乙醇生物標志物的研究及應用進展

馮雪伊，沈 敏

（1.司法鑒定科學研究院 上海市法醫(yī)學重點實驗室 上海市司法鑒定專業(yè)技術服務平臺，上海200063；2.上海市公安局 靜安分局 刑偵支隊刑事科學技術研究所，上海200070）

鑒定綜述Review

乙醇生物標志物的研究及應用進展

馮雪伊1，2，沈 敏1

（1.司法鑒定科學研究院 上海市法醫(yī)學重點實驗室 上海市司法鑒定專業(yè)技術服務平臺，上海200063；2.上海市公安局 靜安分局 刑偵支隊刑事科學技術研究所，上海200070）

酒精濫用已成為重大的公共衛(wèi)生問題，是世界衛(wèi)生組織公布的第三大致死致殘元兇，因而在所涉交通事故、酗酒肇事、職業(yè)衛(wèi)生、毒品濫用、毒物中毒等案（事）件中，體內(nèi)乙醇檢測及評價已成為法醫(yī)毒物鑒定的重要任務。與乙醇相比，其體內(nèi)生物標志物的檢測表現(xiàn)出更多的優(yōu)勢，具有靈敏度高、特異性強、檢測時限寬、鑒別能力強、應用領域廣等特征。綜述了乙醇的直接生物標志物乙基葡萄糖醛酸苷、硫酸乙酯和脂肪酸乙酯的研究及應用情況，以期推動法醫(yī)毒物鑒定的進步，為訴訟及社會證明活動提供更加科學、可靠、有效的證據(jù)信息。

乙醇生物標志物；酒精濫用；乙基葡萄糖醛酸苷；硫酸乙酯；脂肪酸乙酯

酒精（乙醇）飲料的濫用是全世界廣泛關注的公共衛(wèi)生問題，過量飲酒不僅會造成個體生理機能損害，還會影響正常的行為判斷能力從而帶來社會、經(jīng)濟、法律等一系列相關問題[1]。中國人口基數(shù)大、酒文化源遠流長，現(xiàn)代化的生活方式促進了酒精的需求和消耗，加之國家對酒管控政策相對薄弱，我國飲酒人數(shù)日益增長，為酒精相關問題的產(chǎn)生提供了環(huán)境條件。《柳葉刀》公布了中國人均飲酒量自1987年以來翻升三倍以上[2]；2013年全球疾病負擔報告顯示，中國15歲至49歲人群中因飲酒導致的傷殘調(diào)整壽命年損失數(shù)最大，造成年均12萬人死亡[3]。常規(guī)的酒精檢測限于乙醇清除速率快（10 mg/dL·h[4]），一次過量飲酒24 h后便難以檢出，因而單憑血液乙醇濃度在某些情況下無法認定個體攝酒與否。與此同時，利用受試者的生物樣本對乙醇生物標志物進行檢測，可區(qū)分日常飲酒、酗酒、慢性酒精依賴以及外源性乙醇污染等情況；在死后毒物學領域，則可為揭示血液乙醇來源，判斷生前飲酒和死后生成等提供輔助證據(jù)。

國內(nèi)外專家學者將乙醇生物標志物分為兩類：間接生物標志物和直接生物標志物。其中間接生物標志物是指一類能指示因酗酒引起的正常生理過程或病理過程的改變、抑或是影響藥物反應的物質，常見的有丙氨酸轉氨酶（Alanine aminotransferase，ALT）、天門冬氨酸轉氨酶（Aspartate aminotransferase，AST）、平均紅細胞體積（Mean Corpuscular Volume，MCV）、γ-谷氨酰轉移酶（γ-glutamyl transferase，γ-GT）、糖缺乏性轉鐵蛋白（Carbohydrate-deficient transferring， CDT）、總血清唾液酸（Total serum sialic acid，TSA）等。由于此類標志物不是由乙醇代謝形成，而是由酒精性器官損傷而間接產(chǎn)生，僅能標志長期酗酒行為。在診斷酒精相關障礙方面的敏感性及特異性有限，還受性別、年齡以及非飲酒導致的共病障礙（酶水平升高）等影響，在實際使用中往往出現(xiàn)假陰性或假陽性等問題[5-7]。直接生物標志物為酒精的代謝產(chǎn)物，僅在有乙醇攝入的情況下存在，在體內(nèi)停留時間長于乙醇，主要包括乙基葡萄糖醛酸苷（Ethyl glucuronide，EtG）、硫酸 乙 酯 （Ethyl sulfate，EtS）、脂肪酸乙酯（Fatty acid ethyl esters， FAEEs）和磷脂酰乙醇（Phosophatidylethanol，PEth）。 直接標志物不受疾病、生理因素影響，敏感性和特異性較間接標志物大大提高，能區(qū)分各類飲酒情況，包括少量飲酒行為，在戒癮監(jiān)測、法醫(yī)學鑒定、駕駛能力評估、復職檢測、子女監(jiān)護權判定、肝臟移植評估、胎兒酒精綜合癥研究等領域均有所涉及，為預防、診斷、治療相關酒精問題提供了全新的思路和方法[8-9]。本文將圍繞常用于鑒別酒精濫用的直接生物標志物EtG、EtS和FAEEs的研究及應用進展，作一綜述。

1 EtG和EtS

1.1 EtG和EtS的來源

酒精攝入人體后，大部分經(jīng)氧化途徑由肝臟代謝（90%~95%），或經(jīng)腎臟、皮膚及呼吸道排出體外（5%）。僅少部分乙醇經(jīng)非氧化途徑轉變成乙基葡萄糖醛酸苷（Ethyl glucuronide，EtG）（約 0.5%~1.6%）和硫酸乙酯（Ethyl sulfate，EtS）（約 0.1%）。 乙基葡萄糖醛酸在UDP-葡萄糖醛酸轉移酶（UGT）的催化下與乙醇共軛生成EtG，胞質中的硫酸磺基轉移酶催化硫酸與磷酸腺苷共軛生成EtS，乙醇的清除速率遠大于EtG，EtG能夠在乙醇無法檢出的情況下成為酒精攝入的有力證據(jù)[10-11]。EtG和EtS均為高靈敏標志物，即使在低水平的乙醇暴露下同樣能夠檢出[12]。

1.2 生物樣品中EtG和EtS的研究現(xiàn)狀

1.2.1 尿液分析

EtG主要經(jīng)尿排除，占攝入酒精量的0.02%~0.06%，早在1995年Schmidt等首先在尿液中檢測到 EtG；2004年，Helander等在人體尿液中測得EtS。人體攝入0.25 g/kg（乙醇攝入量/體重）酒精后，尿中EtG和EtS的檢測時限可達24 h，當攝入量為0.5 g/kg時，檢測時限可達48 h[13-15]。文獻報道乙醇在人體內(nèi)消除后3~5 d內(nèi)仍能檢出EtG，有利于延長酒精攝入的檢測時限[16-17]。EtG和EtS的代謝形成途徑不同，因此在認定近期酒精攝入的案件當中，同時檢測尿中的EtG和EtS有助于提高分析方法的可靠性。Helander等[16]對一名健康男性飲酒者進行尿液分析，空腹單次飲酒0.5 g/kg后，乙醇在2 h出現(xiàn)峰值濃度，于8 h后難以檢出。EtG與EtS的濃度-時間曲線的走勢相似，EtS的濃度略高于EtG，兩者均于攝酒后1 h檢出，峰值濃度均出現(xiàn)在4 h。檢測時限相近，飲酒后29 h仍能檢出，32 h后無法檢出。這與Wurst等[18]報道的結果有所差異，平均飲酒0.2 g/kg后，EtG和EtS的尿液檢測時限為36 h，導致的原因可能包括個體飲酒量的差異、機體代謝能力的差異等因素。另外，Helander等還分析了54例臨床酒精檢測的尿樣，EtG與EtS的濃度之間存在良好的相關性（r2=0.839；p<0.0001），平均濃度比（CEtG∶CEtS）約為 1.5。 Kummer等[19]對 27 例攝酒志愿者進行尿液分析，EtG和EtS濃度相關性高（r=0.996，p<0.001）。EtG和EtS均為乙醇的直接代謝產(chǎn)物，是尿液分析的主要檢測對象，具有較高的檢測靈敏度，尤其在樣品收集延遲的情況下，乙醇因快速代謝而難以檢出，EtG及EtS的檢測分析就具有重要的證據(jù)價值。但是，較高的靈敏度容易導致假陽性結果，此時設定合理的檢測界限值（閾值，cut-off）至關重要。目前國際上沒有統(tǒng)一的尿液閾值標準，一般認為 0.1 μg/mL EtG、0.05 μg/mL EtS 能夠有效排除反復飲酒情況[20]；同時對禁酒者的尿液分析發(fā)現(xiàn)，0.1 μg/mL EtG[21]和 0.1 μg/mL EtS[22]可區(qū)分非飲酒和飲酒情況。

