脫毛動物模型造模要素和藥物防治的數據挖掘研究

孫位軍，甘大莉，王張，張靜，范剛，尹鴻翔

·藥理毒理·

脫毛動物模型造模要素和藥物防治的數據挖掘研究

孫位軍，甘大莉，王張，張靜，范剛，尹鴻翔

目的：定量研究脫毛動物模型的造模要素和防治藥物，為提高造模效率和科學評價藥物有效性提供參考。方法：收集1992-2016年研究脫毛動物模型文獻70篇，錄入動物種別、性別、給藥面積，造模試劑、劑量、受試藥物、陽性對照藥、測試指標等信息進行定量統計和分析。結果：常用C57BL6小鼠、KM小鼠、SD大鼠，雌性居多，給藥面積常用2cm×2cm=4 cm2；常用造模試劑有松香和石蠟、丙酸睪酮、硫化鈉、環磷酰胺等，但造模劑量和時間跨度大，以背部皮膚給藥為主；常測試指標為毛囊數、毛發長度及重量、毛細血管數、終毛毳毛比例、真皮厚度、毛細血管管徑、皮脂分泌率和組織學等，血清中T、E2、T/E2、TCHO、TG、DHT等，機制指標涉及VEGF、HGF、IGF-Ⅰ、Bcl-2、ColⅠ、Bax等；以治療性給藥為主，給藥周期為27 d左右，常用米諾地爾溶液和中藥復方，涉及何首烏、丹參、側柏葉、當歸、黃芪、紅花、川芎、女貞子、茯苓、熟地黃等51種藥材。結論：脫發動物模型種類較多，有效性評價和作用機制研究指標亦較多，但各文獻使用的造模劑量和周期差異大，導致造模效率低，失敗風險大；中醫藥防治脫發的作用確切，但機制研究缺乏系統性和深度。

脫發；動物模型；造模要素；藥物防治；數據挖掘

脫發(Alopecia)是常見疾病，嚴重影響人的外觀和心理狀態，主要包括雄激素性脫發（脂溢性脫發）、斑禿、假性斑禿、生長期脫發等，其中以前兩者最常見[1]。雄激素性脫發(androgenetic alopecia，AGA)以男性患者更常見，約占男性脫發比例50%[2]。斑禿（Alopecia areata，AA）是T細胞介導、以毛囊為靶器官的器官特異性自身免疫性疾病。斑禿僅次于雄激素性脫發，具反復發作特點，嚴重者出現全禿或普禿。全世界斑禿患者約 0.7%-3.8%[3]，中國約0. 27%[4]，以男性為主。脫發病因復雜多樣，病理機制尚不明確，而進行臨床研究又難以獲取頭皮等相關組織，故多應用動物模型開展脫發發生機制和治療方法研究。本文對國內20多年開展的脫毛動物模型的造模要素和藥物防治實驗研究結果進行數據挖掘和分析，旨在為提高造模效率和科學評價藥物有效性提供參考。

1 材料

在中國知識基礎設施工程(CNKI)中，收集1992年-2016年期間（25年）研究脫毛動物模型文獻70篇，不含臨床脫發研究、燒傷致動物實驗研究等文章。

2 方法

2.1 信息錄入

應用Excel軟件，錄入每篇文章題目，實驗動物種別、性別、給藥面積，造模試劑、作用時間、劑量、給予部位、給予方式，受試藥物名稱、藥物組成、陽性對照藥，測試指標等信息。

2.2 數據庫構建

制作《脫毛動物模型的造模要素挖掘數據表》。

2.3 統計和分析

對錄入的每項數據進行統計和分析，定量歸納造模要素和藥物防治特點。

3 結果

3.1 動物

3.1.1 種別 C57BL6小鼠（37篇）、KM小鼠（7篇)、SD大鼠(7篇)、Wistar大鼠(6篇)、豚鼠(4篇)、兔(3篇)、BALB/c小鼠(3篇)、B6CBAF1/J小鼠(2篇)、C3H/Hen小鼠(1篇)、ICR小鼠(1篇)、黑毛白皮西藏小型香豬(1篇)。 C57BL6小鼠為最常用動物，因其皮膚顏色變化有利于判斷皮膚的生長周期，即皮膚為粉紅色時處于休止期階段，皮膚變黑時處于生長期階段[5]。

