冷凍電鏡熱起來

谷第

2017年度的諾貝爾化學獎授予了瑞士洛桑大學科學家雅克·杜邦內特、美國哥倫比亞大學科學家約阿希姆·弗蘭克和英國劍橋大學科學家理查德·亨德森，以表彰他們在開發可以用于研究生物分子高分辨率結構的“冷凍電鏡”技術方面的杰出貢獻。

說起電子顯微鏡，人們或許都不陌生，它是一種分辨率比光學顯微鏡更高，可以看到光學顯微鏡下看不到的微觀世界的儀器。那什么是冷凍電鏡呢？總不會是把電子顯微鏡冷凍起來吧？這種冷凍電鏡技術又為什么能夠用于研究生物分子的結構呢？3位科學家30多年前的研究為什么直到現在才獲得諾貝爾獎委員會的青睞呢？下面就讓我們一一揭開這些問題的答案。

“結構三劍客”

毫無疑問，電子顯微鏡是科學家用來探索微觀世界的利器。但微觀世界也不是一概而論的，在尺度上跨越了多個數量級。

通常說到生物學上的微觀世界，人們想到的大概會是各種寄生蟲和細菌，大小從幾百微米直至幾微米。相比之下，頭發絲直徑大概是不到100微米。要想看清楚這樣的微觀結構，就要借助光學顯微鏡。最好的光學顯微鏡能夠看到細胞內部細胞器的結構，通過一些特殊技術甚至能夠看到單個的蛋白質分子。

說到物理學上的微觀世界，人們想到的大概就是分子和原子了。要想“看”到單個的原子，只有借助掃描隧道顯微鏡或是原子力顯微鏡才行，但這些設備對觀測樣品的限制非常多，實際應用領域比較狹窄。應用得更為廣泛的是電子顯微鏡，雖然它不能直接觀測到單個的原子，但是對于光學顯微鏡下的微觀世界，電子顯微鏡能夠提供更為清晰、分辨率更高、細節更為豐富的照片。

近一個世紀以來，生物學家也有了觀察分子級別，甚至是原子級別微觀世界的需求。再復雜的細胞、細胞器也都是由各種生物分子，特別是蛋白質等生物大分子構成的，要研究這些蛋白質的功能，最直接的方法就是“看到”它們的三維結構，也就是測定構成一個蛋白質分子的成千上萬個原子的三維坐標。研究生物大分子結構的科學就是結構生物學。

要想測定蛋白質的結構可并不容易。蛋白質的大小只有幾納米到幾十納米，比細胞小了1000倍，甚至小于可見光的波長，因此超越了光學顯微鏡的極限。為了描述蛋白質中各個原子的坐標，就連納米這樣的單位都顯得太“大”了，所以生物學家使用了“?！保╝ngstrom）這個長度單位，指10-10米，也就是0.1納米。

為了探索“?！边@個水平上的微觀世界，科學家發展出了三種不同的方法，堪稱“結構三劍客”。它們之中的老大是X射線晶體學，通過X射線在蛋白質晶體上的衍射來計算蛋白質的結構。這種方法發展得最為成熟，應用最為廣泛，觀測到的蛋白質結構分辨率也最高，能夠達到1埃的水平，清晰地分辨出每一個原子的準確位置。但是X射線晶體學首先需要把蛋白質結晶，而蛋白質并不都能老老實實地排列成整齊的晶體，因此限制了這種方法的應用。

三劍客中的老二是核磁共振方法。這種方法無需結晶，可以直接測定溶液中的蛋白質結構，但是卻有蛋白質大小方面的限制。太大的蛋白質產生的核磁共振譜圖過于復雜，重疊嚴重，變得無法解讀。另外，由多個蛋白質組成的蛋白質復合物也難以用核磁共振的方法直接觀測結構。

結構三劍客中的最后一位就是電子顯微鏡。雖然電子顯微鏡用電子束代替了光束，所以在理論上能夠超越可見光波長的限制，但在實際觀察生物大分子結構時卻遇到了很多困難。本年度諾貝爾化學獎3位得主所做的工作，正是從不同的角度解決這些困難。

二維的晶體

電子顯微鏡研究生物大分子結構的第一個困難就是電子束本身的強大破壞力。簡單來說，電子束中的電子是帶著速度而來的，如果它們與樣品發生了相互作用，也就意味著它們“撞”到了樣品上。這個撞擊產生的能量要樣品自己來吸收，從而會導致樣品的毀壞。很多無生命的樣品在電子束的轟擊之下都會發生明顯可見的破壞，更不要說脆弱的蛋白質了。

