成年SD大鼠胃竇Cajal間質(zhì)細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒定

張程程，彭 艷，陳海交，楊建文，劉薇薇，劉 麗

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院針灸生物信息分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

成年SD大鼠胃竇Cajal間質(zhì)細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒定

張程程，彭 艷*，陳海交，楊建文，劉薇薇，劉 麗

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院針灸生物信息分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

目的探討成年SD大鼠胃竇起搏細(xì)胞Cajal間質(zhì)細(xì)胞（interstitial cells of cajal,ICC）的原代分離、培養(yǎng)及鑒定方法，為深入研究其生理功能提供條件。方法8～9周齡SD成年大鼠，禁食24 h，乙醚吸入麻醉，頸椎脫臼處死。無(wú)菌條件下采用精細(xì)解剖方法快速取出胃竇平滑肌組織，將其剪成1～2 mm3小塊后，使用II型膠原酶消化法于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化60 min，離心后過(guò)200目篩，接種于DMEM/F12完全培養(yǎng)基（含5 ng/mL干細(xì)胞因子）中進(jìn)行培養(yǎng)。用酪氨酸蛋白激酶受體ckit特異性抗體免疫熒光染色鑒定細(xì)胞類(lèi)型。結(jié)果培養(yǎng)72 h后，于倒置顯微鏡下觀察，可見(jiàn)細(xì)胞貼壁，呈不規(guī)則三角形、星形或梭形，有多個(gè)突起；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，各突起彼此相互連接形成網(wǎng)絡(luò)；此原代培養(yǎng)細(xì)胞c-kit抗體免疫熒光染色呈陽(yáng)性。結(jié)論 成功建立了一套由成年SD大鼠胃竇組織采用II型膠原酶消化法原代培養(yǎng)ICC的方法，為ICC的生理功能、病理改變以及胃腸道生理與病理關(guān)系的研究奠定了基礎(chǔ)。

胃竇；Cajal間質(zhì)細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

良好生命活動(dòng)的維持是以機(jī)體通過(guò)胃腸道正常消化吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為生理基礎(chǔ)。而胃腸道神經(jīng)元、平滑肌細(xì)胞以及Cajal間質(zhì)細(xì)胞(interstitial cells of cajal，ICC)的協(xié)調(diào)作用是維持正常的胃腸消化吸收的必要條件[1]。研究證實(shí)，ICC是胃腸運(yùn)動(dòng)的自發(fā)性起搏細(xì)胞，主要分布于消化道自主神經(jīng)末梢和平滑肌細(xì)胞之間，具有產(chǎn)生并傳播慢波、介導(dǎo)神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞以及調(diào)節(jié)某些胃腸激素的功能[2-4]。因此目前認(rèn)為ICC在產(chǎn)生和維持正常胃腸生理功能中扮演著非常重要的角色。研究發(fā)現(xiàn)，多種胃腸運(yùn)動(dòng)障礙性疾病如慢傳輸型便秘、糖尿病胃輕癱、功能性消化不良等均可見(jiàn)ICC的病理改變，包括ICC數(shù)量的減少、超微結(jié)構(gòu)及表型等的改變[5-7]。故此探討一種穩(wěn)定、持續(xù)的體外培養(yǎng)ICC的方法無(wú)論對(duì)基礎(chǔ)研究或是臨床治療胃腸運(yùn)動(dòng)障礙相關(guān)疾病均有重大的意義。目前，國(guó)內(nèi)外普遍采用幼年動(dòng)物分離ICC，而且常見(jiàn)于小腸組織，少見(jiàn)從成年大鼠胃竇中分離并培養(yǎng)ICC的研究。本實(shí)驗(yàn)采用Ⅱ型膠原酶消化法，以成年SD大鼠胃竇作為組織來(lái)源，成功建立一套體外原代分離、培養(yǎng)ICC的方法，擬為進(jìn)一步研究ICC的生理功能、病理改變及胃腸道生理與病理關(guān)系的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 正常8～9周齡清潔級(jí)SD成年大鼠，雌雄不限，體質(zhì)量220～250 g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK（湘）2011-0003。飼養(yǎng)溫度25℃，相對(duì)濕度50%～70%，自由攝食、飲水。

1.1.2 主要儀器設(shè)備 IX2-ILL100型倒置顯微鏡，日本Olympus公司；TCL16M型高速冷凍離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀貝克儀器儀表公司；CBV-1500A型超凈工作臺(tái)，上海瑞仰凈化設(shè)備廠；DW-86L26型超低溫冰箱，海爾公司；外科手術(shù)器械，上海醫(yī)療器械廠。