3.1.2 性別 脫發人群男性高于女性，但在動物實驗中雌性動物（23篇）的使用頻率高于雄性動物（14篇），可能因為雌性動物雄激素含量相對低，制作AGA模型較易。

3.2 造模

松香石蠟拔毛模型利用松香和石蠟(1∶1)粘性拔毛造模（24篇），雄激素性脫毛模型使用丙酸睪酮注射液和甲睪酮干預脫發基因表達來實現造模（13篇），硫化鈉脫毛模型利用硫化鈉和溫和脫毛劑的化學溶解作用來造模（11篇），化療脫發模型使用環磷酰胺注射液對毛囊造成損傷來造模（7篇），脫毛膏脫毛模型使用脫毛膏軟化并毀斷構成毛發的角質蛋白分子鏈來造模（1篇)，斑禿模型使用咪喹莫特膏造成毛囊免疫失調來造模（1篇），碳酸鉈脫毛模型使用碳酸鉈造模（1篇）。松香石蠟模型毛發脫落方式為物理拔毛，其余均為自然脫落。還對不同病理模型所使用動物種別、造模劑量、造模時間、給予部位和給予方式進行統計歸納，詳見表1。

表1 脫毛動物模型的造模情況表

?

3.3 評價指標

3.3.1 一般評價 常見指標有毛囊數（14篇）、毛發長度（14篇）、毛發重量（6篇）、毛細血管數（4篇）、皮脂分泌率（2篇）和終毛毳毛比例（2篇）、真皮厚度、毛發密度和毛細血管管徑各1篇。造模后動物毛囊數、毛發長度、毛發重量、毛細血管數、終毛毳毛比例、真皮厚度和毛細血管管徑均減少或降低，但皮脂分泌率增加。局部血液循環受阻，使毛細血管數減少和管徑降低，毛囊營養不足、變少、變小。與此同時毛囊數所占空間變少，導致真皮厚度降低，是導致脫發的重要因素。吳哲等[8]認為皮脂分泌增多可機械壓迫毛發根部和栓塞毛囊口，同時皮質分泌物中的油酸、亞油酸等過量時對毛囊有毒性作用，導致毛發中毒、枯萎、脫落。廖金鳳等[9]研究表明脫發的病理表現主要是毛囊的微型化，即終毛減少、毳毛增多，終毛比毳毛的比例下降。正常人終毛與毳毛的比例約為7∶1，而在雄激素性脫發的患者中，其比例可以大幅減少到1∶1甚至1∶2。

3.3.2 組織學 48.57%文獻有組織學觀察，環磷酰胺注射液和丙酸睪酮注射液致動物脫毛后皮膚組織可見，毛囊較小、短而細，分布較稀疏，下端退化；毛根鞘消失，外毛根鞘逐漸角化，毛球變平，不成凹陷；毛乳頭逐漸縮小，細胞數減少；毛母質已萎縮呈桿狀，與毛乳頭遠離，毛發呈杵狀末端，毛乳頭停留在毛囊基底近端不能識別。但在前期實驗中發現，松香加石蠟、脫毛膏和硫化鈉導致的脫毛，皮膚組織的病理變化較小，如對毛囊數有影響。

3.3.3 血清激素 常見指標有睪酮（T，7篇）、雌二醇（E2，4篇）、睪酮/雌二醇（T/E2，3篇）、總膽固醇（TCHO，2篇）、甘油三酯（TG，2篇）各和二氫睪酮（DHT，1篇）。AGA主要由于體內雄激素異常導致，T、E2、T/E2和 DHT含量均上升，AGA患者[10]常伴有血脂（TG和TCHO）升高現象。AGA患者的E2水平明顯升高，對雄激素和TCHO抑制作用降低。在AA的發病機制中，由于毛囊異常暴露于潛在免疫活性的免疫系統，再通過毛囊的抗原物質激活強大的免疫系統，誘發釋放大量炎癥因子（IL-2、IL-4、IL-6等），繼而引起脫發，故還可測試血清中炎癥因子。

