負載槲皮素的大麥醇溶蛋白納米纖維的制備及性質
2017-12-07 05:08:40瑪麗哈巴拜克來
中國糧油學報 2017年11期
瑪麗哈巴·拜克來 管 驍 劉 靜 李 森 吳 雪
(上海理工大學醫療器械與食品學院1，上海 200093) (上海海事大學信息工程學院2，上海 200135)
負載槲皮素的大麥醇溶蛋白納米纖維的制備及性質
瑪麗哈巴·拜克來1管 驍1劉 靜2李 森1吳 雪1
(上海理工大學醫療器械與食品學院1，上海 200093) (上海海事大學信息工程學院2，上海 200135)
利用靜電紡絲技術，制備了不同載藥量的槲皮素/大麥醇溶蛋白載藥納米纖維膜體系，以期成功開發一種功能活性物質的緩釋體系。掃描電鏡結果顯示槲皮素分子很好地分散于大麥醇溶蛋白分子中，隨著槲皮素質量分數的增加，纖維直徑逐漸降低。X射線衍射結果表明槲皮素幾乎以無定形狀態存在于纖維中，負載量過高時，有部分未溶解槲皮素晶體析出。利用差示掃描量熱儀和傅里葉變換紅外光譜儀測試載藥纖維膜的結構特征，結果表明槲皮素和大麥醇溶蛋白之間存在相互作用。體外釋放試驗結果表明大麥醇溶蛋白納米纖維可實現槲皮素緩釋12 h。由此表明本研究開發的大麥醇溶蛋白納米緩釋系統具有良好的應用價值。
大麥醇溶蛋白 槲皮素 靜電紡絲 納米纖維 表征
靜電紡絲是一個簡單而有效的制造納米纖維的技術，它基于將高電壓兩端連接于含有聚合物溶液的注射器針頭和導電接收端[1]，以其低耗并能夠連續生產納米級纖維，而受到廣泛研究。電紡得到的納米纖維具有比表面積大、均一性高、孔隙率高且孔徑之間連通性好等優良性能，同樣是一種方便的技術用以將生物活性物質負載進纖維以獲得多功能納米纖維膜[2-3]。靜電紡納米纖維膜被認為在許多領域都將有巨大的應用潛力，如醫藥、過濾、化妝品、食品工業等[4]。
由于靜電紡纖維材料主要是合成聚合物，造成其在食品、農業和其他相關領域發展緩慢。在最近幾年中，可生物降解、可再生和具有良好生物相容性的天然聚合物，如蛋白質、糖類和脂類作為電紡天然功能性納米纖維材料引起了人們的重視。這些再生納米纖維材料可能是無毒、可食用和可消化的。
蛋白質是構成人體的重要組成部分，安全無毒性、生物相容性好，是作為藥物緩釋載體的優良選擇[5]。蛋白質的電紡先前已有過相關的研究報導，但由于制得的納米纖維膜較差的拉伸強度和耐水性，在很大程度上制約了其應用。谷物醇溶蛋白的研究引起了人們廣泛的興趣，其作為電紡的天然聚合物材料，可以用于制造具有成本效益的納米纖維。大麥醇溶蛋白是大麥中的主要貯存蛋白，是從大麥中提取的疏水性蛋白質，可從淀粉加工副產物、啤酒酒糟中大量獲得，然而，很少在人類食品中使用。主要由于其非極性氨基酸殘基含量高，導致其在水中溶解度低造成的。但是，這些分子特性使醇溶蛋白成為天然的耐水、耐油性材料。除了良好的生物降解性和生物相容性外，醇溶蛋白還具有低親水性、良好的彈性和成膜性。
槲皮素是被廣泛使用的黃酮類物質之一。它存在于許多食物和植物中，如蘋果、茶、蕎麥和洋蔥等。槲皮素由于其生物化學活性引起了科學界的興趣，如消炎、抗過敏、預防癌癥和用于治療前列腺慢性感染，同時還可以用于提高耐力和運動性能。但是，由于其水溶性較差、光、氧不穩定性，限制了其使用[6]。
通過包封技術，活性物質的有效特性可以得到保護。在最近的研究中，通過電紡技術包封抗氧化劑和益生菌，說明電紡作為多功能的微米和納米封裝技術制造功能性食品或作為藥物遞送載體具有巨大的潛力。電紡在包封中最具有吸引力的優點在于它不需要苛刻的實驗條件，無論是溫度還是使用的溶劑，其形成的包封纖維尺寸小，并具有高包封率。將藥物溶于聚合物紡絲溶液中，紡絲過程中，由于溶劑的快速揮發，藥物將以極小的顆粒存在于聚合物纖維中。超細纖維作藥物的載體，具有很高的比表面積，可以提高藥物在水中的溶解速率，尤其是水中溶解度較低的藥物，從而大大提高了藥物的生物利用率。靜電紡絲制備的納米纖維可以用作親水性藥物或憎水性藥物的載體，并且可以通過調節纖維或支架的形態、多孔性和成分比例等來控制藥物的釋放速度。
