瑞舒伐他汀預處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷后E選擇素的影響

黃云達，楊 波，王洪雄，黃 偉

（大理大學第六附屬醫院，昆明 650011）

瑞舒伐他汀預處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷后E選擇素的影響

黃云達，楊 波，王洪雄，黃 偉*

（大理大學第六附屬醫院，昆明 650011）

目的：觀察瑞舒伐他汀預處理對SD大鼠心肌缺血再灌注損傷過程中E選擇素的影響。方法：取健康的雄性SD大鼠共36只，隨機分為3組（n=12），即假手術組；缺血再灌注組：先缺血30 min，再灌注180 min；瑞舒伐他汀預處理組：給予瑞舒伐他汀10 mg∕kg，灌胃給藥1次∕d，連續3 d，于末次灌胃后，先缺血30 min，再灌注180 min。三組大鼠再灌注180 min后取缺血心肌組織，檢測缺血區心肌細胞E選擇素的表達水平。結果：瑞舒伐他汀預處理組大鼠心肌細胞E選擇素的表達水平均明顯低于缺血再灌注組（P＜0．01）。結論：瑞舒伐他汀預處理可以對大鼠心肌缺血再灌注損傷起到一定的保護作用，其機制可能通過減少大鼠心肌細胞E選擇素的表達，從而減輕炎性細胞浸潤。

瑞舒伐他汀；大鼠；心肌缺血再灌注損傷；E選擇素

急性心肌梗死是心肌組織供血中斷后引起的心肌缺血性壞死，盡快恢復血供是搶救瀕臨死亡心肌的最有效方法，目前臨床上采用溶栓治療或PCI（冠狀動脈介入手術）治療實現再通，雖然能獲得明顯的效果，但不容忽視的是再灌注后不僅不能使器官、組織功能恢復，反而加重器官、組織的結構損傷和功能障礙，造成心肌更為嚴重和持久的損害。目前我國急性心肌梗死的發病率呈逐年上升趨勢〔1〕。因此，如何防治心肌梗死后的心肌缺血再灌注損傷成為近年來關注的熱點。目前已知的心肌缺血再灌注損傷的發生機制主要包括血管內皮細胞功能受損、炎性細胞的浸潤、心肌細胞凋亡、氧自由基生成增加、能量代謝障礙、鈣超載等等，其中炎癥反應在心肌缺血再灌注損傷中起關鍵作用〔2〕。近年來大量臨床及動物試驗均證實他汀類藥物不僅可以降低血脂，減少心血管事件的發生率，并且具有調脂以外的心肌保護作用。大量研究發現他汀類藥物的非降脂心肌保護作用主要包括減輕血管內皮損傷、抗炎、抑制心肌凋亡、清除氧自由基、抗氧化作用、逆轉心肌肥大等〔3〕。他汀類藥物的這些保護作用對于治療心肌缺血再灌注損傷具有重要的臨床意義，尤其對急性心肌梗死（AMI）、急性冠脈綜合征（ACS）、冠脈血管重建術后存在心肌缺血再灌注損傷的患者更應盡早應用，減少冠脈事件再發生率及死亡率〔4〕。

前期研究已證實，瑞舒伐他汀預處理具有心肌保護作用，如心肌缺血再灌注損傷的保護〔5-6〕，本研究立足于瑞舒伐他汀的抗炎作用。目前E選擇素在心血管疾病中的作用已成為臨床研究熱點之一。E選擇素水平的表達與動脈粥樣硬化等許多炎癥情況的表達有關，目前認為E選擇素水平的變化反映了細胞表面成分的翻轉及蛋白質的水解，可作為疾病活動的標志〔7〕。故研究E選擇素在心肌缺血再灌注損傷中是否表達，從而闡述心肌缺血再灌注損傷中炎癥發生的可能機制。

1 實驗材料和方法

1．1大鼠灌胃給藥SD雄性大鼠購買自昆明醫科大學（合格證號：SCXK（滇）2005-0009），體重介于120～200 g，共36只，將其隨機分配為3組，每組12只，分別是：假手術組，缺血再灌注組，瑞舒伐他汀預處理組。假手術組及缺血再灌注組每只大鼠分別按20 mL∕kg給予生理鹽水灌胃；瑞舒伐他汀預處理組按10 mg∕kg灌胃給藥；連續給藥3 d后進行缺血再灌注損傷模型構建。

1．2大鼠心肌缺血再灌注模型的構建按體重3 mL∕kg以100 g∕L水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，并將其固定于仰臥位，與心電圖機連接（心電圖機為昆明醫科大學機能實驗室提供），記錄實驗過程中心電圖的變化。剔除心前區體毛后進行常規消毒，經左側第4肋間切口逐層分離皮下組織、開放胸腔暴露心臟。找到左冠狀動脈，于左心耳下緣1 mm處以6-0無菌線完全結扎左冠狀動脈，心電圖上顯示ST段明顯弓背向上抬高（≥0．2 mV），表示結扎成功，缺血30 min后，松解結扎線進行再灌注180 min。假手術組只分離埋線，不結扎左冠狀動脈，其余同手術組。