1.2.2 血液分析

EtG和EtS的血液分析窗口較短，低劑量酒精攝入下達10 h，高劑量重復攝入下可達24 h[23-25]，血中EtS的檢測時限為乙醇的兩倍，而EtG的檢測時限更長。H?iseth等[15]對10名空腹飲酒0.5 g/kg的志愿者進行血尿分析，血中EtG的峰值濃度時間在4 h，乙醇峰值濃度時間為0.5~2.0h；EtG的消除半衰期為2.2 h，使得EtG比乙醇的可檢測時限更長，血中乙醇檢出時限為5.0~7.0 h，EtG的檢出時限可達10~14 h。尿液的EtG濃度水平明顯高于血液，約為血中EtG濃度的145倍。Halter等[23]對13名適量飲酒的志愿者進行血尿分析，血中EtG和EtS的峰值濃度時間分別為4 h和3 h，與乙醇峰值濃度時間分別相差2.3 h和1.2 h；尿中EtG和EtS的峰值濃度時間分別為6.2 h和5.3 h。雖然尿液的檢測窗口更長、濃度更高，然而尿液分析存在一定的不可控因素，如個體頻繁飲水、頻繁排尿等均會導致尿液中待分析物的濃度降低，造成假陰性結果。同時，血液中兩種物質的檢測時長通常為24 h，血液的短時效性更有利于認定個體近期飲酒甚至當下飲酒的情況。在Lostia等[25]的報道中，19位飲酒者分成兩組，分別給與了不同的飲酒量0.76 g/kg和1.53 g/kg，EtG和EtS的血、尿峰值濃度時間隨著劑量的提高均出現(xiàn)延后現(xiàn)象，而H?iseth等[26]對兩種劑量0.5 g/kg和1.0 g/kg的酒精代謝物研究顯示，高劑量組血液峰值濃度時間有所延后，尿液峰值濃度沒有變化。此種劑量影響藥代動力學因素應受到重視，有助于更客觀、真實地反應濃度隨時間變化趨勢，從而進行相關計算和模型建立。相關文獻報道的血、尿中EtG和EtS的藥代數(shù)據(jù)見表1。

1.2.3 毛發(fā)分析

毛發(fā)作為一種反映長程信息的檢材，檢測窗口長（數(shù)月至數(shù)年），根據(jù)人體毛發(fā)的生長速度，能提供酒精攝入史、區(qū)分日常飲酒與酗酒等重要信息，彌補了血、尿分析的不足。EtG主要通過汗液侵蝕發(fā)干或通過血液擴散到生長細胞的途徑進入毛發(fā)。EtG進入毛發(fā)以后能穩(wěn)定存在，但由于其分子具有弱酸性（pKa=2.84），EtG以極小的速率進入至毛發(fā)，毛發(fā)中的EtG含量少，需要高靈敏的分析手段。近年來，毛發(fā)中EtG已成為判斷酒精攝入與否的重要標志，高靈敏的分析技術不斷涌現(xiàn)，檢出限已從原來的20~50 pg/mg降低至0.7 pg/mg[27-28]，然而要鑒別長期酗酒、日常飲酒以及非飲酒情況，還需標準化的界值來限定，從而防止假陰性或者假陽性結果的產(chǎn)生。國際毛發(fā)分析協(xié)會 （Society of Hair Testing，SoHT）將7pg/mg作為區(qū)分飲酒（乙醇攝入量>10g/d）和非飲酒的閾值，也是鑒別戒酒者是否復飲的一個重要界定指標；同時將30 pg/mg作為區(qū)分長期酗酒（乙醇攝入量>60 g/d）與日常飲酒的閾值[29]。此外，不同學者在結合文獻報道及實驗數(shù)據(jù)的基礎上總結出了不同的臨界值。如Kharbouche等[30]檢測了125個受試者頭發(fā)樣本，設定9pg/mg為區(qū)分風險性飲酒（乙醇攝入量>20/30 g/d）與非飲酒的閾值，25 pg/mg為長期酗酒（乙醇攝入量>60 g/d）的閾值。Politi等[30]使用飲酒問卷調(diào)查表（Drinking Questionaire）進行數(shù)據(jù)分析后得出4 pg/mg和5 pg/mg分別作為鑒別飲酒量（乙醇攝入量>30 g/d及40 g/d）的閾值[31]。Stewart等[32]對200名肝病患者進行毛發(fā)分析，設定15 pg/mg作為飲酒量（乙醇攝入量>28 g/d）的閾值，分析結果準確度高，同時指出性別及疾病因素（如肝硬化）對毛發(fā)中的EtG含量檢測有所影響[32]。最近有學者指出7 pg/mg作為區(qū)分禁酒與飲酒的閾值還有待進一步考察[33-34]。

1.2.4 指甲分析

指甲與毛發(fā)同為硬質角蛋白結構，能夠穩(wěn)定固化外源性物質，不受代謝及排泄影響，檢測窗口長。與尿液檢材相比，指甲與毛發(fā)更能提供豐富的飲酒史信息，有利于鑒別長期飲酒和短期酗酒等情況，同時在戒酒治療監(jiān)測、臨床酒精檢測等方面有所幫助。據(jù)Morini等[35]報道，毛發(fā)可提供的飲酒信息僅限于長期過量飲酒（15~20 g/d），無法甄別短期酗酒情況，而指甲中EtG的濃度遠高于毛發(fā)，有利于區(qū)分不同的飲酒習慣，提供更多的酒精濫用信息。Berger等[36]對447名受試者進行EtG檢測，毛發(fā)中的EtG含量為0~180.5 pg/mg，指甲中的含量為0~397.08 pg/mg；Berger指出指甲中的EtG的定量分析能夠區(qū)分不同程度的風險飲酒情況，對鑒別高風險飲酒及持續(xù)性風險飲酒人群的準確度分別為100%和82%~86%，高于毛發(fā)。

1.2.5 其他生物檢材

非傳統(tǒng)生物樣品如胚胎組織、胎糞、玻璃體液等也是EtG和EtS的重要檢材。孕期酒精暴露會導致胎兒酒精譜系障礙（FAS），引起新生兒嚴重的健康問題如顱面畸形、生長阻滯、認知以及社交障礙等，因此在認定孕期飲酒的證據(jù)信息顯得尤為重要。當新生兒出現(xiàn)FAS癥狀，孕婦較多隱瞞飲酒史而耽誤治療，往往需要通過胚胎組織進行檢測。Goecke等[37]對577名妊娠后女性的胎糞進行乙醇標志物檢測，發(fā)現(xiàn)僅有對EtG的分析符合飲酒史的記錄，同時設定120 ng/g（EtG/胎糞）為孕期飲酒的標志，具有較高的準確度。Morini等[38]分析了70份早期胎盤和胚胎組織（各35份）中的EtG和EtS，兩者的檢測濃度較高，且兩者在胎盤中的濃度均高于胚胎組織，證實EtG與EtS均能夠穿透胎盤屏障進入胚胎組織，強調(diào)EtG和EtS的來源不僅限于胎兒代謝產(chǎn)物更包括母體代謝產(chǎn)物，為孕期飲酒提供有力證據(jù)。

玻璃體液中的EtG和EtS也是酒精分析的重要內(nèi)容，是死后乙醇檢測的主要手段。死后生物檢材中的乙醇濃度受多種因素影響而發(fā)生改變，如乙醇的生物轉換導致的濃度下降、血液腐敗以及上消化道擴散導致的乙醇濃度升高等，成為衡量死前酒精攝入的主要難題。眼睛的解剖學結構決定其具有減速擴散的機能，因此相對于其他生物檢材，外源性物質進入玻璃體液能夠穩(wěn)定存在，較少受尸體腐敗影響[39]。Thierauf等[40]分析了人死后血液、尿液以及玻璃體液中的乙醇、EtG和EtS，發(fā)現(xiàn)血、尿中均存在乙醇、EtG和EtS，玻璃體液中只存在EtG和EtS，且兩者在玻璃體液中的濃度水平較高，表明EtG和EtS系死者生前飲酒后代謝生成并進入玻璃體液，證實了死者在生前有飲酒情況。