1.1.3 主要試劑及藥品 DMEM/F12培養(yǎng)基、Ⅱ型膠原酶（100 mg/支）、鼠尾膠原蛋白Ⅰ型（2 mL:10 mg），均購(gòu)自北京Solarbio公司；磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/LPBS，pH=4，500 mL/瓶）購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；D-Hanks緩沖液（500 mL/瓶）購(gòu)自天津?yàn)笊锕荆惶ヅＱ澹‵BS，100 mL/瓶）、雙抗（青霉素 10 000 U/mL，鏈霉素10 000 U/mL），均購(gòu)自英國(guó)Hyclone公司；大鼠重組干細(xì)胞因子（SCF，1 μg/支）購(gòu)自美國(guó)Peprotech公司；PE 標(biāo)記的兔抗大鼠 CD117（c-kit）熒光抗體（1 mL∶0.2 mg）購(gòu)自 eBioscience 公司；胰酶抑制劑 （100 mg/支）、 臺(tái)盼藍(lán) （5 g/瓶）、 牛血清白蛋白（BSA，5 g/支），均購(gòu)自 sigma 公司；ATP（2 mL∶20 mg）購(gòu)自湖北天藥公司等。

1.1.4 主要溶液的配制 （1）Ⅱ型膠原酶、胰蛋白酶抑制劑均以PBS緩沖液配制成終濃度為10 mg/mL的工作液，并以0.22 μm真空濾菌器除菌，分裝，-20 ℃凍存?zhèn)溆茫唬?）牛血清白蛋白（BSA）以PBS緩沖液配制成終濃度為4 mg/mL的工作液；（3）干細(xì)胞因子（SCF）以無(wú)菌水配制成終濃度為1 ng/μL的工作液；（4）配制5 mLⅡ型膠原酶消化液（ 含Ⅱ型 膠 原 酶 1.2 mg/mL、ATP0.27 mg/mL、BSA 2 mg/mL、胰蛋白酶抑制劑2 mg/mL），將消化液過(guò)濾除菌，4℃保存?zhèn)溆茫唬?）配制20 mL DMEM/F12完全培養(yǎng)基 （含DMEM/F12培養(yǎng)基，2%雙抗，10%FBS，5 ng/mL SCF），4 ℃保存?zhèn)溆茫唬?）臺(tái)盼藍(lán)溶液：臺(tái)盼藍(lán)4.0 g，溶于100 mL超純水，4 ℃保存，使用時(shí)用 PBS 稀釋至 0.4%，室溫下保存；（7）鼠尾膠原溶液：用 0.006 mol/L(0.36 g/L)無(wú)菌乙酸將膠原蛋白稀釋到 2.5 μg/mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 ICC細(xì)胞分離 大鼠禁食不禁水24 h后采取乙醚吸入麻醉，頸椎脫臼法處死，完全浸入75%乙醇溶液中1 min；無(wú)菌條件下打開(kāi)腹腔，自賁門(mén)、幽門(mén)剪切開(kāi)，取出胃組織，放入盛有0.01 mol/L PBS(含2%雙抗)的無(wú)菌平皿里；在解剖顯微鏡下用眼科剪、眼科鑷銳性剝除血管及胃漿膜層，將胃組織沿胃小彎剖開(kāi)，剪取胃竇部，用4℃的D-Hanks液反復(fù)沖洗胃內(nèi)容物3～4次；解剖顯微鏡下銳性剝除胃竇部黏膜、黏膜下層及漿膜層，再將僅剩肌層的胃竇組織置入4℃的D-Hanks液中，漂洗兩次，用眼科剪將組織剪碎至大小約為1～2 mm3。將組織塊移至離心管內(nèi)，加入3～4倍于組織體積的Ⅱ型膠原酶消化液，放入培養(yǎng)箱內(nèi)37℃消化60 min，期間每隔15分鐘輕輕吹打10次，加入等體積的DMEM/F12完全培養(yǎng)基終止消化，1 000 r/min離心5 min，棄上清，DMEM/F12 重懸，1 000 r/min 離心 5 min，棄上清，DMEM/F12重懸，反復(fù)輕輕吹打3～5 min，過(guò)200目篩網(wǎng)。并以0.4% 臺(tái)盼藍(lán)染色鑒定細(xì)胞狀態(tài)并計(jì)數(shù)，倒置顯微鏡下觀察，死細(xì)胞被染成藍(lán)色，活細(xì)胞未被染色，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/cm2。

