1 T47D細胞蛋白的相對表達量 （±s,n=8）

注：與空白對照組相比 *P＜0.05，**P＜0.01。

?

2.2 HSYA對SK-BR-3蛋白表達的影響

與空白對照組相比，HSYA各組顯著抑制了細胞ERK1/2的表達，與雌二醇組作用趨勢一致，并且藥物濃度高時抑制作用最顯著（P＜0.01）。但雌二醇和HSYA各組均對p-ERK1/2蛋白的表達影響不顯著（P＞0.05）。 如圖 2，表 2。

圖2 SK-BR-3細胞的蛋白自顯影結果

表2 不同濃度的HSYA作用于SK-BR-3細胞的蛋白的相對比表達量 （±s,n=8）

表2 不同濃度的HSYA作用于SK-BR-3細胞的蛋白的相對比表達量 （±s,n=8）

注：與空白對照組相比 **P＜0.01。

組別 濃度/mol·L-1空白對照雌二醇 1×10-8 HSYA 1×10-7 HSYA 1×10-8 HSYA 1×10-9 F值P值ERK1/2 1.072 3±0.013 6 0.900 3±0.014 8**0.640 8±0.038 8**0.873 8±0.032 5**0.877 2±0.024 5**198.7 0.000 p-ERK1/2 0.350 4±0.018 1 0.375 7±0.008 5 0.340 5±0.014 6 0.350 8±0.026 1 0.357 3±0.021 1 0.770 0.557

3 討論

HSYA為紅花黃色素中含量最高的單體成分，具有多種藥理作用。本實驗對其雌激素樣效應及可能的機制進行了探究。在含有ER的T47D細胞中，HSYA各組與雌二醇組均促進了ERα、ERβ的表達。但對于ERα與ERβ的比值，HSYA組與雌二醇組作用相反，即HSYA對ERα的誘導作用高于ERβ。

ERK作為MAPK信號通路的核心成員，磷酸化進入細胞核后，調節轉錄因子，調控細胞增殖、分化和凋亡[11]。在T47D細胞中，高濃度的 HSYA與雌二醇顯著促進ERK1/2、p-ERK1/2的表達，且p-ERK1/2與ERK1/2的比值高于對照組，即激活了 Ras/Raf/MEK/ERK信號通路。在SK-BR-3細胞中，HSYA與雌二醇顯著抑制了ERK1/2的表達，但對p-ERK1/2的表達影響不明顯,可能的機制是HSYA阻斷了ERK的磷酸化，即阻斷了該條信號通路的傳導。

P27為細胞周期依賴性蛋白激酶抑制劑的一種，屬于抑癌基因，在抑制腫瘤發展、調控腫瘤細胞分化遷移等方面發揮重要作用[12]。在細胞內P27蛋白表達減少會增加處于S期的細胞比例，使細胞過度增殖。本實驗中HSYA對T47D細胞的P27蛋白表達顯著低于對照組，與雌二醇促進該乳腺癌細胞增殖的結果一致。

PR與ER同屬于核受體超家族，研究發現，正常乳腺上皮細胞中PR與ER都有表達，因此乳腺組織是PR、ER的靶器官。乳腺組織癌變后仍表達ER、PR說明乳腺癌細胞具有激素依賴特性[13]。本研究中，高濃度的HSYA促進PR的表達，而低濃度的HSYA同雌二醇作用相似，抑制了PR的表達。出現這種結果的原因，還有待于進一步研究分析。

以上結果提示HSYA可調節 ERα/ERβ的比值，激活ERK信號通路以及通路相關蛋白而發揮作用，但具體的機制及對幾種蛋白的相互作用還有待進一步研究。

[1]Cunha GR,Donjacour AA,Cooke PS,et al.The endocrinology and developmental biology of the prostate[J].Endocr Rev,1987,8(3):338-362.

[2]Jensen EV,Suzuki T,Kawashima T,et al.A two-step mechanism for the interaction of estradiol with rat uterus[J].Proc Natl Acad Sci U S A,1968,59(2):632-638.

[3]Kuiper GG,Enmark E,Pelto-Huikko M,et al.Cloning of a novel receptor expressed in rat prostate and ovary[J].Proc Natl Acad Sci USA,1996,93(12):5925-5930.