怎么辦呢？要說辦法也簡單，誰都能想得到，那就是減弱電子束的強度，減弱到不會明顯破壞蛋白質樣品的程度。可是，問題又來了：太弱的電子束成像也弱，如何能夠得到清晰的電子顯微鏡成像呢？理查德·亨德森的貢獻就在于此。他本來是從事X射線晶體學方法研究的。從這種經典方法中，他得到了啟發，想到可以將二維晶體應用于電鏡研究。我們所說的晶體，一般都是指三維晶體，其中的原子或分子在任意一個方向上都是周期排列的。X射線晶體學方法之所以能夠得到微觀結構信息的宏觀信號，就是靠周期排列的晶格產生的X射線衍射作用。可是，三維的晶體太厚，電子束穿透的損耗太大。亨德森讓特定的蛋白質形成了二維的晶體，也就是薄薄的一層在水平方向上有序排列的蛋白質，再讓電子束去照射它，通過晶格的衍射來增強信號。

1990年，亨德森應用二維晶體方法解析得到了細菌視紫紅質蛋白的三維結構。這種蛋白是一種膜蛋白，我們的眼睛能夠看到光線，依賴的也正是視紫紅質蛋白。略有遺憾的是，在此兩年前，已經有結構生物學家通過X射線晶體學的方法解析得到了該蛋白的結構，從而使亨德森與相關諾貝爾獎失之交臂。但是，亨德森得到的結構是最早的應用電子顯微鏡技術測定得到的生物大分子結構。

全息“逮捕照”

我們在歐美電影中看到不少這樣的情節：犯罪嫌疑人被警察抓獲之后，都會舉著自己的名牌在標尺墻前照3張照片——正面、左面、右面各一張。毫無疑問，這3張逮捕照的作用就是用來建立這名犯罪嫌疑人的樣貌檔案，以后如果在其他罪案有關的影像資料中拍到這個人，就可以很容易地進行比對識別了。我們不妨設想一下，如果不僅是建立一個人的平面照片檔案，而是要建立一個人頭部的三維立體模型呢？其實也不困難，只要360°無死角地給他拍一系列的頭像照片就行了。如今的計算機建模程序已經可以輕松完成這樣的任務。

那么，對于生物大分子的結構研究，可不可以照搬這個思路呢？約阿希姆·弗蘭克給出了肯定的答案。他在20世紀80年代提出并完善了電子顯微鏡單顆粒重構技術，不再需要讓蛋白質形成二維的晶體。說起來，二維晶體只是薄薄一層，似乎比形成三維晶體容易了許多，但其實二維結晶的難度與三維結晶并無太大分別。而單顆粒重構技術，顧名思義只需要單個蛋白質顆粒即可，無需任何形式的結晶。

具體來說，弗蘭克首先要給散落在載網上的同一種蛋白質分子拍攝電子顯微鏡“照片”。拍照時，有的蛋白質可能是“正面”朝上，有的可能是“底面”朝上，也有可能是“左面”朝上，或者“右面”朝上。如果拍攝足夠多的樣品，有了足夠多的照片之后，弗蘭克就可以得到這種蛋白質在各個不同方向上的“照片”，就好像是全息的“逮捕照”一樣。最后，通過數學計算的方法就能夠重構這種蛋白質的三維結構模型。

你或許會想到一個問題：蛋白質分子不只是表面有原子，里面也有原子，如果只能拍到表面的照片，如何知道里面的結構信息呢？其實，這里說的“照片”并不是真正的照片，因為它是在樣品底下接收到的電子束透射之后形成的投影影像。這種投影也跟陽光下的純黑影子不同，因為電子束是從蛋白質中穿透而過的，所以受到了蛋白質內部原子的影響，帶有了內部的結構信息。正因為如此，最終重構出來的才是蛋白質完整的三維結構。

冰的玻璃

亨德森和弗蘭克的貢獻似乎已經足以解決用電子顯微鏡研究蛋白質結構的問題了，但還少了一項重要技術，也就是冷凍電鏡技術中的“冷凍”二字，它來自于雅克·杜邦內特的貢獻。

我們都知道，生命離不開水。活細胞中每時每刻都發生著難以計數的生物化學反應，其中很多反應都有水分子的參與。而這還不是水對我們的唯一意義。如果我們能夠縮小到原子水平的微觀世界里直接觀察，就會發現水溶液中的蛋白質表面牢牢地抓著幾層水分子，甚至還有水分子緊密地結合到蛋白質的內部。這些水化層就是蛋白質表面的潤滑劑，是蛋白質能夠溶于水并發揮功能的關鍵所在。可以說，離開了水的蛋白質就不是蛋白質的真實模樣了。

