不同抗生素對小鼠結(jié)腸吲哚胺2，3-二氧化酶及樹突狀細胞表達的影響

楊 雁，趙 麗，周丹丹，張 燕

(四川大學(xué)華西醫(yī)院消化內(nèi)科，四川 成都 610041)

不同抗生素對小鼠結(jié)腸吲哚胺2，3-二氧化酶及樹突狀細胞表達的影響

楊 雁，趙 麗，周丹丹，張 燕

(四川大學(xué)華西醫(yī)院消化內(nèi)科，四川 成都 610041)

目的探討口服抗生素改變小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)，檢測吲哚胺2，3-二氧化酶(IDO)及樹突狀細胞(DC)在小鼠腸道黏膜中的表達情況。方法將Babl/c小鼠分成對照組，甲硝唑組和慶大霉素組各5只，分別灌胃生理鹽水、甲硝唑和慶大霉素共7日。第8日在無菌環(huán)境中處死小鼠并收集小鼠結(jié)腸。使用WesternBlot法檢測小鼠腸道IDO的表達，流式細胞術(shù)檢測腸道DC的表型，免疫熒光法檢測腸道IDO和CD11c陽性細胞的數(shù)量。結(jié)果甲硝唑組小鼠結(jié)腸IDO表達低于對照組(P= 0.003)和慶大霉素組(P= 0.010)。各組CD40、CD80、CCR7、CD103表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05)。甲硝唑組CD86表達高于對照組(P= 0.003)，慶大霉素組CD86表達與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P= 0.107)。免疫熒光顯示甲硝唑組CD11c和IDO雙陽性細胞比例較對照組低(P= 0.004)，慶大霉素組與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P= 0.908)。結(jié)論不同抗生素口服后對小鼠結(jié)腸黏膜IDO及DC的表達影響不同。

腸道菌群；吲哚胺2，3-二氧化酶；樹突狀細胞；甲硝唑；慶大霉素

腸道菌群結(jié)構(gòu)穩(wěn)定是維持腸道免疫功能正常的重要條件，腸菌紊亂可能會導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生。人類腸道中存在著大量微生物，并且種類繁多[1]。這些微生物參與腸道免疫系統(tǒng)的建立，一方面腸內(nèi)正常的共生菌可以被機體識別形成免疫耐受避免過度的炎癥反應(yīng)，另一方面腸道內(nèi)的細菌可以通過促進調(diào)節(jié)型T細胞(regulator-T cell，Treg)分化發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[2]。Treg是調(diào)節(jié)腸道免疫耐受功能的主要細胞。樹突狀細胞(dendritic cell，DC)及其產(chǎn)生的吲哚胺2，3-二氧化酶(indoleamine 2，3-diozygenase，IDO)是刺激Treg分化的重要通路[3]。IDO是色氨酸代謝為犬尿氨酸過程中的限速酶，除了促進Treg分化外，IDO還可以促進Th1細胞、B細胞、NK細胞凋亡。IDO發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用主要依賴于消耗環(huán)境中的必需氨基酸色氨酸，進而抑制淋巴細胞或微生物的增殖；另外色氨酸經(jīng)IDO代謝產(chǎn)生的多種代謝產(chǎn)物可介導(dǎo)T細胞的死亡[4]。IDO主要由抗原提呈細胞產(chǎn)生，DC是IDO的重要來源。2016年5～12月作者探討使用抗生素7天后改變腸道菌群組成后腸道IDO以及DC功能的改變，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物15只6～8周齡雌性Balb/c小鼠，購于成都達碩實驗動物中心，分成對照組、甲硝唑組和慶大霉素組各5只。

1.2造模灌胃給藥(0.2 ml/只)，對照組給予生理鹽水，每日兩次；甲硝唑組給予甲硝唑60 mg/kg，每日兩次；慶大霉素組給予慶大霉素注射液45 mg/kg，每日早上灌胃一次，下午用生理鹽水0.2 ml代替。共造模7日。于實驗第8天在無菌環(huán)境中脫頸處死小鼠，取小鼠結(jié)腸組織。

1.3WesternBlot測腸道IDO表達提取小鼠結(jié)腸全蛋白，測定蛋白濃度。配置SDS-PAGE凝膠，電泳、轉(zhuǎn)膜、曝光，使用Quality One 4.6.2分析條帶灰度值，計算各樣本IDO/GAPDH的比值。

1.4流式細胞儀檢測腸道DC細胞使用膠原酶Ⅳ0.6 mg/ml，Dnase 50μg/ml消化小鼠結(jié)腸得到單個細胞懸液。避光分兩管孵育流式抗體CD11cPE、CD86 PE-cy7、CD40 APC、CD80 FITC和CCR7 APC、CD103 FITC。設(shè)置同型對照，PI標記死細胞。檢測DC細胞相對數(shù)量和細胞表型。