1．3缺血區心肌組織的確定再灌注180 min經腔靜脈注入1%Evans blue液3 mL進行左室心肌染色后，處死大鼠，迅速取出心臟，以磷酸緩沖液（PBS，pH 7．4）沖洗，用濾紙吸干表面水分，置于-20℃冰箱中快速冷卻30 min后，將心臟剪去心耳和右心室，切成2 mm厚的薄片，于1%TTC溶液中37℃溫孵15 min，所得心肌組織切片藍色部分為非缺血區，磚紅色部分為缺血未梗死區，灰白色部分為梗死區。

1．4 E選擇素（E-selectin）的含量檢測E選擇素ELSIA試劑盒購于武漢華美生物科技公司。取出試劑盒，室溫（18～25℃）下放置至少30 min，按照說明書配制好所需試劑備用。將缺血區心肌組織勻漿，加樣：取出96孔板，根據待測樣品數量加上標準品的數量選擇所需的板條數，冷藏處理剩余板條。分別設標準品孔（7個濃度）、待測樣品孔和空白對照孔。每孔分別加標準品或待測樣品100 μL輕輕晃動混勻，空白對照孔加入100 μL的蒸餾水，覆上板貼，置于37℃溫育2 h；棄去液體，甩干，洗滌3次；每孔加入生物素標記抗體工作液100 μL，貼上新的板貼，置于37℃溫育1 h；棄去孔內液體，甩干，洗板3次，每次浸泡2 min，300 μL∕孔，甩干；每孔加入辣根過氧化物酶標記親和素工作液100 μL，貼上新的板貼，置于37℃溫育1 h；棄去孔內液體，甩干，洗板5次，每次浸泡2 min，300 μL∕孔，甩干。顯色：依序每孔加底物溶液90 μL，37℃避光顯色15～30 min（為保證實驗結果的準確性，底物反應時間到后盡快加入終止液。在加入底物溶液后每隔一段時間觀察一下顯色情況以控制反應時間。當肉眼見標準品前3～4孔有明顯梯度藍色，后3～4孔不明顯時，加入終止液終止反應，此時藍色立刻變成黃色）。終止：依序每孔加終止液50 μL，終止反應。讀板：在反應終止后盡快（5 min內）用酶標儀在450 nm波長測量各孔的OD值。

1．5統計學分析用統計軟件SPSS 16．0及Excel進行數據分析，所有數據以（xˉ±s）表示，兩組之間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0．05為差異具有統計學意義。

2 實驗結果

2．1大鼠心肌組織肉眼見結果經TTC和Evans blue染色后所得心肌組織切片，藍色部分為非缺血區，磚紅色部分為缺血未梗死區，灰白色部分為梗死區。肉眼所見缺血再灌注組及瑞舒伐他汀預處理組缺血梗死區面積大于假手術組，而瑞舒伐他汀預處理組缺血未梗死區面積大于缺血再灌注組。見圖1。

圖1 大鼠心肌組織肉眼切面圖

2．2 E選擇素（E-selectin）的含量檢測結果通過ELSIA法檢測不同組中大鼠心肌組織中E選擇素的含量，實驗數據與實驗OD值函數關系見圖2。實驗數據用單因素方差分析的One way-ANOVA進行統計分析，瑞舒伐他汀預處理組和缺血再灌注組缺血區心肌細胞E選擇素的表達水平均高于假手術組（P＜0．01），但瑞舒伐他汀預處理組大鼠心肌細胞E選擇素的表達水平均明顯低于缺血再灌注組（P＜0．01）。見表1。

圖2 大鼠心肌組織E選擇素濃度與實驗檢測所得OD值的函數關系

表1 瑞舒伐他汀預處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷心肌細胞E選擇素的影響

表1 瑞舒伐他汀預處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷心肌細胞E選擇素的影響

注：與假手術組相比*P＜0．001，**P＜0．01；與缺血再灌注組相比#P＜0．01。

E選擇素∕（pg∕mL）975．3±130．2 2 232．7±251．2*1 306．5±314．6**#組別假手術組缺血再灌注組瑞舒伐他汀預處理組數量∕只12 12 12