前期研究了電紡大麥醇溶蛋白制備微米納米級結構的可行性，并優化制備條件。然而，還鮮有利用大麥醇溶蛋白納米纖維作為生理活性物質載體材料方面的研究。在本試驗中，槲皮素作為模型功能性成分，研究使用靜電紡絲作為一種封裝技術，制備和表征大麥醇溶蛋白/槲皮素復合納米纖維，分析加入不同質量分數的槲皮素對大麥醇溶蛋白納米纖維結構和性質的影響。運用掃描電鏡(SEM)觀察制備載藥纖維的形貌，分析藥物與纖維結合的方式。利用傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR)測試載藥纖維膜的結構特征，分析藥物化學性質的變化。運用熱重分析儀(TGA)和差示掃描量熱儀(DSC)分析藥物和載藥纖維的熱學性能及相互作用關系。運用 X-ray 衍射儀(XRD)來分析藥物在纖維中的分布狀態，并分析其藥物釋放性能。本研究的目的是提高大麥資源、難溶性藥物的生物利用度，并起到緩控釋放的作用，開辟了活性物質保護載體材料的新途徑。
1 材料與儀器
1.1 材料與試劑
大麥醇溶蛋白(純度92.6%)：自制；槲皮素(純度≥98%)：上海融禾醫藥科技發展有限公司；正己烷、無水乙醇、異丙醇、冰醋酸、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀、氯化鈉,均為分析純：國藥集團化學試劑有限公司。
1.2 主要儀器和設備
靜電紡絲機：實驗室自組裝；WFJ7200型可見分光光度計：龍尼柯(上海)儀器有限公司；Quanta x50 FEG 掃描電鏡：FEI公司；Nicolet 6700傅里葉變換紅外光譜儀：美國Thermofisher公司；J-20XP冷凍離心機：BECKMAN COULTER公司；Millrock Laboratory Series凍干機：Millrock Technology公司； D/Max 2000 PC全自動X射線衍射儀；熱重分析儀PYRIS1 TGA：美國珀金埃爾默儀器公司；差式掃描量熱儀Q2000：美國TA公司；DZF-6050電熱真空干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司。
2 試驗方法
2.1 大麥醇溶蛋白/槲皮素納米纖維膜的制備
紡絲液的配制：將一定質量的大麥醇溶蛋白粉末溶于冰乙酸配制成濃度為15%(m/V)大麥醇溶蛋白乙酸溶液，將質量分數為5%、10%、15%(相比于大麥醇溶蛋白粉末質量)的槲皮素加入蛋白溶液中，磁力攪拌完全溶解至均一液體。
納米纖維膜的電紡制備：靜置數分鐘后取 5 mL 溶液加入進樣器中利用靜電紡絲機進行電紡，將注射器水平固定在注射泵上，直流高壓電源正極連接到注射器上的針頭，負極與接地鋁箔片接收集相連。電紡參數：紡絲速率1.0 mL/h；接收距離13 cm；紡絲電壓15 kV。室溫下連續收集纖維膜至一定厚度后取下，置于真空干燥箱中干燥以備用。
2.2 納米纖維膜形貌表征及性質測試
形貌觀察：電紡絲纖維的形態通過場發射掃描電子顯微鏡進行分析。樣品分析前進行噴金處理。電鏡加速電壓15kV，基于所得SEM圖像，使用Image J 軟件測量所制備的纖維直徑，每個樣品中至少測量50根纖維并取平均值。
傅里葉變換紅外光譜分析：試樣納米纖維經壓片后進行衰減全反射傅里葉變換紅外光譜分析，波數范圍為400～4 000 cm-1，分辨率為4 cm-1。
熱重分析法：用熱重分析儀(TGA)測定槲皮素和電紡纖維的熱性能。在氮氣保護下使用PYRIS1 TGA設備(25 mL/min的速率)以10 ℃/min的加熱速率從50 ℃升至600 ℃的進行TGA分析。
差示掃描量熱法：稱取大約 4～5 mg大麥醇溶蛋白納米纖維、槲皮素-大麥醇溶蛋白復合納米纖維進行差示掃描量熱分析。條件為：用氮氣為氛(靜態)，以空鋁盒作為參比，升溫速率為10 ℃/min，從室溫加熱到250 ℃。
物理形態分析：利用X射線衍射儀(XRD)對槲皮素以及槲皮素-大麥醇溶蛋白電紡絲纖維的物理狀態進行了研究。以CuKa射線(λ=1.54 nm)為靶材，功率為40 mV、300 mA，掃描速度為5(°)/min，2θ的掃描范圍為5°～60°。
2.3負載槲皮素大麥醇溶蛋白納米纖維的釋放行為
稱取負載不同質量分數槲皮素的大麥醇溶蛋白納米纖維膜各10 mg，平行稱取3組。將上述納米纖維膜放入到裝有 50 mL PBS 緩沖溶液 (pH=7.4)的錐形瓶中，錐形瓶放置在恒溫水浴(37 ℃) 搖床中，轉速設為 100 r/min，在設定的時間間隔內取 1.0 mL 的釋放液，在并補加1.0 mL PBS 緩沖溶液到錐形瓶，保持體積恒定，在槲皮素的最大吸收波長375 nm處測定吸光值，再對應標準曲線方程計算藥物濃度及釋藥量，然后計算累積釋藥百分率并作累積釋藥曲線。