1.5免疫熒光取小鼠結(jié)腸常規(guī)石蠟包埋切片。4 ℃孵育IDO一抗(兔抗鼠，1∶40)，CD11c一抗(豚鼠抗鼠，1∶40)過夜，然后加入二抗工作液(山羊抗兔，1∶200，山羊抗豚鼠，1∶400)孵育，DAPI染核。使用全自動正置熒光顯微鏡400倍鏡下拍片，Zen軟件進行圖像分析。計數(shù)CD11c(綠色)陽性細胞數(shù)和CD11c、IDO(紅色)雙陽性細胞數(shù)，并計算雙陽性細胞數(shù)占CD11c陽性細胞數(shù)的比值。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法使用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用方差分析及LSD-t法，若方差不齊，采用獨立樣本的非參數(shù)檢驗。P< 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1腸道IDO的表達WesternBlot檢測顯示三組IDO表達水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=8.337，P= 0.007)。其中甲硝唑組結(jié)腸IDO(0.27±0.08)表達低于對照組(0.93±0.33，t=3.863，P= 0.003)和慶大霉素組(0.84±0.25，t=-3.160，P= 0.010)。對照組和慶大霉素組IDO表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.331，P= 0.606)，見圖1。

圖1 Western Blot法檢測各組小鼠結(jié)腸IDO的表達情況

2.2腸道DC細胞數(shù)量和表型各組DC細胞相對數(shù)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P= 0.159)，見表1。比較CD11c陽性細胞中各表型的比例，各組CD40、CD80、CCR7、CD103差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05)，三組CD86表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=6.777，P= 0.011)。甲硝唑組CD86陽性率高于對照組(t=-3.680，P= 0.003)，但與慶大霉素組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.936，P= 0.077)。慶大霉素組CD86陽性率與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=-1.744，P= 0.107)，見圖2。

表1 各組DC細胞表型*

*CD11c為CD11c陽性細胞數(shù)與細胞總數(shù)的百分比，余表型百分數(shù)為各表型陽性細胞數(shù)與CD11c陽性細胞數(shù)的比值

圖2 各組CD86陽性率

2.3免疫熒光IDO在結(jié)腸上皮層、固有層中均有表達。三組IDO陽性細胞數(shù)量不同(F=8.135，P= 0.006)。甲硝唑組腸道CD11c+IDO雙陽性細胞數(shù)占CD11c陽性細胞數(shù)[(27.19±16.27)%]比例最低，明顯低于對照組[(63.97±10.36)%，t=3.550，P= 0.004]和慶大霉素組[(62.75±20.80)%，t=-3.423，P= 0.005]。慶大霉素組與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.117，P= 0.908)，見圖3。

圖3 結(jié)腸組織免疫熒光(Х400) 藍色為DAPI顯示細胞核，綠色為CD11c，紅色為IDO，第三列中綠色箭頭指示CD11c和IDO雙陽性的細胞。

3 討論

人體的腸道菌群構(gòu)成在一段時間內(nèi)是穩(wěn)定的，抗生素可以影響腸菌構(gòu)成。腸道菌群結(jié)構(gòu)改變可以影響機體的免疫功能，其中機制尚不十分清楚。

甲硝唑是一種硝基咪唑類抗生素，主要作用于原蟲、厭氧菌。研究顯示服用甲硝唑后可以改變腸道菌群組成。Marie-agnes等[5]向健康大鼠的飲水中加入甲硝唑(1 mg/ml)一周后，發(fā)現(xiàn)大鼠結(jié)腸粘膜及糞便中的腸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量明顯增加。C57BL/6小鼠接受甲硝唑處理后乳桿菌屬、雙歧桿菌屬數(shù)量增加[6]。而Ivan等在獼猴的研究中發(fā)現(xiàn)腸道中的乳桿菌可以抑制IDO1，應(yīng)用益生菌制劑VSL#3(含有4種乳桿菌、3種雙歧桿菌和1種鏈球菌)后IDO的表達降低[7]。人免疫缺陷病毒(HIV)感染患者IDO的表達量常增加[8]，使用包含乳桿菌屬、雙歧桿菌屬、鏈球菌屬的益生菌制劑治療6個月后，HIV患者腸道中IDOmRNA表達量下降[9]。單獨應(yīng)用約氏乳酸菌可以直接降低大鼠IDO的表達及活性[10]。以上結(jié)果提示服用甲硝唑后腸道內(nèi)腸桿菌、乳桿菌數(shù)量增加將會導(dǎo)致腸道IDO降低。