1.3 EtG和EtS的分析方法

EtG和EtS均為極性小分子，pKa分別為2.84和-3.14，因而血、尿分析無法有效適用于液液提取（LLE）或固相萃取（SPE）；尿液直接稀釋進樣法容易摻雜大量雜質、引起基底效應偏高，同時會對儀器產(chǎn)生傷害；沉淀蛋白法是EtG和EtS的主要前處理方法[23，41]，沉淀蛋白后上清液用液相色譜-串聯(lián)質譜（LC-MS/MS）分析后沒有明顯的基質干擾[42]。Freire等[43]采用微波輔助提取技術（MAE）處理尿液樣品中的EtG，操作簡便快速，大大縮短提取時間、節(jié)省溶劑消耗的同時保證較高的回收效率，但是該方法采用了氣相色譜-質譜（GC-MS）進行分析，樣品需要衍生化處理且方法靈敏度較低（5 ng/mL）。MAE同樣適用于毛發(fā)樣品處理[44]，其他常見處理方法主要為 SPE[27，45-46]、超聲提取法[47-49]以及兩者的結合使用[27，50-52]，固相萃取柱主要有氨基柱、OASIS MAX、Clean Screen（EtG Carbon）；頂空-固相微萃取法（HSSPME）也是毛發(fā)處理的重要方法，常與氣相色譜-串聯(lián)質譜法（GC-MS/MS）聯(lián)用[53-55]。 指甲、胚胎組織、胎糞以及玻璃體液的檢材處理方法則主要集中于沉淀蛋白[38，40]、超聲提取[35，56]、SPE[57-58]等。

生物檢材中EtG和EtS的分析手段主要為GC-MS[43-44，59-60]、LC-MS[13，61]，后期更多采用 LC-MS/MS[19，22，35，40，58，62-64]，避免氣相色譜的衍生化處理，同時提高了分析方法的靈敏度。Cappelle等[65]比較了GC-MS和GC-MS/MS兩種方法分析毛發(fā)中的EtG，檢出限（LOD）和定量限（LOQ）：GC-MS/MS 為0.005 pg/mg和 0.017pg/mg；GC-MS為 0.022pg/mg和0.075pg/mg。Delphine等[66]建立了GC-MS/MS法分析毛發(fā)中的EtG，并與GC-MS法比較，兩者定量結果偏差較大，在區(qū)分非飲酒和適量飲酒人群（閾值7 pg/mg）時，GC-MS/MS方法靈敏度更高。LC-MS/MS在分析血液中的EtG時，其靈敏度與GC-MS/MS相比沒有較大差別，然而其無需衍生化處理，且定量精密度更高[64，67]。

LC-MS/MS分析多數(shù)采用反相色譜/負離子電噴霧模式（ESI）監(jiān)測，由于EtG和EtS極性較大，只有在高水相比例下才能獲得較好的保留，然而在電離過程中，小分子分析物向氣相轉移需要在高有機相比例的協(xié)助下帶電，水相比例較多不利于電離的促進，同時增加了基質干擾的可能[18，63]。許多文獻報道柱后添加有機溶劑有利于促進電離進程，提高分析靈敏度[27，35，40，56，68-69]，2-丙醇、乙腈為主要的柱后添加溶劑。為避免電噴霧離子源對分析靈敏度的影響、同時簡化分析步驟，有文獻報道采用大氣壓化學電離源（APCI）作為ESI的替代源，在分析水性組分時表現(xiàn)出較好的響應效果，獲得更高的檢測靈敏度，不受離子抑制效應的影響[22，70]。此外，負化學電離源（NCI）常用于GC-MS/MS，替代了之前的電子轟擊源（EI），能大大提高毛發(fā)中EtG的檢測靈敏度[52，55]。

表3 文獻報道不同生物檢材中EtG和EtS的分析方法

2 FAEEs

2.1 FAEEs的形成過程

FAEEs是乙醇經(jīng)酶促作用與體內(nèi)的內(nèi)源性脂肪酸、甘油三脂、脂蛋白、磷脂發(fā)生酯化反應而形成的一系列脂肪酸乙酯（圖1）。FAEEs由20多種化合物組成，包括月桂酸乙酯（E12）、肉豆蔻酸乙酯（E14）、棕櫚酸乙酯（E16）、棕櫚油酸乙酯（E16：1）、硬脂酸乙酯（E18）、油酸乙酯（E18：1）、亞油酸乙酯（E18：2）、亞麻酸乙酯（E18：3）、花生四烯酸乙酯（E20：4）、二十二碳六烯酸（E22：6）等等。這些均為親脂性化合物，能夠穿透皮脂腺進而分布于全身。

圖1 FAEE的形成及水解過程

2.2 生物樣品中FAEEs的研究現(xiàn)狀

2.2.1 毛發(fā)分析

2001年Pragst等[74]首次在毛發(fā)中檢出四種FAEE（E14、E16、E18、E18：1），說明了 FAEE 在證明酒精攝入方面的檢測可行性。毛發(fā)中的黑色素呈弱酸性，易與呈堿性的物質或陽離子結合，F(xiàn)AEE為中性、弱極性物質，進入毛發(fā)后能夠穩(wěn)定存在，不受發(fā)色影響，因而毛發(fā)中的FAEE定性定量分析結果較血、尿中FAEE的檢測更為普遍化。但是，由于個體在日常生理代謝過程中會產(chǎn)生副產(chǎn)物乙醇，因而在嚴格禁酒的情況下，個體毛發(fā)中也會檢出FAEE等假陽性情況[75-76]。因此，設定合理的判斷閾值對于正確區(qū)分禁酒與飲酒的情況至關重要。2009年，SoHT將四種 FAEEs（E14、E16、E18、E18：1）的總濃度 CFAEEs 定為區(qū)分不同飲酒情況的標準：當CFAEEs≥1ng/mg，表明酗酒；CFAEEs≤0.8ng/mg，表明適量飲酒；CFAEEs≤0.4 ng/mg，表明禁酒。 2012年，SoHT發(fā)布了最新的戒酒閾值標準，貼根0～3cm頭發(fā)中FAEE＞0.2ng/mg或貼根0～6 cm頭發(fā)中FAEE＞0.4 ng/mg則表明有酒精復飲情況。文獻報道許多學者對于毛發(fā)中FAEE的界定標準考慮了毛發(fā)長度的因素。Elisabetta等[77]、Pragst等[78]均采用了 0.5 ng/mg FAEE（貼根 0～3 cm）作為區(qū)分日常飲酒和酗酒的標準，Elisabetta等的分析特異性高達87%；Süsse等[79]則采用了界定值 1.0 ng/mg FAEE（貼根 3～6 cm）。根據(jù)毛發(fā)的不同長度，分段設定檢測閾值，綜合分析，提供更加全面可靠的酒精濫用信息。

2.2.2 胎糞分析

目前大多數(shù)文獻中，E16、E18：1這兩種物質被認為是毛發(fā)中FAEEs檢測的主要目標物，能夠較好地認定酒精攝入行為[79-80]。在胎糞檢測中，E18：2的檢測濃度較高，是孕期酒精暴露的重要標志物，而E12、E14由于在非飲酒產(chǎn)婦中檢出比率較大，因此不將其納入檢測目標物之列[81-83]。其他學者提出E18：2無法作為FAEEs檢測的主要目標物，如Chan等[84]發(fā)現(xiàn) 80%的胎糞樣品中無法檢出 E18、E18：1、E18：2；Algar等[85]發(fā)現(xiàn) E18：1、E16 濃度水平較高。 文獻報道關于何種FAEE作為胎兒酒精暴露的主要標志物不盡相同[86-89]，出現(xiàn)差異的原因可能與孕婦飲食習慣有關。因此后期有學者提出，胎糞中FAEEs的 界 定 值 以 七 種 FAEE （E16、E16：1、E18、E18：1、E18：2、E18：3、E20：4） 總 量 為 計 ，Hutson 等[90]設 定50 ng/g、Chan 等[91]設定 2 nmol/g（約 600 ng/g）來區(qū)分孕期酒精暴露與否的情況。其他學者則根據(jù)具體樣品設定不同F(xiàn)AEE總量的限定值。Bakdash等[81]以四種 FAEE（E16、 E18、 E18：1、 E18：2）的總量 500 ng/g為攝酒判斷閾值；Moore等[92]采用六種FAEE（E16、E16：1、E18、E18：1、 E18：2、 E20：4）的總量 10，000 ng/g為孕期飲酒的判斷閾值。