1.2.2 ICC細(xì)胞培養(yǎng) 用DMEM/F12完全培養(yǎng)基將細(xì)胞接種至6孔培養(yǎng)板（預(yù)先放置包被鼠尾膠原蛋白的爬片）中，然后放入培養(yǎng)箱內(nèi)，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。72 h后換為不含有青霉素和鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基。此后每3天換液一次，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，每次觀察不超過(guò) 30 min，觀察的同時(shí)進(jìn)行攝像。

1.2.3 ICC免疫熒光染色 為確定培養(yǎng)的細(xì)胞是否為ICC，采用國(guó)際通用的c-kit免疫熒光抗體對(duì)所培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色鑒定。染色主要步驟：去除培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)基，用0.01 mol/L PBS漂洗3次,每次5 min；4%多聚甲醛液室溫下固定 20 min，0.01 mol/L PBS漂洗 3次,每次5 min；用5%的山羊血清室溫下封閉30 min；加入PE標(biāo)記的兔抗大鼠c-kit單克隆抗體（用 0.01 mol/L PBS 稀釋 1∶100）3 mL，37 ℃條件下靜置30 min后放入4℃冰箱過(guò)夜；次日取出后再于37℃條件下靜置 30 min，PBS漂洗3次，每次5 min；在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞并攝像。

2 結(jié)果

2.1 倒置顯微鏡下所見(jiàn)ICC形態(tài)學(xué)變化

在倒置顯微鏡下觀察，培養(yǎng)72 h后，細(xì)胞穩(wěn)定貼壁，細(xì)胞邊界清晰，細(xì)胞透亮度可，呈梭形、三角形或星形，細(xì)胞核大，細(xì)胞質(zhì)較少，可見(jiàn)部分細(xì)胞有2～3個(gè)明顯短突起，但突起之間未見(jiàn)明顯連接，而且ICC特有的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)不太明顯（圖1A）。培養(yǎng)1周時(shí)細(xì)胞的形態(tài)未見(jiàn)明顯變化，可能與成年大鼠細(xì)胞呈高分化狀態(tài)有關(guān)，生長(zhǎng)緩慢（圖1B）。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至約2周時(shí)可見(jiàn)細(xì)胞形態(tài)愈來(lái)愈清晰，突起也逐漸由粗短變?yōu)榧?xì)長(zhǎng)，并相互連接形成明顯的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，具備ICC的形態(tài)特點(diǎn)（圖1C）。到第4周以后，細(xì)胞逐漸呈凋亡狀態(tài)，細(xì)胞核皺縮，透亮度降低，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)稀疏（圖1D）。

圖1 ICC體外培養(yǎng)不同時(shí)期倒置顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)（×400）

2.2 熒光顯微鏡下所見(jiàn)ICC形態(tài)學(xué)變化

c-kit陽(yáng)性是目前確認(rèn)細(xì)胞是否為ICC的重要指標(biāo)。選擇培養(yǎng)至2周的細(xì)胞使用免疫熒光法對(duì)其進(jìn)行鑒定。在熒光顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞胞體呈紅色熒光染色即c-kit陽(yáng)性。據(jù)免疫表型分析可證實(shí)培養(yǎng)所得c-kit陽(yáng)性細(xì)胞為ICC，而不是平滑肌細(xì)胞（見(jiàn)圖2）。并且根據(jù)細(xì)胞形態(tài)，可排除肥大細(xì)胞可能。

圖2 Cajal間質(zhì)細(xì)胞的免疫熒光染色（×400）

3 討論

根據(jù)ICC的形態(tài)以及其在胃腸道的分布位置將其分為肌間、肌內(nèi)、深肌叢及黏膜下四種類(lèi)型，其中肌間ICC和粘膜下ICC主要參與胃腸起搏活動(dòng)[8]。ICC不僅可自發(fā)性去極化，產(chǎn)生慢波，是胃腸道的起搏細(xì)胞，ICC尚在胃腸神經(jīng)和胃腸平滑肌之間扮演著中間媒介角色，胃腸生理功能的正常運(yùn)行同時(shí)受迷走神經(jīng)、內(nèi)臟神經(jīng)和腸神經(jīng)系統(tǒng)的共同支配，其中腸神經(jīng)系統(tǒng)起主導(dǎo)作用[9]，而腸神經(jīng)末梢神經(jīng)元通過(guò)與ICC形成的突觸連接將信號(hào)傳遞給 ICC，后者通過(guò)與平滑肌細(xì)胞形成的縫隙連接將信號(hào)傳遞給平滑肌細(xì)胞，故此胃腸神經(jīng)－ICC－平滑肌細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)引起并調(diào)節(jié)胃平滑肌節(jié)律性的相位收縮活動(dòng)，在胃運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，ICC的病理改變?nèi)缙鋽?shù)量的減少、形態(tài)結(jié)構(gòu)的異常等可導(dǎo)致臨床上多種胃腸動(dòng)力障礙性疾病[10-12]。