慶大霉素是一種氨基糖苷類抗生素，主要作用于革蘭氏陰性桿菌，如大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌、奇異變形桿菌和革蘭氏陽性菌中的金黃色葡萄球菌。在嬰兒中同時使用慶大霉素和氨芐西林后腸道中變形菌門數(shù)量增加，放線菌門(包括雙歧桿菌)、乳桿菌數(shù)量下降[11]。慶大霉素可以使組織中產(chǎn)生過氧化氫、超氧陰離子等造成氧化應(yīng)激，而過氧化氫可以抑制IDO的活性[10]。因此在慶大霉素組中腸道IDO水平?jīng)]有變化可能是綜合作用的結(jié)果。

非炎癥時期腸道中的DC主要為非成熟DC，低表達MHC-Ⅱ和CD40、CD80、CD86的共刺激分子，在受到炎癥刺激后，DC高表達MHC-Ⅱ、CD40、CD80、CD86轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒霥C，并遷徙至T細胞富集區(qū)域或淋巴結(jié)，刺激T細胞分化，分泌TNF-α等因子[12]促進免疫反應(yīng)。Li等[13]使用頭孢曲松造成腸道菌群紊亂后腸道中DC細胞中MHC-II、CD40、CD80、CD86表達下降。DC細胞是通過不同的模式識別受體如Toll樣受體、NOD樣受體等識別不同的病原體[14]。不同的抗生素處理后腸道菌群與不同的模式識別受體作用，可能導(dǎo)致了DC表型的差異。我們的研究顯示經(jīng)甲硝唑處理后小鼠結(jié)腸黏膜CD86升高而IDO水平降低，目前尚未見相關(guān)報道，具體機制尚不清楚。但有一種新型的IDO特效抑制劑INCB024360在體外抑制DC表達IDO后卻伴有CD86增加，而CD40，CD80，CD83水平?jīng)]有明顯改變[15]。

本研究具有一定的局限性，未能對甲硝唑及慶大霉素導(dǎo)致的菌群改變做進一步的分析，因此無法具體分析腸道菌群失調(diào)與IDO及DC細胞表達的直接聯(lián)系。綜上，我們的研究顯示經(jīng)口服甲硝唑處理后小鼠結(jié)腸IDO表達下降，CD86表達增高，結(jié)腸黏膜中CD11c和IDO雙陽性細胞比例較低。口服慶大霉素處理后小鼠結(jié)腸黏膜中IDO和CD86表達與對照組無統(tǒng)計學(xué)差異，提示不同抗生素口服后對小鼠結(jié)腸黏膜IDO及DC的表達影響不同。

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Effectsofalteredintestinalmicrobiotaonintestinalindoleamine2，3-dixoygenaseanddendriticcellsinmice

YANGYan，ZHAOLi，ZHOUDan-dan，ZHANGYan

(DepartmentofGastrointestinal，WestChinaHospital，Chengdu610041，China)

ZHANGYan

ObjectiveTo investigate the expression of intestinal indoleamine 2，3-dixogenase (IDO) and dendritic cells by oral antibiotics to alter the mice intestinal microbiota.MethodsBabl/c mice were randomly divided into control，metronidazole and gentamycin groups，5 mice in each group.The mice were given normal saline，metronidazole and gentamycin，respectivelly by gavage for 7 days.On the 8 th day，all mice were sacrificed in sterile enviroement and the colons were collected to measure the expression of IDO by using western blot.DC phenotype was analyzed by flow cytometry.Immunofluorescence was used to assess the number of IDO and CD11c double positive cells in the colons.ResultsThe IDO expression was much lower in the metronidazole group than that in the control goup (P= 0.003) and gentamycin group (P= 0.010).There was no significant difference in the expressions of CD40，CD80，CCR7 and CD103 (P> 0.05) among the three groups.The expression of CD86 was higher in the metronidazole group than that in the control group (P= 0.0003) while not elevated in the gentamycin group (P=0.107).By immunofluorenscence，the number of CD11cand IDO double positive cells in the metronidazole group was lower than that in the control group (P= 0.004) while no difference was found between the gentamycin group and the control group (P=0.908).ConclusionOral different biotics may have different influence on the expression of IDO and DC in mice colon.

Intstinal microbiota；IDO；DC；Metronidazole；Gentamicin

張 燕

四川省科技廳科研基金資助項目(編號：2014 SZ0002-12)

R392.12

A

1672-6170(2017)06-0041-03

2017-03-21；

2017-05-23)