2.3 FAEEs的分析方法

FAEE為弱極性的酯類化合物，在堿性條件下易水解而難以穩(wěn)定存在。經(jīng)典的FAEE提取方法主要為LLE和SPE，常見的提取溶劑為非極性或弱極性溶劑如丙酮、正己烷、二氯甲烷等[92-96]，萃取柱主要為 氨 基 柱 、CUNAX 153；HS-SPME[90，97-100]以及MAE[101-103]也是毛發(fā)、胎糞以及表皮組織中FAEE的常見處理方法。FAEEs具有相對較高的揮發(fā)性，采用HS-SPME提取FAEEs時，為了防止其在高溫下發(fā)生水解，調(diào)節(jié)緩沖溶劑至中性，使FAEE保持分子的穩(wěn)定狀態(tài)，同時加入少量NaCl，通過鹽化處理促進氣化進程；另外，毛發(fā)脂質層中含有游離的羧酸基團，調(diào)節(jié)緩沖液至中性有利于羧酸離解，使其呈離子狀態(tài)而不利于氣化。

FAEE適用于GC分析，文獻報道采用氫火焰離子化檢測器（FID）具有較高的靈敏性和特異性[104-105]。采用 GC-MS 可提高分析靈敏度[95，97，101，106]，Zimmermann等[107]使用GC-MS/MS將毛發(fā)中FAEEs的檢測限降低至 0.002～0.030 ng/mg，成功應用于區(qū)分酗酒、適量飲酒以及非飲酒情況。LC-MS/MS 分析[58，85，94，108]采用正離子電噴霧模式監(jiān)測，提高分析靈敏度的同時，與其他酒精標志物EtG、EtS等同時檢測能提高鑒別酒精攝入的可靠性。

3 實際案例及應用

毛發(fā)檢測是鑒別酗酒和戒酒的重要手段，其檢測結果關系到認定酒精濫用與否，從而影響到離婚訴訟、兒童監(jiān)護權等法律問題。2009年倫敦法院開庭審理了一起離婚案件，當事人是一位母親，2008年11月前有長期酗酒史，而后進行戒酒治療。在爭奪兒子撫養(yǎng)權方面，需要證明成功禁酒至少一年，沒有復飲情況[109]。2009年9月收集該當事人的貼根頭發(fā)進行GC-MS/MS分析，結果顯示，貼根0～1 cm毛發(fā)中檢出22pg/mgEtG（10 pg/mg為區(qū)分飲酒與禁酒閾值）。該當事人否認復飲情況，隨即于2009年10月、2010年2月、5月和7月進行后續(xù)分析，結果顯示在 0～3cm 毛發(fā)中 EtG 含量小于 2.4～3.3 pg/mg。前后不一致的分析報告顯示毛發(fā)分析結果應經(jīng)反復確證，并與其他生物檢材或是生物標志物聯(lián)合分析、相互印證，同時尤其要注意受檢者是否曾使用過含酒精成分的頭發(fā)美容或清洗用品，以排除假陽性結果的產(chǎn)生。案例中當事人曾經(jīng)在此戒酒期間服用過治療哮喘的藥物（Clenil Modulite 100），該藥含有9%乙醇，相當于日常攝入36 mg/天的酒精；同時使用過含氣泡的洗浴用水，可能含有酒精成分。這類影響因素均未被列入考量范圍。

毛發(fā)分析的溯源性同樣適用于肝臟移植前的戒酒檢測。原位肝移植的候選人要求在移植手術前有6個月的連續(xù)禁酒期，接受肝移植手術的病人通常患有肝硬化，因而此類病人在術前禁止有任何飲酒行為。Sterneck等[110]對63名患酒精性肝硬化的肝移植病人以及25名非酒精性肝硬化病人進行毛發(fā)、尿液和血液分析。分析前，僅有19名病人承認在半年內(nèi)喝過酒，而檢測結果表明有39名病人曾有飲酒行為發(fā)生。其中，18名病人的頭發(fā)中檢出EtG（30 pg/mg為區(qū)分飲酒與禁酒閾值）；對于44名先前否認飲酒的病人，23名的頭發(fā)、尿液、或血液中至少檢出一項酒精相關標志物；9名先前否認飲酒的病人，頭發(fā)中均檢出EtG；25名非酒精性肝硬化病人的頭發(fā)中未檢出EtG；毛發(fā)分析特異性達98%，陽性預測率為92%。Sterneck等研究結果表明毛發(fā)中EtG的分析對術前飲酒行為的鑒別具有較高的特異性和可靠性，同時毛發(fā)的分段分析法可作為認定長期飲酒的一項重要分析手段。

在國外，酒精濫用的認定影響駕駛執(zhí)照的重新授予。比利時駕駛執(zhí)照重新授予法規(guī)定，駕駛員因酒駕被吊銷駕駛執(zhí)照的，應當在重新授予前持續(xù)有6個月的禁酒期。Kummer等[111]分析了50例待重新授予駕照人員的生物樣本，聯(lián)合多樣化的分析手段，分別對其毛發(fā)中的EtG、尿液中的EtG、EtS、干血點中的PEth進行檢測，同時對血液中的間接生物學標志物 CDT、γ-GT、ALT/AST、MCV 進行檢測。 根據(jù)不同的檢材特性，尿液分析提供了近期飲酒信息，26例尿樣檢出EtG或EtS，表明受試者在取樣前幾天有攝酒情況。29例干血點樣品檢出PEth16∶0/18：1，表明受試者近一個月內(nèi)違反了禁酒規(guī)定。24例毛發(fā)樣品中，在貼根0～6 cm段內(nèi)檢出 EtG（＞9 pg/mg為復飲閾值；＞38 pg/mg為酗酒閾值），表明受試者在近6個月內(nèi)有過復飲情況；此外毛發(fā)檢測窗口（6個月）完整覆蓋法定規(guī)定的禁酒期限，可提供充足的戒酒依從性信息。結合間接生物學標志物的檢測結果，共10名受試者超過所有檢測項目的正常值，認定其在6個月內(nèi)有飲酒情況。

許多性侵案件常與醉酒事件有關，酒精與其他安眠類藥物被用作性侵輔助性工具，被害者往往在案發(fā)時失去思維意識、沒有反抗能力，報案后通常需要鑒定其攝酒或攝藥程度以排除被害者自愿的可能性。在這種特定的情形下，選擇適合的檢材至關重要。尿液分析的檢測窗口長達幾天時間，往往尿中檢出EtG、EtS無法排除案發(fā)前幾天有攝酒的情況。血液分析的檢測時限在24 h內(nèi)，且血藥濃度能客觀反映個體飲酒水平，因而血液中檢出EtG、EtS通常能夠認定受檢者在24 h內(nèi)有攝酒情況。Hegstad等[71]對49名自稱遭受酒后性侵的女性進行血液分析，血液中的EtG和EtS含量均高于乙醇本身，乙醇無法檢出時，EtG和EtS能檢出，檢測時限大于24 h。乙醇濃度與EtG和EtS的濃度具有相關性（P＜0.001），EtG 和 EtS 的濃度和清除時間也具有一定的相關性（P＜0.001）。

在尸檢調(diào)查中，死后生物檢材的分析往往涉及檢材腐敗，腐敗產(chǎn)生的干擾物容易導致假陽性結果，如血液腐敗會產(chǎn)生內(nèi)源性乙醇，對于死前飲酒的鑒別帶來一定的干擾。乙醇的直接標記物EtG和EtS在人體死亡后，無法由機體代謝形成，可以用來鑒別死前飲酒與否的情況。H?iseth等[112]對36例懷疑攝酒致死的尸體進行血、尿分析，其中19例血、尿樣中的EtG和EtS為陽性，16例為陰性。說明19名死者生前有飲酒傾向，而另外16名生前的飲酒概率較小。僅有一例的尿樣中檢出EtG和EtS，血樣中只檢出EtS，EtG無法檢出，其原因可能是個體死亡后，部分EtG因血液腐敗而降解所致。Vezzoli等[62]分析了63例尸體的靜脈血和玻璃體液，對其中的EtG進行LC-MS/MS分析，并對乙醇、以及尸體腐敗標記物（乙醛、丙醇）進行HS-GC分析。結果表明，17例血樣和玻璃體液中，EtG和EtS均無檢出，表明死者生前未曾飲酒；19例血樣中檢出乙醇和EtG，濃度范圍分別為 0.05～0.30 g/L 和 0.02～3.27 mg/L；玻璃體液中檢出 EtG，濃度范圍 0.01～2.88 mg/L，乙醛和丙醇均未檢出，表明死者生前有飲酒經(jīng)歷；13例血樣中檢出乙醇，濃度大于0.05 g/L，而血液與玻璃體液中的EtG濃度＜0.01 mg/L，其中8例檢材中同時檢出乙醛及丙醇，表明死者生前飲酒概率較小，體內(nèi)乙醇可能由組織腐敗產(chǎn)生。