3 討論

急性心肌梗死發生后，通過溶栓等療法早期恢復缺血部位的血供能夠挽救缺血的心肌細胞、防止梗死范圍的擴大。但是復灌會造成心肌細胞損傷加重的現象〔8〕。目前已經證實多種中西藥具有減輕缺血再灌注損傷的療效，其中，他汀類藥物的療效尤為突出〔9-10〕。瑞舒伐他汀（rosuvastatin，RSV）是一種選擇性3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（HMGCoA）還原酶抑制劑，是目前最新研發的水溶性他汀，有穩定斑塊的作用，在臨床上主要用于高脂血癥及冠心病的二級預防治療〔11〕。目前已有大量基礎實驗證實瑞舒伐他汀與其他他汀類藥物一樣對心肌缺血再灌注損傷有保護作用〔12-15〕。其保護作用得益于改善內皮功能、抗炎、抗凋亡及抗氧化機制。

本研究立足于他汀的保護血管內皮功能及抗炎作用。炎癥的中心環節是由選擇素調節的中性粒細胞與血管內皮的黏附，主要是中性粒細胞沿著血管內皮細胞的滾動。E選擇素于1985年被科學家發現，1989年其基因被克隆〔16〕。E選擇素曾被稱為“內皮細胞白細胞黏附分子”，現已被統一命名為E選擇素或CD62E。E選擇素是誘導性黏附分子，介導白細胞在組織損傷和炎癥區域的滾動，參與主要的炎性反應，脂多糖、IL-1（白細胞介素-1）、TNF-α（腫瘤壞死因子α）均可刺激內皮細胞合成E選擇素。E選擇素是血管內皮細胞受損的標志，它在白細胞與血管內皮細胞黏附的過程中起重要作用，只在細胞因子激活的血管內皮細胞表達，主要介導白細胞與血管壁黏附的首發階段〔17〕。目前E選擇素在心血管疾病中的作用成為臨床研究熱點之一。E選擇素水平的表達與動脈粥樣硬化等許多炎癥情況的表達有關，目前認為E選擇素水平的變化反映了細胞表面成分的翻轉及蛋白質的水解，可作為疾病活動的標志〔7〕。故研究E選擇素在心肌缺血再灌注損傷中是否表達，從而闡述心肌缺血再灌注損傷中炎癥發生的可能機制。

實驗結果提示：瑞舒伐他汀預處理組和缺血再灌注組缺血區心肌細胞E選擇素的表達水平均高于假手術組（P＜0．01），但瑞舒伐他汀預處理組大鼠心肌細胞E選擇素的表達水平均明顯低于缺血再灌注組（P＜0．01）。

他汀類藥物的多效性作用使其應用范圍逐步擴大，包括減少心肌缺血再灌注損傷，其中負荷量給藥及藥物親水性差異是其發揮作用的關鍵〔18-21〕。本實驗檢測心肌炎癥因子E選擇素的變化來闡明缺血后處理的保護機制與減輕炎癥反應的相關性，在國內尚未見到該方面的研究。瑞舒伐他汀預處理能減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷，這種作用可能與其降低再灌注心肌炎性細胞因子表達相關，而不依賴于其降脂作用，為瑞舒伐他汀預處理的臨床應用提供了新的理論依據。

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（責任編輯 李 楊）

Effects of Rosuvastatin Pretreatment on E Selectin after Myocardial Ischemia Reperfusion Injury in Rat

Huang Yunda,Yang Bo,Wang Hongxiong,Huang Wei*
（The Sixth Affiliated Hospital of Dali University,Kunming 650011,China）

Objective：To observe the effects of rosuvastatin on the expression of E selection in treating myocardial ischemiareperfusion injury in SD rats．Methods:36 male healthy SD rats were randomly divided into 3 groups（n=12）,including the sham operation group,the ischemia reperfusion group with 30 min of ischemia and 180 minutes of reperfusion,and the minand rosuvastatin pretreatment group which was given rosuvastatin 10 mg∕kg,fasting lavage once-daily for 3 consecutive days and reperfusion of 180 min after the final lavage before 30 min of ischemia．After 180-min reperfusion in the 3 groups the myocardial tissue of ischemic zone was taken to detect the expression level of E selection in ischemic myocardium．Results：The expression level of E selection in the myocardial cells of rosuvastatin pretreatment group was significantly lower than that of ischemia reperfusion group（P＜0．01）．Conclusion：Rosuvastatin preconditioning on myocardial ischemia reperfusion injury in rats has a protective effect;the mechanisms may be related to the fact that the infiltration of inflammatory cells decreases as the myocardial cells of rats with E selection expression reduce．

rosuvastatin calcium tablets;rats;myocardial ischemia reperfusion injury;E selection

R654．2

A

2096-2266（2017）10-0029-04

10．3969 ∕j．issn．2096-2266．2017．10．007

云南省應用基礎研究計劃資助項目（2013FD094）

2017-04-19

2017-05-06

黃云達，住院醫師，主要從事心血管疾病的診治研究．*通信作者：黃偉，主任醫師．