3.3.4 病理機制 常見指標有血管內皮細胞生長因子（VEGF，9篇），血清肝細胞生長因子（HGF，2篇），胰島素樣生長因子-I（IGF-I）、Bcl-2相關X基因（Bax）、細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、腫瘤壞死因子-R1（TNF-R1）、干細胞因子受體（C-Kit）、I型膠原（Col I）、細胞間粘附分子-1（ICAM-1）和內皮白細胞粘附分子（ELAM-1）各1篇。VEGF、HGF、IGF-Ⅰ、Bcl-2和ColⅠ表達降低，Bax、TNF-R1、C-Kit、ICAM-1、ELAM-1表達增強。Weedon D[11]用電鏡方法研究鼠的毛發退行期時毛囊自然退化機制，認為毛囊變小是由細胞凋亡引起的。Polakowska RR[12]提出Bcl-2的過度表達可抑制皮膚細胞凋亡，當Bax占優勢時，激活膜死亡受體TNF-R1途徑，促進細胞凋亡。處于生長期的頭發毛囊表現出高度血管化，且與 VEGF 的表達相關[13-14]。HGF在真皮乳頭中表達增加，有促進毛囊生長的作用。IGF-Ⅰ可通過刺激體外毛發生長及延緩毛囊進入退行期[15]。ICAM-1和ELAM-1參與毛囊的細胞凋亡和毛囊的退化，當表達量增加時引起毛囊內細胞凋亡提前進入退行期[16]。

3.4 藥物防治

3.4.1 給藥面積 C57BL6小鼠2 cm×2 cm=4 cm2（9篇）、豚鼠3 cm×3 cm =9 cm2（3篇）、KM小鼠2 cm×3 cm=6 cm2（2篇）、兔2 cm×2 cm=4 cm2（2篇）、SD大鼠4 cm×6 cm=24 cm2和 9 cm×7 cm=63 cm2（2篇）、Wistar大鼠 9 cm×7 cm=63 cm2（2篇）、BALB/c小鼠 1.5 cm×2 cm=3 cm2（1篇）和黑毛白皮西藏小型香豬 3 cm×6 cm=18 cm2（1篇）。

3.4.2 給藥方案 多采用涂抹方式給藥，以治療性給藥為主，預防性給藥為輔，給藥周期為26.96±15.72天，與臨床長期給藥的情況類似。

3.4.3 有效性概述 藥物主要通過修復毛囊或改善毛囊周圍的毛細血管從而促進生發作用，如動物皮膚的毛囊數、毛發長度、毛發重量、毛細血管數、終毛毳毛比例、真皮厚度和毛細血管管徑均增加或升高，皮脂分泌率降低；血清中T、E2、T/E2、TCHO、TG和 DHT含量均降低；VEGF、HGF、IGF-Ⅰ、Bcl-2和ColⅠ表達增強，Bax、TNF-R1、C-Kit、ICAM-1、ELAM-1表達降低。

3.4.4 陽性對照藥 多見中西藥結合的治療方式。按照使用頻率依次為：5 %米諾地爾溶液(9篇)、章光101育發劑 (8篇)、生發酊(5篇)、復方醋酸地塞米松軟膏(4篇)、養血生發膠囊(3篇)、安體舒通口服片 (2篇)以及斑禿丸、茶多酚、非那雄胺、敏樂啶洗劑、螺內酯混懸液、滋補生發片(均為1篇)。米諾地爾溶液作為美國 FDA 唯一批準上市的治療脫發的非處方藥，長期外用安全性高，其作用機制為促進真皮乳頭血管形成，增加局部皮膚血流；增加VEGF mRNA及其蛋白表達，同時有助于前列腺素合成，從而促進毛囊生長；促進毛囊上皮細胞的增殖和分化，開放K+通道，抑制Ca2+內流，改變毛發周期，延長毛發生長期、縮短休止期，延后啟動退行期[17-18]。

3.4.5 中藥復方 “一枝好”育發液、補腎活血復方、復方紅花酊、活血補腎合劑、生發擦劑、生發酊、生發靈酊劑、生發靈、舒發康、脫發再生靈、養血生發膠囊、銀杏生發合劑、銀杏合劑、止脫靈和中藥育發液等15個。