在實際檢測中時常會出現(xiàn)非飲酒性酒精攝入的情況，含酒精的洗手液、漱口水會導致尿液EtG和EtS假陽性[113-114]；含酒精的美發(fā)用品（洗發(fā)水、生發(fā)液等）會造成毛發(fā)EtG和EtS假陽性[115]，另值得注意的是，燙發(fā)、美發(fā)和頻繁洗頭等美發(fā)過程則會造成EtG、EtS的浸出和分解，導致其濃度損耗而出現(xiàn)假陰性結果[116]。因此，在檢測值處于閾值附近時，應當充分考慮非飲酒性酒精攝入的干擾因素，尤其當受試者否認飲酒時，需結合病史，進行多標志物聯(lián)合分析，防止產(chǎn)生假陽性情況。

4 小結

生物檢材中EtG、EtS和FAEEs可作為人體攝入乙醇的直接生物標志物，其分析手段不斷完善，檢測靈敏度和特異性較高，能夠鑒別少量飲酒情況。毛發(fā)分析在區(qū)分飲酒與禁酒、酗酒與日常飲酒以及鑒別戒酒后復飲等方面發(fā)揮了重要的界定作用；尿液及血液分析在近期飲酒行為認定方面能提供充足證據(jù)；其他非傳統(tǒng)生物檢材在鑒別特殊飲酒情況如死前飲酒、孕期飲酒等方面具有無可替代的證據(jù)作用。EtG、EtS和FAEEs的分析與檢測已廣泛應用于職業(yè)衛(wèi)生、法醫(yī)鑒定、考證測試、臨床監(jiān)測、戒癮治療等領域。隨著酒精濫用的危害不斷提升，酗酒認定具有重要的現(xiàn)實意義，也對酒精濫用的分析提出更大的挑戰(zhàn)。在實際應用過程中應當結合具體案情界定閾值；必要時聯(lián)合多種乙醇生物標志物（如直接標志物與間接標志物 γ-GT、CDT、MCV、ALT、AST等）以及病史進行多角度分析，同時應注意排除非飲酒性酒精攝入的干擾因素（如含酒精的美發(fā)產(chǎn)品、衛(wèi)生用品等），為酗酒行為認定和涉酒案（事）件的處置提供更加科學、可靠、有效的證據(jù)信息。

[1]World Health Organization （WHO）.Global Status Report on Alcohol and Health 2014[EB/OL].（2014-05-12）[2017-04-12].http：//www.who.int/substance_abuse/publications/global_alcohol_report/en/

[2]Collin J， Casswell S.Alcohol and the Sustainable Development Goals[J].Lancet， 2016，24（1）：2582-2583.

[3]Institute for Health Metrics and Evaluation.Global Burden of Disease Study 2013：GBD Comparison Results 1990–2013[EB/OL].（2016-07-07）[2017-04-17]http：//vizhub.healthdata.org/gbd-compare/

[4]郭景元.實用法醫(yī)學[M].上海科學技術出版社，1980.

[5]李民，王延偉，呂永強，等.酗酒標志物研究進展[J].臨床軍醫(yī)雜志，2014，42（12）：1301-1303.

[6]Conigrave KM， Davies P， Haber P， et al.Traditional Markers of Excessive Alcohol Use[J].Addiction， 2003，98（2）：31-43.

[7]Rinck D，F(xiàn)rieling H，F(xiàn)reitag A，et al.Combinations of Carbohydrate-deficient Transferrin，Mean Corpuscular Erythrocyte Volume， Gamma-glutamyltransferase， Homocysteine and Folate Increase the Significance of Biological Markers in Alcohol Dependent Patients[J].Drug&Alcohol Dependence， 2007，89（1）：60-65.

[8]Pragst F， Balikova MA.State of the Art in Hair Analysis for Detection of Drug and Alcohol Abuse[J].Clinica Chimica Acta， 2006，370：17-49.

[9]Thon N，Weinmann W，Yegles M，et al.Direct Metabolites of Ethanol as Biological Markers of?Alcohol Use：Basic Aspects and Applications[J].Fortschr Neurol Psychiatr，2013， 81（9）：493-502.

[10]Schneider H，Glatt H.Sulpho-conjugation of Ethanol in Humans in Vivo and by Individual Sulphotransferase Forms in Vitro[J].Biochemical Journal， 2004，383（3）：543-549.

[11]Foti RS， Fisher MB.Assessment of UDP-glucuronosyltransferase Catalyzed Formation of Ethyl Glucuronide in Human Liver Microsomes and Recombinant UGTs[J].Forensic Science International， 2005，153（2-3）：109-116.

[12]Thierauf A，Halter CC，Rana S，et al.Urine Tested Positive for Ethyl Glucuronide after Trace Amounts of Ethanol[J].Addiction， 2009， 104 （12）：2007-2012.

[13]Helander A， Beck O.Ethyl Sulfate：A Metabolite of Ethanol in Humans and a Potential Biomarker of Acute Alcohol Intake[J].Journal of Analytical Toxicology， 2005，29（5）：270-274.

[14]Wojcik MH， Hawthorne JS.Sensitivity of Commercial Ethyl Glucuronide（ETG）Testing in Screening for Alcohol Abstinence[J].Alcohol Alcohol， 2007，42（4）：317-320.

[15]H?iseth G，Bernard JP，Karinen R，et al.A Pharmacokinetic Study of Ethyl Glucuronide in Blood and Urine：Applications to Forensic Toxicology[J].Forensic Science International， 2007，172（2）：119-124.

[16]Helander A，Beck O.Mass Spectrometric Identification of Ethyl Sulfate as an Ethanol Metabolite in Humans[J].Clinical Chemistry， 2004，50（5）：936-937.

[17]Martin WF，Skipper GE，Wolfgang W.Ethyl Glucuronide—The Direct Ethanol Metabolite on the Threshold from Science to Routine Use[J].Addiction， 2003，98（2）：51-61.

[18]Wurst FM， Dresen S， Allen JP， et al.Ethyl Sulphate：A Direct Ethanol Metabolite Reflecting Recent Alcohol Consumption[J].Addiction， 2006，101（2）：204-211.

[19]Kummer N， Wille S， Di FV， et al.A Fully Validated Method for the Quantification of Ethyl Glucuronide and Ethyl Sulphate in Urine by UPLC-ESI-MS/MS Applied in a Prospective Alcohol Self-monitoring Study[J].Journal of Chromatography B， 2013，929（7）：149-154.

[20]Albermann ME，Musshoff F，DoberentzO E，et al.Preliminary Investigations on Ethyl Glucuronide and Ethyl Sulfate Cutoffs for Detecting Alcohol Consumption on the Basis of an Ingestion Experiment and on Data from Withdrawal Treatment[J].International Journal of Legal Medicine，2012，126（5）：757-764.

[21]Janda I， Alt A.Improvement of Ethyl Glucuronide Determination in Human Urine and Serum Samples by Solidphase Extraction[J].Journal of Chromatography B Biomedical Sciences&Applications， 2001，758（2）：229-234.

[22]Beyer J， Tu NV， Gerostamoulos D， et al.Validated Method for the Determination of Ethylglucuronide and Ethylsulfate in Human Urine[J].Analytical&Bioanalytical Chemistry， 2011，400（1）：189-196.

[23]Halter CC， Dresen S， Auwaerter V， et al.Kinetics in Serum and Urinary Excretion of Ethyl Sulfate and Ethyl Glucuronide after Medium Dose Ethanol Intake[J].International Journal of Legal Medicine， 2008，122（2）：123-128.

[24]H?iseth G，Morini L，Polettini A，et al.Blood Kinetics of Ethyl Glucuronide and Ethyl Sulphate in Heavy Drinkers during Alcohol Detoxification[J].Forensic Science International， 2009，188（1）：52-56.

[25]Lostia AM，Vicente JL，Cowan DA.Measurement of Ethyl Glucuronide，Ethyl Sulphate and Their Ratio in the Urine and Serum of Healthy Volunteers after Two Doses of Alcohol[J].Alcohol&Alcoholism， 2013，48（1）：74-82.

[26]H?iseth G， Yttredal B， Karinen R， et al.Ethyl Glucuronide Concentrations in Oral Fluid， Blood， and Urine after Volunteers Drank 0.5 and 1.0 g/kg Doses of Ethanol[J].Journal of Analytical Toxicology， 2010，34（6）：319-324.

[27]Janda I，Weinmann W，Kuehnle T，et al.Determination of Ethyl Glucuronide in Human Hair by SPE and LC-MS/MS[J].Forensic Science International， 2002，128（1-2）：59-65.

[28]Kerekes I，Yegles M，Grimm U，et al.Ethyl Glucuronide Determination：Head Hair Versus Non-head Hair[J].Alcohol&Alcoholism， 2009，44 （1）：62-66.