科學家希望看到蛋白質的真實模樣，所以核磁共振是在水溶液中測量的，X射線晶體學的晶體是在水溶液中形成的，其內部充滿了水。然而電子顯微鏡卻有一個先天的不利因素：為了減低電子束與空氣分子的撞擊帶來的種種問題，電子顯微鏡內部必須是絕對的真空環境。而在真空環境中，液態的水立刻就會汽化。好在水還有一種固體狀態，那就是冰。冰可以在低溫下于真空中穩定存在。可是，冰也有冰的問題。雖然一塊冰整體上不是一個有序的晶體，但它其實是由無數微小的有序晶體組成的。所以在電子束的照射下，冰也會產生衍射，擾亂生物大分子本身的成像。

雅克·杜邦內特在20世紀80年代找到了解決這個問題的辦法，那就是讓水形成玻璃態的冰，也就是水分子仍然呈無序狀態的冰。要做到這一點，就要讓樣品迅速降溫，不給它結晶的時間。一般科學實驗中用到低溫環境時都會選擇液氮，它化學上穩定，成本低，溫度也足夠低。但液氮卻無法滿足杜邦內特的要求，因為它的熱容量太小，一接觸常溫的樣品就被加熱汽化了，在樣品周圍形成一個氮氣的隔熱層，阻止了進一步的快速降溫。最終，杜邦內特選擇了熱容量足夠大的液態乙烷，能夠讓樣品瞬間降到接近零下200℃的溫度，形成玻璃態的冰。這種方法一直延用至今，仍是用電子顯微鏡研究生物大分子結構時的最佳制樣方法。

向“埃”靠攏

許多人或許會好奇：這3位科學家的貢獻都已經是三四十年前的事情了，為什么諾貝爾獎委員會直到現在才頒獎給他們？事實上，雖然通過3位科學家的努力，冷凍電鏡三維重構技術被用于蛋白質等生物大分子的結構研究，但是其分辨率一直比較低，徘徊在10埃以下，只有個別結構能夠接近X射線晶體學的水平。而X射線晶體學的結構則能夠輕松達到3埃以上的近原子分辨率水平。由于冷凍電鏡結構的分辨率太低，無法精確定位原子坐標，無法提供結構細節，其應用就被大大限制了。

這種境況一直到近兩三年來才有明顯的改觀，而其來源仍是技術的進步。在眾多電鏡技術的改進之中，最為重要的或許就是華人科學家程亦凡等人開發成功的直接對電子束成像的元器件。這種成像方式拋棄了原來通過接收電子束轟擊來顯像的熒光屏，改由微電子元件直接感受電子流，就像用CCD感受光線一樣，從而大大提高了成像的清晰度，而且使得即時成像成為可能。有了即時成像技術，科學家就可以拍攝一段電子顯微成像的視頻，再分解成一幀幀的靜止畫面，把這些畫面重新校準疊合，就能夠有效解決樣品在拍攝過程中的漂移問題，相當于相機用上了數碼防抖功能，從而進一步提高了圖像的清晰度。在這一系列新技術的推動之下，冷凍電鏡方法的分辨率終于開始向“?！钡乃娇繑n。

2013年，程亦凡等人應用新技術解析了人體感受溫度的關鍵蛋白質——辣椒素受體的三維結構，向科學界展示了新型冷凍電鏡技術在結構生物學研究中的美好前景。此后，越來越多的結構生物學家開始嘗試使用冷凍電鏡技術來研究蛋白質結構，并產出了一批高分辨率的重要結構成果。比如像剪切體這樣的細胞器，因為過于巨大，在晶體學研究中被認為是不可能結晶的，而清華大學的施一公團隊利用冷凍電鏡技術已經成功解析了它的三維結構。在這種生物大分子組成的巨大“分子機器”的結構研究方面，冷凍電鏡技術擁有著X射線晶體學和核磁共振技術都難以企及的巨大優勢。

如今，冷凍電鏡三維重構是結構生物學界最為炙手可熱的研究方向。程亦凡、施一公等人的工作雖然沒有為他們自己帶來諾貝爾獎，卻間接促成諾貝爾獎花落電鏡領域。可以想見，這次頒獎必然會進一步喚起科學界對于冷凍電鏡技術的重視與熱情?，F在，大多數冷凍電鏡結構的分辨率仍然在3埃左右，只有個別案例能夠達到2埃左右，但隨著更多新技術新方法的涌現，它必然會堅定地朝著1埃的原子分辨率水平邁進，成為與X射線晶體學同等重要的結構生物學方法。

【責任編輯】龐 云