為了研究胃腸動(dòng)力障礙性疾病的發(fā)病機(jī)制，探討ICC細(xì)胞功能及起搏特性，建立一種體外分離、培養(yǎng)ICC的方法便顯得具有重要意義。而以成年大鼠為模型，則更貼近于臨床。培養(yǎng)ICC的方法主要包括組織塊培養(yǎng)法和酶解法。而組織塊培養(yǎng)法適用于細(xì)胞增殖活躍的幼年動(dòng)物[13]，成年大鼠細(xì)胞已呈高度分化狀態(tài)，故不適用。成年大鼠胃竇ICC與平滑肌細(xì)胞、結(jié)蹄組織及膠原纖維等連接緊密，分離難度很大，劉勇等[14]應(yīng)用Ⅱ型膠原酶消化法分離成年Wistar大鼠胃竇ICC，獲得成功，本實(shí)驗(yàn)以其為參考，并采用成年SD大鼠胃竇為組織來(lái)源，根據(jù)文獻(xiàn)[15-16]，采用Ⅱ型膠原酶消化法培養(yǎng)成年SD大鼠胃竇Cajal間質(zhì)細(xì)胞，為今后基礎(chǔ)研究提供了一種體外原代分離、培養(yǎng)胃竇ICC的方法。

胃腸道內(nèi)幾乎所有ICC都特異性表達(dá)酪氨酸激酶受體(c-kit)，其配體為干細(xì)胞因子（stem cell factor,SCF）。SCF、c-kit特異性結(jié)合，形成二聚體，活化酪氨酸激酶，啟動(dòng)了一系列酸化過(guò)程，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育和分化[17]。近年來(lái)c-kit免疫組化染色法成功應(yīng)用于ICC的研究當(dāng)中，成為ICC細(xì)胞表型的一種特異性標(biāo)志物，本實(shí)驗(yàn)體外分離培養(yǎng)所得的Cajal間質(zhì)細(xì)胞經(jīng)藻紅蛋白免疫熒光表型分析，在熒光顯微鏡下觀察可見(jiàn)細(xì)胞胞體呈紅色熒光染色即c-kit陽(yáng)性。c-kit廣泛表達(dá)于多種組織細(xì)胞，如各種造血細(xì)胞、生殖細(xì)胞、肝細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等，但在胃腸道，只有ICC和肥大細(xì)胞特異性表達(dá)c-kit，而且肥大細(xì)胞主要分布于胃黏膜、黏膜下層，在準(zhǔn)備平滑肌組織過(guò)程中絕大部分已被去除，可忽略不計(jì)，且肥大細(xì)胞形狀為圓形，可與ICC鑒別。因此培養(yǎng)所得c-kit陽(yáng)性細(xì)胞為ICC。根據(jù)其細(xì)胞形態(tài)和免疫學(xué)特性，表明ICC在體外原代分離培養(yǎng)成功。