[29]Kintz P.2014 Consensus for the Use of Alcohol Markers in Hair for Assessment of Both Abstinence and Chronic Excessive Alcohol Consumption[J].Forensic Science International， 2015，249：A1-A2.

[30]Kharbouche H，F(xiàn)aouzi M，Sanchez N，et al.Diagnostic Performance of Ethyl Glucuronide in Hair for the Investigation of Alcohol drinking Behavior：A Comparison with Traditional Biomarkers[J].International Journal of Legal Medicine， 2012，126（2）：243-250.

[31]Politi L， Morini， L.， Leone， F.， Polettini， A.Ethyl Glucuronide in Hair：Is It A Reliable Marker of Chronic High Levels of Alcohol Consumption?[J].Addiction， 2006，101：1408-1412.

[32]Stewart SH，Koch DG，Willner IR，et al.Hair Ethyl Glu-curonide is Highly Sensitive and Specific for Detecting Moderate-to-Heavy Drinking in Patients with Liver Disease[J].Alcohol&Alcoholism， 2013，48（1）：83-87.

[33]Crunelle C L，Yegles M，De D M，et al.Hair Ethyl Glucuronide Concentrations in Teetotalers：Should We Reevaluate the Lower Cut-off[J].Forensic Science International， 2017，274：107-108.

[34]Crunelle C L，Cappelle D，Yegles M，et al.Ethyl Glucuronide Concentrations in Hair：A Controlled Alcoholdosing Study in Healthy Volunteers[J].Analytical&Bioanalytical Chemistry， 2015，408（8）：2019-2025.

[35]Morini L，Colucci M，Ruberto M G，et al.Determination of Ethyl Glucuronide in Nails by Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry as A Potential New Biomarker for Chronic Alcohol Abuse and Binge Drinking Behavior[J].Analytical&Bioanalytical Chemistry， 2012，402 （5）：1865-1870.

[36]Berger L，F(xiàn)endrich M，Jones J，et al.Ethyl Glucuronide in Hair and Fingernails as A Long-term Alcohol Biomarker[J].Addiction， 2014，109（3）：425-431.

[37]Goecke T W，Burger P，F(xiàn)asching P A，et al.Meconium Indicators of Maternal Alcohol Abuse during Pregnancy and Association with Patient Characteristics[J].Biomed Research International， 2014，2014（1）：7028-7048.

[38]Morini L，F(xiàn)alc N M，Pichini S，et al.Ethyl-glucuronide and Ethyl-sulfate in Placental and Fetal Tissues by Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry[J].Analytical Biochemistry， 2011，418（1）：30-36.

[39]Thierauf A， Musshoff F， Madea B.Post-mortem Biochemical Investigations of Vitreous Humor[J].Forensic Science International， 2009，192（1-3）：78-82.

[40]Thierauf A，Kempf J，Perdekamp M G，et al.Ethyl Sulphate and Ethyl Glucuronide in Vitreous Humor as Postmortem Evidence Marker for Ethanol Consumption prior to Death[J].Forensic Science International， 2011，210（1）：63-68.

[41]Musshoff F， Albermann E， Madea B.Ethyl Glucuronide and Ethyl Sulfate in Urine after Consumption of Various Beverages and Foods--misleading Results?[J].International Journal of Legal Medicine， 2010，124（6）：623-630.

[42]Al-Asmari A I， Anderson R A， Appelblad P.Direct Determination of Ethyl Glucuronide and Ethyl Sulfate in Postmortem Urine Specimens Using Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography-Electrospray Ionization-Tandem Mass Spectrometry[J].Journal of Analytical Toxicology，2010，34（5）：261-272.

[43]Freire Iá， Barrera AMB， Silva PC， et al.Microwave Assisted Extraction for the Determination of Ethyl Glucuronide in Urine by Gas Chromatography-Mass Spectrometry[J].Journal of Applied Toxicology， 2008，28（6）：773-778.

[44]álvarez I， Bermejo AM， Tabernero MJ， et al.Microwaveassisted Extraction：A Simpler and Faster Method for the Determination of Ethyl Glucuronide in Hair by Gas Chromatography–Mass Spectrometry[J].Analytical&Bioanalytical Chemistry， 2009，393（4）：1345-1350.

[45]Cabarcos P，Hassan HM，Tabernero MJ，et al.Analysis of Ethyl Glucuronide in Hair Samples by Liquid Chromatography-Elecrospray Ionization–Tandem Mass Spectrometry （LC-ESI-MS/MS）[J].Journal of Applied Toxicology Jat， 2013，33（7）：638-643.

[46]Paul R， Tsanaclis L， Kingston R， et al.Simultaneous Determination of GHB and EtG in Hair Using GCMS/MS[J].Drug Testing&Analysis， 2011，3（4）：201-205.

[47]Morini L， Politi L， Groppi A， et al.Determination of Ethyl Glucuronide in Hair Samples by Liquid Chromatography/Electrospray Tandem Mass Spectrometry.J Mass Spectrom[J].Journal of Mass Spectrometry， 2010，41（1）：34-42.

[48]Politi L，Zucchella A，Morini L，et al.Markers of Chronic Alcohol Use in Hair：Comparison of Ethyl Glucuronide and Cocaethylene in Cocaine Users[J].Forensic Science International， 2007，172（1）：23-27.

[49]Albermann ME，Musshoff F，Aengenheister L，et al.Investigations on the Influence of Different Grinding Procedures on Measured Ethyl Glucuronide Concentrations in Hair Determined with An Optimized and Validated LCMS/MS Method[J].Analytical&Bioanalytical Chemistry，2012，403（3）：769-776.

[50]Appenzeller BMR，Agirman R，Neuberg P，et al.Segmental Determination of Ethyl Glucuronide in Hair：A Pilot Study[J].Forensic Science International， 2007，173 （2）：87-92.

[51]Kintz P， Villain M， Vallet E， et al.Ethyl Glucuronide：Unusual Distribution Between Head Hair and Pubic Hair[J].Forensic Science International， 2008，176（1）：87-90.

[52]Kharbouche H，Sporkert F，Troxler S，et al.Development and Validation of A Gas Chromatography-Negative Chemical Ionization Tandem Mass Spectrometry Method for the Determination of Ethyl Glucuronide in Hair and Its Application to Forensic Toxicology[J].Journal of Chromatography B， 2009，877（23）：2337-2343.

[53]Agius R，F(xiàn)erreira LM，Yegles M.Can Ethyl Glucuronide in Hair be Determined Only in 3 cm Hair Strands?[J].Forensic Science International， 2012，218（1-3）：3-9.

[54]Agius R，Nadulski T，Kahl H G，et al.Ethyl Glucuronide in Hair-A Highly Effective Test for the Monitoring of Alcohol Consumption[J].Forensic Science International，2012，218（1-3）：10-14.

[55]Agius RNT， Kahl HG， Schrader J， et al.Validation of A Headspace Solid-phase Microextraction-GC-MS/MS for the Determination of Ethyl Glucuronide in Hair According to Forensic Guidelines[J].Forensic Science International 2010，196（1-3）：3-9.

[56]Fosen JT，Morini L，Sempio C，et al.Ethyl Glucuronide Elimination Kinetics in Fingernails and Comparison to Levels in Hair[J].Alcohol&Alcoholism， 2017，52（5）：580-586.

[57]Jones J，Jones M，Plate C，et al.Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Assay to Detect Ethyl Glucuronide in Human Fingernail：Comparison to Hair and Gender Differences[J].American Journal of Analytical Chemistry， 2012，3（1）：83-91.

[58]Valano F， Favretto D， Palumbo D， et al.A Novel， Simultaneous Extraction of FAEE and EtG from Meconium and Analysis by LC-MS/MS[J].Analytical&Bioanalytical Chemistry， 2016，408 （10）：1-8.

[59]Sharma P， Bharat V， Murthy P.Quantitation of Ethyl Glucuronide in Serum&Urine by Gas Chromatography-Mass Spectrometry[J].Indian Journal of Medical Research，2015，141（1）：75-80.

[60]Mnch B， Becker R，Jung C，et al.The Homogeneity Testing of EtG in Hair Reference Materials：A Highthroughput Procedure Using GC-NCI-MS[J].Forensic Science International， 2013，226（1-3）：202-207.

[61]Favretto D，Nalesso A，F(xiàn)rison G，et al.A Novel and An Effective Analytical Approach for the LC-MS Determination of Ethyl Glucuronide and Ethyl Sulfate in Urine[J].International Journal of Legal Medicine， 2010，124 （2）：161-164.