3.4.6 中藥材 51種，常用者有何首烏 (13篇)、丹參(11篇)、側柏葉(9篇)、當歸(8篇)、黃芪(7篇)、紅花(7篇)、川芎(6篇)、女貞子(5篇)、茯苓(5篇)、熟地黃(5篇)等。中醫認為毛發脫落：? 先天肝腎虧虛，陰血不足，發失所養所致。何首烏炮制品具有補肝腎，益精血，烏須發，強筋骨作用，又能抑制皮脂的過多溢出，故使用頻率最高。氣血運行不暢，瘀阻毛竅而至毛發脫落。丹參具有祛瘀止痛，活血通經作用，又能祛脂，改善毛囊局部血液循環，使用頻率亦較高。飲食不節，脾失健運，濕熱內蘊，上蒸巔頂，而致發根受損。黃芪具有補氣升陽，固表止汗，生津養血；炙用益氣補中等功效亦較常使用。

4 討論

4.1 動物模型存在的問題及實用性建議

通過歸納整理發現，雄激素性脫毛模型、硫化鈉脫毛模型和化療脫發模型，在不同的文獻中采用的造模劑量和造模時間的差異很大。如雄激素性脫毛模型中丙酸睪酮注射液的劑量從5至0.001 mg?(kg?d)-1，劑量相差5000倍；給藥時間從21至60 d，時間相差39 d。另外，在造模過程中由于造模時間過長，動物的病變可逐漸恢復正常，導致造模效率低、風險大，故應規范和統一造模劑量和時間。

不同脫毛動物模型，因其發病機制不同，適合不同研究需求。如雄激素性脫毛模型，與臨床AGA發病機制相似，適合研究脫發病理機制研究以及藥效的有效性確證，但是造模效率太低；松香加石蠟拔毛模型，適合快速篩選藥物有效性；脫毛膏脫毛模型造模穩定性好，適合評價由于化學性試劑導致脫發病理機制研究；硫化鈉脫毛模型適合洗發劑和染發劑導致的脫發研究；化療脫發模型，適用于化療藥物引起的脫發病理機制研究等。

4.2 中藥治療脫發的作用機制

中藥治療脫發療效顯著，較西藥副作用小、成本低，但機制尚未明確。目前，作用機制主要有：(1)改善毛囊微循環：微循環是微（細）動脈和微（細）靜脈之間微血管的血液循環，微循環障礙使毛囊周圍血管收縮，刺激血管壁平滑肌細胞增殖，最終使局部缺血缺氧，導致毛囊萎縮；通過改善毛囊周圍微循環，調節毛囊生長周期關鍵部位，從而促進毛發生長；(2)調節毛囊周期相關細胞因子：毛囊及其周圍組織存在多種生長因子和細胞因子(VEGF、HGF、IGF-Ⅰ等)及其受體，通過對其干預使毛發生長周期和發育發揮調控作用；(3)調節毛囊細胞凋亡：毛囊變小是因為細胞凋亡引起，通過抑制或降低細胞凋亡來防止脫發；(4)調節體內或者毛囊局部雄激素水平：AGA主要由于雄激素異常導致，通過抑制5α-還原酶或雄激素受體，控制毛發生長基因的表達來防止脫發。

[1] 陳奇.中藥藥效研究思路與方法[M].北京∶人民衛生出版社,2004∶1070.

[2] Otberg N,Finner AM,Shapiro J.Androgenetic alopecia.Endocrinol Metabol Clin North Am,2007,36∶379．

[3] T. C. Wikramanayake .R. Rodriguez，S.C.Lucia M. Mauro .Keyvan Nouri,L. A. Schachner J. [J]. Jimenez.Effects of the Lexington LaserComb on hair regrowth in the C3H/HeJ mouse model of alopecia areata.Lasers Med Sci,2012,27∶431.

[4] 章星琪.斑禿發病機理探討[J].皮膚性病診療學雜志,2015,22(2)∶144.

[5] 楊淑霞,馬圣清,鐘志紅,等.C57BL6小鼠毛發周期動物模型的建立[J].中華皮膚科雜志,1999,32(4)∶252.

[6] 李榮群,景佐,卜夏威,等.腎虛證雄性大鼠脫毛發模型的建立與評價[J].中醫學報,2013,28（11)∶1669.

[7] 羅奇桓.物化作用對大鼠毛發生長的影響[D].武漢∶華中科技大學碩士論文,2008.

[8] 吳哲.生發靈對實驗大鼠血清T、E2、T/E2調節及對毛發的影響[D].長春∶長春中醫藥大學碩士論文,2010.

[9] 廖金鳳.齊墩果酸對小鼠雄激素性脫發治療作用的研究[D].瀘州∶瀘州醫學院碩士論文,2013.