3 結果與討論
3.1 大麥醇溶蛋白/槲皮素復合纖維形貌分析
圖1為不同含量槲皮素的大麥醇溶蛋白靜電紡納米纖維掃描電鏡照片。在掃描電鏡照片中幾乎觀察不到槲皮素的結晶顆粒，這表明，槲皮素大部分被包埋在纖維內部，也有部分與纖維均勻共混。負載槲皮素質量分數為5%、10%、15%復合納米纖維的平均直徑分別為1 088、1 076、854 nm，結果表明隨著槲皮素含量的增加，復合納米纖維的平均直徑變得越來細，隨著槲皮素含量的增加，纖維直徑分布范圍變大。可能是由于槲皮素的加入增加了溶液的電導率，增加了噴射流表面電荷密度，從而使噴射流載有更多的電荷，導致電紡射流不穩定鞭動，噴射細流被高度拉伸從而產生更細的纖維，另一方面如果電荷太多，分布不勻將會出現黏連和分支。
隨著槲皮素含量的增加，纖維膜顏色加深；在掃描電鏡照片中，制得的是光滑均勻的纖維，確定了在電紡過程中沒有發生相分離，槲皮素良好地分散于纖維中，部分被包埋在纖維的內部，部分與纖維共混。
圖1 不同含量槲皮素的大麥醇溶蛋白/槲皮素靜電紡納米纖維的SEM照片
3.2 復合纖維紅外光譜分析
學生寫作語言的形成，不僅是來自于其平時的語文知識積累，同時也是其生活經驗的一種積累。著名作家老舍、莫言等人的文章中，之所以具有著深厚的生活韻味，就是其平時對生活中的點滴感悟而形成的一種醇厚語言形式。這也進一步說明了實際生活對于豐富學生寫作語言的重要性。在平時的教學中，教師應當善于引導學生對于自身生活的一種總結與感悟，這樣可以有效的讓學生寫作語言富有生活情懷，提高文章的深度。
負載槲皮素的大麥醇溶蛋白紅外光譜圖如圖2中b～d所示，觀察到槲皮素的特征峰幾乎都發生了轉移、強度降低。在載藥纖維中屬于槲皮素的在1 243、1 200、1 167cm特征吸收峰強度也有不同,明顯隨著槲皮素在載藥纖維中的比例增加，這些吸收峰逐漸增強。
注：a大麥醇溶蛋白納米纖維，b 5%，c 10%，d 15%，e 槲皮素。圖2 大麥醇溶蛋白納米纖維及不同含量槲皮素的大麥醇溶蛋白/槲皮素靜電紡納米纖維傅里葉紅外光譜圖
圖3為槲皮素和電紡纖維的X射線衍射圖案。槲皮素XRD衍射譜圖中存在許多尖峰，表明在衍射角為2θ時，槲皮素是具有一定晶型的晶體材料，在6.3°、10.8°、12.5°、23.9°等地方出現特征衍射峰。為了觀察電紡過程對槲皮素和大麥醇溶蛋白物理狀態的影響，將大麥醇溶蛋白和槲皮素粉末以100∶15的比例混合并進行掃描，物理混合物在10.8°、12.6°、27.4°出現特征衍射峰，表明槲皮素在混合物中依然以結晶狀態存在，并沒有形成新的物理狀態。
大麥醇溶蛋白的圖案為寬的衍射峰，表明其為無定形態，靜電紡絲后槲皮素衍射峰消失，表明槲皮素分子由結晶態變為無定形態藥物，與載體之間發生了一定的復合作用，槲皮素和大麥醇溶蛋白分子間存在相互作用，若沒有相互作用，則每種成分會在衍射峰圖中顯示出自己的晶區特征峰，不會有峰疊加的效果。然而，當電紡纖維負載質量分數為15%的槲皮素時，存在部分強度較低的槲皮素晶體衍射峰，也許這是由于過量的槲皮素不能完全溶解在溶劑系統中造成的， Kayaci等[12]的研究中也有類似結果。
注：a大麥醇溶蛋白粉末，b 大麥醇溶蛋白納米纖維，c 5%，d 10%，e 15%，f 槲皮素。圖3 大麥醇溶蛋白粉末、納米纖維及不同含量槲皮素的大麥醇溶蛋白/槲皮素靜電紡納米纖維X射線衍射圖
3.3 復合纖維熱性能分析
圖4為槲皮素和載藥復合纖維的熱重(thermogravimetric TG)和微分熱重(derivative thermogravimetric DTG)曲線，從圖4可以看到槲皮素熱重曲線上出現了2個失重峰，第1次失重出現在102 ℃附近，此時的失重多是水分蒸發引起的，356 ℃處的失重峰為槲皮素的分解引起的。可以從圖中獲悉槲皮素在50～600 ℃的總失重率為70%，而在290～400 ℃范圍內失重率達到45%，說明槲皮素失重主要是在此范圍，通過DTG的峰形可以進一步確定槲皮素開始熱分解的溫度在300 ℃之前。純大麥醇溶蛋白納米纖維曲線表明其主要失重發生在250～410 ℃范圍內，跟蛋白質降解有關，由DTG曲線可知大麥醇溶蛋白分解溫度約為325 ℃。