[62]Vezzoli S， Bernini M， De F F.Ethyl Glucuronide in Vitreous Humor and Blood Postmortem Specimens：Analysis by Liquid Chromatography-Electrospray Tandem Mass Spectrometry and Interpreting Results of Neo-formation of Ethanol[J].Annali Dellistituto Superiore Di Sanità， 2015，51（1）：19-27.

[63]Bicker W，L Mmerhofer M，Keller T，et al.Validated Method for the Determination of the Ethanol Consumption Markers Ethyl Glucuronide， Ethyl Phosphate， and Ethyl Sulfate in Human Urine by Reversed-phase/Weak Anion Exchange Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry[J].Analytical Chemistry， 2006，78（16）：5884-5892.

[64]趙暉，卓先義，嚴慧，等.液相色譜-串聯(lián)質譜法測定血液、尿液中乙基葡萄糖醛酸苷[J].法醫(yī)學雜志，2010，26（4）：269-272.

[65]Cappelle D， Crunelle C L，Nuijs ALNV， et al.P1：GCMS or GC-MS/MS for the determination of ethyl glucuronide in hair?[J].Toxicologie Analytique Et Clinique，2014，26（2）：31.

[66]Delphine C，Hugo N，Michel Y，et al.Gas Chromatographic Determination of Ethyl Glucuronide in Hair：Comparison between Tandem Mass Spectrometry and Single Quadrupole Mass Spectrometry[J].Forensic Science International， 2015，249：20-24.

[67]沈保華，嚴慧，趙暉，等.氣相色譜-串聯(lián)質譜法測定血液中乙基葡萄糖醛酸苷[J].法醫(yī)學雜志，2009，25（6）：431-433.

[68]Dresent S，Weinmann W，Wurst FM.Forensic Confirmatory Analysis of Ethyl Sulfate—A New Marker for Alcohol Consumption—by Liquid-Chromatography/Electrospray Ionization/Tandem Mass Spectrometry[J].Journal of the American Society for Mass Spectrometry， 2004，15（11）：1644-1648.

[69]Morini L，Politi L，Zucchella A，et al.Ethyl Glucuronide and Ethyl Sulphate Determination in Serum by Liquid Chromatography–Electrospray Tandem Mass Spectrometry[J].Clinica Chimica Acta， 2007，376（1-2）：213-219.

[70]Favretto D，Nalesso A，F(xiàn)rison G，et al.No-discharge Atmospheric Pressure Chemical Ionization Mass Spectrometry of Ethyl Glucuronide and Ethyl Sulfate[J].Journal of Mass Spectrometry Jms， 2010，45（1）：121-124.

[71]Hegstad S，Helland A，Hagemann C，et al.EtG/EtS in Serum by UHPLC-MS-MS in Suspected Sexual Assault Cases[J].Journal of Analytical Toxicology， 2017，41（7）：618-622.

[72]Pichini S，Morini L，Marchei E，et al.Ethylglucuronide and Ethylsulfate in Meconium to Assess Gestational Ethanol Exposure：Preliminary Results in Two Mediterranean Cohorts[J].Can J Clin Pharmacol， 2009，16（2）：370-375.

[73]Matlow JN，Aleksa K，Lubetsky A，et al.The Detection and Quantification of Ethyl Glucuronide in Placental Tissue and Placental Perfusate by Headspace Solid-phase Microextraction Coupled with Gas Chromatography-Mass Spectrometry[J].Journal of Population Therapeutics and Clinical Pharmacology=Journal de la Therapeutique des Populations et de la Pharamcologie Clinique， 2012，19（3）：473-482.

[74]Pragst F， Auwaerter V， Sporkert F， et al.Analysis of Fatty Acid Ethyl Esters in Hair as Possible Markers of Chronically Elevated Alcohol Consumption by Headspace Solid-phase Microextraction （HS-SPME） and Gas Chromatography-Mass Spectrometry （GC-MS）[J].Forensic Science International， 2001，121（1-2）：76-88.

[75]Giovanni ND，Donadio G，Chiarotti M.The Reliability of Fatty Acid Ethyl Esters（FAEE） as Biological Markers for the Diagnosis of Alcohol Abuse[J].Journal of Analytical Toxicology， 2007，31（2）：93-97.

[76]De Giovanni N，Donadio G，Chiarotti M.Ethanol Contamination Leads to Fatty Acid Ethyl Esters in Hair Samples[J].Journal of Analytical Toxicology， 2008，32 （2）：156-159.

[77]Elisabetta B，Ester DB，F(xiàn)abio V，et al.Fatty Acid Ethyl Esters in Hair：Correlation with Self-reported Ethanol Intake in 160 Subjects and Influence of Estroprogestin Therapy[J].Drug Testing&Analysis， 2014，6（9）：930-935.

[78]Pragst F，Rothe M，Moench B，et al.Combined Use of Fatty Acid Ethyl Esters and Ethyl Glucuronide in Hair for Diagnosis of Alcohol Abuse：Interpretation and Advantages[J].Forensic Science International， 2010，196 （1）：101-110.

[79]Susse S，Selavka CM，Mieczkowski T，et al.Fatty Acid Ethyl Ester Concentrations in Hair and Self-reported Alcohol Consumption in 644 Cases from Different Origin[J].Forensic Science International， 2010，196（1）：111-117.

[80]Viviankulaga， Danielacaprara， Umariqbal， et al.Fatty acid ethyl esters （FAEE）;comparative accumulation in human and guinea pig hair as a biomarker for prenatal alcohol exposure[J].Alcohol Alcohol， 2006，41（5）：534-539.

[81]Bakdash A，Burger P，Goecke TW，et al.Quantification of Fatty Acid Ethyl Esters（FAEE） and Ethyl Glucuronide（EtG）in Meconium from Newborns for Detection of Alcohol Abuse in A Maternal Health Evaluation Study[J].Analytical&BioanalyticalChemistry， 2010，396（7）：2469-2477.

[82]Pichini S， Pellegrini M， Gareri J， et al.Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry for Fatty Acid ethyl Esters in Meconium：Assessment of Prenatal Exposure to Alcohol in Two European Cohorts[J].Journal of Pharmaceutical&Biomedical Analysis， 2008，48（3）：927-933.

[83]Hastedt M，Herre S，Pragst F，et al.Workplace Alcohol Testing Program by Combined Use of Ethyl Glucuronide and Fatty Acid Ethyl Esters in Hair[J].Alcohol&Alcoholism， 2012， 47 （2）：127-132.

[84]Chan D，Baroz B，PellerinELLERIN B，et al.Population Baseline of Meconium Fatty Acid Ethyl Esters among Infants of Nondrinking Women in Jerusalem and Toronto[J].Therapeutic Drug Monitoring， 2003，25（3）：271-278.

[85]Garcia-algar O， Kulaga VJ， Koren G， et al.Alarming Prevalence of Fetal Alcohol Exposure in A Mediterranean City[J].Therapeutic Drug Monitoring， 2008，30（2）：249-254.

[86]Klein J， Karaskov T， Korent G.Fatty Acid Ethyl Esters：A Novel Biologic Marker for Heavy in Utero Ethanol Exposure：A Case Report[J].Therapeutic Drug Monitoring，1999，21（6）：644-646.

[87]Bearer CF，Jacobson JL，Jacobson SW，et al.Validation of A New Biomarker of Fetal Exposure to Alcohol[J].Journal of Pediatrics， 2003，143（4）：463-469.

[88]Moore CM，Lewis D.Fatty Acid Ethyl Esters in Meconium：Biomarkers for the Detection of Alcohol Exposure in Neonates[J].Clinica Chimica Acta， 2001，312（1-2）：235-237.

[89]Bearer CF，Santiago LM，Oriordan MA，et al.Fatty Acid Ethyl Esters：Quantitative Biomarkers for Maternal Alcohol Consumption[J].Journal of Pediatrics， 2005，146（6）：824-830.

[90]Hutson JR，Rao C，F(xiàn)ulga N，et al.An Improved Method for Rapidly Quantifying Fatty Acid Ethyl Esters in Meconium Suitable for Prenatal Alcohol Screening[J].Alcohol，2011，45（2）：193-199.

[91]Chan D， Klein J， Karaskov T， et al.Fetal Exposure to Alcohol as Evidenced by Fatty Acid Ethyl Esters in Meconium in the Absence of Maternal Drinking History in Pregnancy[J].Therapeutic Drug Monitoring， 2004，26 （5）：474-481.

[92]Moore C， Jones J， Lewis D， et al.Prevalence of Fatty Acid Ethyl Esters in Meconium Specimens[J].Clinical Chemistry， 2003，49（1）：133-136.

[93]Vaiano F， Favretto D， Palumbo D， et al.A Novel， Simultaneous Extraction of FAEE and EtG from Meconium and Analysis by LC-MS/MS[J].Analytical&Bioanalytical Chemistry， 2016， 408 （10）：2587-2594.