[4]楊小虎，王丹丹，朱 彥.羥基紅花黃色素A的現代研究進展[J].湖南中醫藥大學學報,2013,33(3):102-106.

[5]Jin M,Sun CY,Zhang BX.Hydroxysafflor yellow A attenuate lipopolysaccharide-induced endothelium inflammatory injury[J].Chin J Integr Med,2016,22(1):36-41.

[6]Sun L,Yang L,Fu Y,et al.Capacity of HSYA to inhibit nitrotyrosine formation induced by focal ischemic brain injury[J].Nitric Oxide-Biology and Chemistry,2013,35:144-151.

[7]Yang F,Li J,Zhu J,et al.Hydroxysafflor yellow A inhibits angiogenesis ofhepatocellularcarcinoma via blocking ERK/MAPK and NF-κB signaling pathway in H22 tumor-bearing mice[J].Eur J Pharmacol,2015,754:105-114.

[8]陳 夢，趙丕文，臧金鳳.羥基紅花黃色素A的植物雌激素樣作用機制[J].湖北中醫藥大學學報,2014,16(6):44-47.

[9]Rago V,Romeo F,Giordano M,et al.Identification of the G proteincoupledestrogen receptor(GPER)in human prostate:expression site of the estrogen receptor in the benign and neoplastic gland[J].Andrology，2016,4(1):121-127.

[10]Sbert-Roig M,Bauza-Thorbrugge M,Galmes-Pascual BM,et al.GPER mediates the effects of 17 beta-estradiol in cardiac mitochondrial biogenesis and function[J].Molecular and Cellular endocrinology,2016,420(C):116-124.

[11]Kolch W.Meaningful relationships:the regulation of the Ras/Raf/MEK/ERK pathway by protein interactions[J].Biochem J,2000,351(pt2):289-305.

[12]Lee CT,Lee YJ,Kwon SY,et al.In vivo imaging of adenovirus transduction and enhanced therapeutic efficacy of combination therapy with conditionally replicating adenovirus and adenovirus-p27[J].Cancer Res,2006,66(1):372-377.

[13]Zhou LH,Yin WJ,Lu JS,et al.Clinico-pathological features of ER+/PR+and ER+/PR-breast tumors:a comparative study of 5211 cases[J].Zhonghua Yi Xue Za Zhi,2007,87(39):2764-2767.

（本文編輯 楊 瑛）

Influence of Hydroxysafflor Yellow A on Related Protein Expression of Estrogenic Effects

CHEN Meng,ZHAO Piwen*,SUN Liping,WU Hongbo,ZHAO Di
(School of Preclinical Medicine,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China)

ObjectiveTo explore the effect of hydroxylsafflor yellow A (HSYA)on related protein of estrogenic effect.MethodsThe positive cells T47D and ER,and negative cells SK-BR-3 of estrogen receptor(ER)were cultured,and 1×10-7mol/L×10-9mol/L of HSYA act on this two cells.,negative cells SK-BR-3.The expression of protein ERα,ERβ,extracellular regulated protein kinases 1/2(ERK1/2),p-ERK1/2,Progesterone Receptor(PR),P27 was detected by Western Blot.ResultsCompared with the blank control group,the high concentration HSYA promoted the expression of Erα,ERβ,ERK1/2,p-ERK1/2,PR,while inhibite the expression of P27 in T47D cells (P＜0.01).HSYA showed significant inhibitory effects on ERK1/2,while had no obvious effects on p-ERK1/2 in SK-BR-3 cells (P＞0.05).ConclusionHSYA has different influnces on related protein of estrogenic effect in the cells,which possiblly through regulating the expression of ER and activating the ERK signaling pathway.

hydroxysafflor yellow A;Western Blot;T47D cell;SK-BR-3 cell

R285.5；R393

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2017.11.012

本文引用：陳 夢，趙丕文，孫麗萍，武虹波，趙 笛.羥基紅花黃色素A對雌激素效應相關蛋白表達的影響[J].湖南中醫藥大學學報，2017，37（11）：1218-1221.

2016-12-23

國家自然科學青年基金（81673764）；北京中醫藥大學自主科研課題（2017-JYB-JS-001）。

陳 夢，女，碩士，實驗師，研究方向：植物雌激素的藥理作用研究。

* 趙丕文，女，博士，教授，E-mail：pwzhao@263.net。