圖4 大麥醇溶蛋白納米纖維及不同含量槲皮素的大麥醇溶蛋白/槲皮素靜電紡納米纖維熱重(TGA)和微分熱重(DTG)曲線
負載槲皮素的大麥醇溶蛋白復合纖維質量損失隨著槲皮素質量分數的增加而減少，可能是由于槲皮素比例的增加，其與蛋白質之間相互作用增加，難以分解,因此殘留的質量也就更多，導致了較高的穩定性。負載槲皮素的大麥醇溶蛋白納米纖維降解溫度與純大麥醇溶蛋白納米纖維相比稍有降低。
圖5 大麥醇溶蛋白納米纖維及10%含量槲皮素的大麥醇溶蛋白/槲皮素靜電紡納米纖維差示掃描量熱(DSC)曲線
差示掃描量熱法在高分子熱行為研究中得到廣泛應用。玻璃化轉變溫度是高分子的鏈段從運動到凍結或反之的一個轉變溫度，鏈段的運動是通過主鏈的內旋轉來實現的，顯然玻璃化轉變溫度取決于聚合物的柔順性。
槲皮素與大麥醇溶蛋白之間產生了氫鍵作用。在形成槲皮素-大麥醇溶蛋白納米纖維以后，體系的玻璃化轉化溫度由176 ℃降低到165 ℃，這可能是由于槲皮素作為一種低分子質量的化合物，在聚合物高分子鏈之間起到了連接作用，減少了肽鏈之間的聯系，促進了肽鏈的流動性[15]。因此，可以推論槲皮素分子化地分散在大麥醇溶蛋白基質中。
3.4 復合納米纖維釋放性能研究
研究了所制備的含有槲皮素的大麥醇溶蛋白納米纖維的體外藥物釋放性能，由于靜電紡絲過程中幾乎沒有藥物損失，近似認為所制備的載藥纖維中藥物理論含量與實際含量相同。以藥物質量分數為5%、10%、15%的載藥纖維b、c和d為研究對象,進行了體外藥物釋放試驗。
圖6為槲皮素在 37℃下的釋放曲線，前1 h 3種載藥纖維的藥物釋放速率遠大于后面的釋放速率，具有初期突釋效應。釋放總量分別為 55.1%、 61.1%、73.7%。隨著纖維膜中含量的增加，藥物的初期突釋效應也變得明顯。所有曲線都表現出一定的突釋現象，可能是納米纖維表面吸附的藥物分子溶解在緩沖溶液中，最終導致測試開始時存在一個快速釋放期。另外，隨著載藥量增加，釋藥速率和累積釋藥百分率均依次增大，3種藥物均呈現此規律。一是因為載藥量大的纖維單位體積內藥物含量多，纖維內藥物濃度大，藥物擴散濃度梯度大，這就更有利于纖維上的藥物擴散溶解到釋放介質中。二是因為載藥量大的纖維，纖維直徑減小，所以其比表面積增大，纖維與緩沖溶液的接觸面積增大，所以藥物釋放量增多。
注：a 5%，b 10%，c 15%。圖6 復合纖維中槲皮素體外釋放曲線
由于纖維膜在水中是逐漸溶脹的，槲皮素無論是以分子水平分散在載體中，還是以固體顆粒形式存在，釋放是由纖維膜在水中的溶脹控制的。而大麥醇溶蛋白納米纖維膜具有較高的比表面積，以固體溶液或極小的晶體顆粒形式存在于其中的槲皮素，擴散路徑相對較短，與釋放介質的接觸面積大，釋放速率都較高。藥物釋放的速率隨著藥物含量的增加而增大。
通過數學模擬，發現載藥量不同的復合纖維藥物釋放規律都是相同的，即符合Peppas模型。載藥量為5%、10%、15%的擬合方程分別為Q=57.7t0.17(R2=0.96)，Q=64.4t0.15(R2=0.92)，Q=75.9t0.12(R2=0.87)。
一般認為，當n≤0.43時，藥物的釋放機理為 Fick 擴散；當 0.43
即開始釋放較快，后期釋放較慢。開始釋放快是由于藥物在纖維表面有分布，通過擴散的方式釋放出來，后期釋放慢，是由于分布在纖維內部的藥物要克服聚合物分子鏈的阻礙才能到達緩沖液中，其釋放速度自然不會太快。
4 結論
應用靜電紡絲技術，以槲皮素為模型藥物，以大麥醇溶蛋白為載體高分子材料，制備出載藥量不同的槲皮素/大麥醇溶蛋白載藥納米纖維膜。SEM結果顯示藥物分子很好地分散于大麥醇溶蛋白分子中，隨著槲皮素質量分數的增加，纖維直徑逐漸降低。當載藥量過高時，有少許晶體析出。DSC和傅里葉變換紅外光譜儀測試載藥纖維膜的結構特征，表明槲皮素和大麥醇溶蛋白之間存在相互作用。XRD結果表明槲皮素幾乎以無定形狀態存在于纖維中，負載量過高時，有部分未溶解晶體析出。體外釋放試驗結果表明大麥醇溶蛋白納米纖維有明顯的初期突釋現象，隨著槲皮素質量分數提高突釋現象更明顯，對釋放曲線進行擬合，表明載藥納米纖維最符合Peppas模型，釋放藥物特征最符合擴散機制。
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Preparation and Characterization of Quercetin-Loaded Hordein Electrospun Fibers