[94]Kwak HS，Kang YS，Han KO，et al.Quantitation of Fatty Acid Ethyl Esters in Human Meconium by An Improved Liquid Chromatography/Tandem MassSpectrometry[J].Journal of Chromatography B Analytical Technologies in the Biomedical&Life Sciences， 2010，878（21）：1871-1874.

[95]Politi L， Mari F， Furlanetto S， et al.Determination of Fatty Acid Ethyl Esters in Hair by GC-MS and Application in A Population of Cocaine Users[J].Journal of Pharmaceutical&Biomedical Analysis， 2011，54（5）：1192-1195.

[96]Kwak HS， Han JY， Choi J S， et al.Dose-response and Time-response Analysis of Total Fatty Acid Ethyl Esters in Meconium as A Biomarker of Prenatal Alcohol Exposure[J].Prenatal Diagnosis， 2014，34（9）：831-838.

[97]Zelner I，Kenna K，Brien JF，et al.Meconium Fatty Acid Ethyl Esters as Biomarkers of Late Gestational Ethanol Exposure and Indicator of Ethanol-induced Multi-organ Injury in Fetal Sheep[J].Plos One， 2013，8（3）：e59168.

[98] álvarez I.Analysis of Fatty Acid Ethyl Esters in Hair by Headspace Solid-Phase Microextraction （HS-SPME） and Gas Chromatography-Mass Spectrometry （GC-MS）[J].Analytical Letters， 2009，42（18）：2962-2977.

[99]Zelner I， Shor S， Lynn H， et al.Clinical Use of Meconium Fatty Acid Ethyl Esters for Identifying Children at Risk for Alcohol-Related Disabilities：the First Reported Case.J Popul Ther Clin Pharmacol[J].The Canadian Journal of Clinical Pharmacology=Journal Canadien de Pharmacologie Clinique， 2012，19（1）：26-31.

[100]Raepsaet-charlier MT.Determination of Eight Fatty Acid Ethyl Esters in Meconium Samples by Headspace Solidphase Microextraction and Gas Chromatography-Mass Spectrometry[J].Journal of Separation Science， 2015，33（14）：2115-2122.

[101]Cabarcos P， Tabernero MJ， Otero JL， et al.Quantification of Fatty Acid Ethyl Esters（FAEE） and Ethyl Glucuronide （EtG） in Meconium for Detection of Alcohol Abuse during Pregnancy：Correlation Study between Both Biomarkers[J].Journal of Pharmaceutical&Biomedical Analysis， 2014，100（21）：74-78.

[102]Cabarcos P， Tabernero MJ， Alvarez I， et al.A New Method for Quantifying Prenatal Exposure to Ethanol by Microwave-Assisted Extraction （MAE） of Meconium Followed by Gas Chromatography-Mass Spectrometry（GC-MS） [J].Analytical& Bioanalytical Chemistry，2012，404（1）：147-155.

[103]Gonzalez-lllan F，Ojeda-Torres G，Dazv-Vazquez LM，et al.Detection of Fatty Acid Ethyl Esters in Skin Surface Lipids as Biomarkers of Ethanol Consumption in Alcoholics， Social Drinkers， Light Drinkers， and Teetotalers Using a Methodology Based on Microwave-Assisted Extraction Followed by Solid-Phase Microextract[J].Journal of Analytical Toxicology， 2011，35（4）：232-237.

[104]Gareri J，Lynn H，Handley M，et al.Prevalence of Fetal Ethanol Exposure in A Regional Population-based Sample by Meconium Analysis of Fatty Acid Ethyl Esters[J].Therapeutic Drug Monitoring， 2008，30（2）：239-245.

[105]Hutson JR，Gareri MJ N，Koren G.The Incidence of Prenatal Alcohol Exposure in Montevideo Uruguay As Determined by Meconium Analysis[J].Therapeutic Drug Monitoring， 2010，32（3）：311-317.

[106]Albermann ME，Madea B，Musshoff F.A SPME-GC/MS Procedure for the Determination of Fatty Acid Ethyl Esters in Hair for Confirmation of Abstinence Test Results[J].Journal of Chromatographic Science， 2014，52（9）：955-960.

[107]Zimmermann CM.Gas Chromatography Tandem Mass Spectrometry for Biomarkers of Alcohol Abuse in Human Hair[J].Therapeutic Drug Monitoring， 2010，32（2）：216-223.

[108]Pichini S，Marchei E，Vagnarelli F，et al.Assessment of Prenatal Exposure to Ethanol by Meconium Analysis：Results of An Italian Multicenter Study[J].Alcoholism Clinical&Experimental Research， 2012，36（3）：417-424.

[109]Pragst F.Interpretation Problems in A Forensic Case of AbstinenceDetermination UsingAlcoholMarkersin Hair[J].Forensic Science International， 2012，217（1-3）：4-7.

[110]Sterneck M，Yegles M，Rothkirch VG，et al.Determination of Ethyl Glucuronide in Hair Improves Evaluation of Long-term Alcohol Abstention in Liver Transplant Candidates[J].Liver International Official Journal of the International Association for the Study of the Liver， 2014，34（3）：469–476.

[111]Kummer N，Wille SM，Poll A，et al.Quantification of EtG in Hair，EtG and EtS in Urine and PEth Species in Capillary Dried Blood Spots to Assess the Alcohol Consumption in Driver's Licence Regranting Cases[J].Drug&Alcohol Dependence， 2016， 165：191-197.

[112]H?iseth G，Karinen R，Christophersen A，et al.Practical Use of Ethyl Glucuronide and Ethyl Sulfate in Postmortem Cases as Markers of Antemortem Alcohol Ingestion[J].International Journal of Legal Medicine， 2010，124（2）：143-148.

[113]Arndt T， Schr?fel S， G Ssregen B， et al.Inhalation but not Transdermal Resorption of Hand Sanitizer Ethanol Causes Positive Ethyl Glucuronide Findings in Urine[J].Forensic Science International， 2014，237（3）：126-130.

[114]H?iseth G，Yttredal B，Karinen R，et al.Levels of Ethyl Glucuronide and Ethyl Sulfate in Oral Fluid，Blood， and Urine after Use of Mouthwash and Ingestion of Nonalcoholic Wine[J].Journal of Analytical Toxicology， 2010，34（2）：84-88.

[115]Arndt T， Schr?fel S， Stemmerich K.Ethyl Glucuronide Identified in Commercial Hair Tonics[J].Forensic Science International， 2013，231（1-3）：195-198.

[116]Kerekes I， Yegles M.Coloring， Bleaching， and Perming：Influence on EtG Content in Hair[J].Therapeutic Drug Monitoring， 2013，35（4）：527-529.

Review on the Analysis and Application of Alcohol Biomarkers

FENG Xue-yi1,2,SHEN Min1
(1.Shanghai Key Laboratory of Forensic Medicine,Shanghai Forensic Platform,Academy of Forensic Science,Shanghai 200063,China;2.Institute of Criminal Science and Technology,Jing'an Branch of Shanghai Public Security Bureau,Shanghai 200070,China)

Alcohol abuse,a public health problem of great importance,is the third leading cause of death and disability in the word according to the World Health Organization.Determination and evaluation of ethanol in vivo has been the main task of forensic toxicological analysis in the cases of traffic accident,alcohol or drug abuse,occupational health and poison intoxication.The biomarkers of ethanol present more advantages over ethanol itself in terms of sensitivity,specificity,detection window,identification ability and application areas.This review summarized the analytical procedures and applications of direct alcohol biomarkers of ethyl glucuronide,ethyl sulfate and fatty acid ethyl esters,in an attempt to promote the progress of forensic toxicological analysis and provide lawsuit and social identification activity with more scientific,reliable and efficient information.

alcohol biomarker;alcohol abuse;ethyl glucuronide;ethyl sulfate;fatty acid ethyl esters

DF795.4

A

10.3969/j.issn.1671-2072.2017.06.007

1671-2072-（2017）06-0036-14

2017-05-17

國家自然科學基金（81772022）；上海市科技攻關項目（15DZ1207500）；上海市法醫(yī)學重點實驗室資助項目（17DZ2273200）；上海市司法鑒定專業(yè)技術服務平臺資助項目（16DZ2290900）

馮雪伊（1991—），女，碩士研究生，主要從事分析化學研究。 E-mail：milk_juice@sina.com。

沈敏（1955—），女，研究員，博士研究生導師，主要從事法醫(yī)毒物鑒定研究和司法鑒定管理工作。E-mail：shenm@ssfjd.cn。

（本文編輯：嚴 慧）