筆者經(jīng)過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)，認(rèn)為在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意以下方面：（1）樹(shù)立嚴(yán)格的無(wú)菌觀念：提前將試劑分裝，并過(guò)濾除菌，于合適溫度下儲(chǔ)存?zhèn)溆茫瑢?shí)驗(yàn)前24 h，大鼠禁食不禁水，為避免大鼠饑不擇食，需清除籠內(nèi)墊料，使胃組織處于相對(duì)潔凈狀態(tài)。乙醚吸入麻醉后，將大鼠全部浸入75%乙醇溶液中1 min，不宜時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，以免大鼠吸入乙醇，影響實(shí)驗(yàn)；（2）因成年大鼠細(xì)胞呈高分化狀態(tài)，培養(yǎng)難度大，在ICC的分離接種以及鏡下觀察時(shí)應(yīng)盡量縮短時(shí)間，有利于細(xì)胞的存活；（3）相比于劉勇只選用Ⅱ型膠原酶進(jìn)行酶解[14]，本實(shí)驗(yàn)在酶解液中加入胰蛋白酶抑制劑、BSA、ATP，并控制好酶濃度及消化時(shí)間，以求將細(xì)胞損害降到最小；（4）制作細(xì)胞爬片很重要，決定其貼壁成功與否，應(yīng)提前用無(wú)菌2.5 μg/mL鼠尾膠原包被玻片，于培養(yǎng)箱中烘干待用；（5）培養(yǎng)72 h后ICC細(xì)胞貼壁，培養(yǎng)基顏色改變，提示可進(jìn)行換液，這與文獻(xiàn)相符[2]。故認(rèn)為使用Ⅱ型膠原酶消化法培養(yǎng)ICC時(shí)可在72 h后進(jìn)行換液操作，這樣既可避免因頻繁移動(dòng)培養(yǎng)皿而引起貼壁不牢，還可減少污染的機(jī)會(huì)，換液既能保證細(xì)胞有合適的生長(zhǎng)環(huán)境，也能去除未貼壁的細(xì)胞，避免其對(duì)培養(yǎng)環(huán)境及細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生影響；（6）考慮抗生素會(huì)減緩細(xì)胞生長(zhǎng)，故72 h后換為不含抗生素的DMEM/F12培養(yǎng)基；（7）盡量減少機(jī)械損傷：筆者使用眼科鑷銳性刮除黏膜及黏膜下層，避免了對(duì)胃竇組織過(guò)度的牽拉或擠壓，減少了對(duì)組織內(nèi)ICC的破壞和損傷；（8）吹打細(xì)胞時(shí)動(dòng)作應(yīng)輕柔，宜選用口徑較大的吸管緩慢吹打；（9）SCF是ICC生長(zhǎng)發(fā)育所必需的，參照國(guó)外相關(guān)文獻(xiàn)[18-19]，本實(shí)驗(yàn)在培養(yǎng)基中加入5 ng/mL的SCF，此濃度下ICC細(xì)胞可穩(wěn)定地發(fā)育。

綜上所述，在借鑒前人研究的基礎(chǔ)上，使用Ⅱ型膠原酶消化法成功建立了一套由成年SD大鼠胃竇原代培養(yǎng)ICC的方法，為研究ICC的生物學(xué)特性及其與胃腸道動(dòng)力障礙性疾病的關(guān)系提供了細(xì)胞模型。

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（本文編輯 楊 瑛）

Isolation,Culture and Identification of Interstitial Cells of Cajal in Gastric Antrum of Adult Rats

ZHANG Chengcheng,PENG Yan*,CHEN Haijiao,YANG Jianwen,LIU Weiwei,LIU Li
（Key Acu-Moxibustion Laboratory of Biological Information Analysis,Institute of Acupuncture,Moxibustion and Massage,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China）

ObjectiveIn order to provide the conditions for further study of its physiological function,the method of isolation,culture and identification of interstitial cells of Cajal (ICC)in the gastric antrum of adult SD rats was investigated.MethodsSD rats at 8-9 weeks,were anesthetized with ether and killed by cervical dislocation.The specimens were cut into 1-2mm3 small pieces,digested with collagenase type II in a 37℃incubator for 60 min,centrifuged and passed through a 200-mesh sieve.The tissues were inoculated in DMEM/F12 complete medium (containing 5 ng/mL stem cell factor).Cell type was identified by immunofluorescence staining using tyrosine protein kinase receptor c-kit specific antibody.ResultsAfter culture for 72 h,the cells adhered to the wall under the inverted microscope,which were irregular triangular,star-shaped,or spindle-shaped,with multiple protrusions.With the prolongation of culture period,the protrusions were connected to each other to form a network.The cells were positive for immunofluorescence staining of c-kit antibody.ConclusionThis study established a method for primary culture of ICC from type II collagenase digestion of gastric antral smooth muscle in adult SD rats.It laid a foundation for the study of the relationship between ICC and gastrointestinal tract in physiological function and pathologic changes.

gastric antrum;interstitial cells of Cajal;cell culture techniques

R965.2

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2017.11.014

2016-11-24

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81403487）；湖南省教育廳青年基金（14B128）。

張程程,女,在讀博士研究生,研究方向:針灸治病機(jī)制的研究。

*彭 艷,女,博士,副教授,E-mail:penyatcm@126.com。

本文引用：張程程，彭 艷，陳海交，楊建文，劉薇薇，劉 麗.成年SD大鼠胃竇Cajal間質(zhì)細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒定[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，37（11）：1226-1230.