[10] 趙躍華.120例脂溢性脫發患者血脂檢測[J].中國麻風皮膚病雜志,2007,23(4)∶273.

[11] Weedon D, Strutton G．Apoptosis as the mechanism of the involution of hair follicle in catagen transformation[J]．Acta Derm Venereol, 1981, 61(4)∶335.

[12] Polakowska RR, Piacentini M, Bartlett R, Goldsmith LA, et a1. Apoptosis in human skin development：morphogenesis periderm and stem cells[J].Dev Dyn 1994,199(3)∶176.

[13] Kozlowska U,Blume- Peytavi U,Kodelja V,et al.Expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) in various compartments of the human hair follicle[J].Arch Dermatol Res,1998,290(12)∶661．

[14] Yano K,Brown L F,Detmar M.Control of hair growth and follicle size by VEGF- mediated angiogenesis[J].J Clin Inves,2001,107(4)∶409．

[15] 許丹.重組靈芝免疫調節蛋白對脂溢性脫發模型小鼠的作用及其機制研究[D].吉林∶吉林大學碩士論文,2014.

[16] 邢飛,姜波,涂亞庭.米諾地爾外用對化療后小鼠ICA-1和ELAM-1的影響[J].中國麻風皮膚病雜志,2010,26(8)∶545.

[17] 陳晴燕,孫曉杰.脫發藥物治療新進展[J].遼寧藥物與臨床,2003,6(1)∶3.

[18] Rathnayake D,Sinclair R.Male androgenetic alopecia[J].Expert Opin Pharmacother,2010,11 (8)∶ 1295.

Study on the data mining of animal model of alopecia and medical treatment

/SUN Wei-jun, GAN Da-li, WANG Zhang,ZHANG Jing, FAN Gang, YIN Hong-xiang/( Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,, Chengdu 610075, Sichuan)

Objective:To conduct a quantitative study on the modeling factors of animal model of alopecia and medical treatment, thus improving the efficiency of modeling and scientific evaluation of drugs.Method:70 literatures on animal models of alopecia during 1992-2016 were collected. Then the information such as the animal species, sex, drug delivery area, molding reagent,dosage, name of the test drug, positive control drug, and the test indexes was input for quantitative statistics analysis.Result:C57BL6 mouse, KM mouse, SD rat were commonly used, and female were widely employed in the study. Usual drug delivery area was 4cm2(2cm×2cm). The most frequently used molding reagents included wax and resin, testosterone propionate, Na2S, and cyclophamide etc. with varying dosages and wide time span. The back was given the drug in most cases. The number of hair follicles, hair length,hair weight, capillary count, the proportion of terminal hair vellus hair, dermal thickness, capillary diameter, sebum secretion rate and histologic were detected. The levels of serum T, E2, T/E2, TCHO, TG and DHT were also detected. Several mechanism indicators such as VEGF, HGF, IGF-Ⅰ, Bcl-2, ColⅠ, and Bax etc. were involved. The treatment was mainly given with a 27-day drug delivery cycle. Minoxidil and Chinese herbal compound were applied. 51 kinds of medicinal herbs were involved such as Heshouwu, Danshen,Cebaiye, Danggui, Huangqi, Honghua, Chuanxiong, Nvzhenzi, Fuling and Shudahuang etc.Conclusion:There are numerous animal model of alopecia and plenty of indicators in terms of its effective evaluation and action mechanism. However, different model dosages and periods are applied in different literatures, resulting in low efficiency and great risk of failure. Chinese medicine is effective in the prevention and treatment of hair loss, but its mechanism lacks systematicness and depth.

Alopecia; animal model; modeling elements; medical treatment; data mining

R 285.5

A

1674-926X(2017)06-015-05

四川省科技扶貧專項(2017NFP0080)得榮縣光核桃系列健康產品的研究開發與科技精準扶貧示范

成都中醫藥大學，四川 成都 610075

孫位軍，男，在讀碩士研究生；研究方向：中藥理論與實踐應用研究Tel∶15184451197 Email∶swjslj123@163.com

王張，男，碩導，副研究員，主要從事民族藥藥理學研究 Tel∶028-61800274，13558727112 Email∶wzcqcd@163.com

2017-08-17

（責任編輯：陳思敏）