Malihaba Baikelai1Guan Xiao1Liu Jing2Li Sen1Wu Xue1
(School of Medical Instrument and Food Engineering, University of Shanghai for Science and Technology1, Shanghai 200093) (College of Information Engineering, Shanghai Maritime University2, Shanghai 200135)
Hordein nanofibers loaded with quercetin were successfully prepared by using an electrospinning process in this study. Different amount of quercetin was incorporated into the fibers to develop an encapsulating system for functional ingredient delivery using electrospinning technique. SEM micrographs showed that a homogeneous and defect-free structure of the composite nanofibers was obtained. With the increase of the quercetin content, the diameter of nanofibers decreased gradually. X-ray diffraction analysis suggested that quercetin presented in the composite nanofibers was in an amorphous state. Some undissolved quercetin crystal maybe precipitated when excess content happened. Attenuated total reflection-fourier transform infrared (ATR-FTIR) indicated that the interaction between quercetin and hordein exists. The thermal behavior of quercetin-hordein was investigated using thermogravimetric analyses (TGA), and different thermal stability of the fabricated complex before and after the quercetin incorporation was attested.Invitrorelease assay ensure the efficiency of the developed fibers in sustaining the release of quercetin up to 12 h. This study confirmed the possibility of incorporation of quercetin in the production of bio-nanofibers that will have good potential in multi-purpose applications.
hordein, quercetin, electrospinning, nanofiber, characterization
TS17
A
1003-0174(2017)11-0137-07
上海市自然科學基金(14ZR1419200)
2017-04-07
瑪麗哈巴·拜克來，女，1994年出生，本科，食品科學
管驍，男，1979年出生，副教授，食品生物納米材料
