腰椎間盤退行性改變患者ADAMTS-7表達及其機制研究

姜棚菲，馬張穩，張民澤，鄧亞軍

(延安大學附屬醫院骨科，陜西 延安 716000)

腰椎間盤退行性改變患者ADAMTS-7表達及其機制研究

姜棚菲，馬張穩，張民澤，鄧亞軍

(延安大學附屬醫院骨科，陜西 延安 716000)

目的探討新型金屬蛋白酶(ADAMTS-7)在腰椎間盤退行性改變患者中表達情況，并探討其作用機制。方法2014年3月至2016年2月我院手術切除腰椎間盤突出癥患者退變的椎間盤組織40例(依據后外層纖維破裂與否分為破裂組及未破裂組)及同期腰椎骨折患者正常腰椎間盤組織20例(對照組)，采用半定量RT-PCR及免疫組織化學技術對不同髓核組織中腫瘤壞死因子(TNF-α)、ADAMTS-7進行定性定量檢測。結果TNF-α表達量隨腰椎間盤退變程度加重而增加，ADAMTS-7蛋白在對照組腰椎間盤髓核組織呈現弱陽性表達，在未破裂組及破裂組椎間盤髓核組織中分別呈陽性表達及強陽性表達；3組ADAMTS-7蛋白表達量、mRNA表達量及TNF-α mRNA表達量由高到低排序為破裂組>未破裂組>對照組(P< 0.05)。結論ADAMTS-7及TNF-α在腰椎間盤退行性改變患者髓核組織中存在高表達現象，并且退變程度越重其表達量越多，而作用機制可能與7 ADAMTS-7及TNF-α在腰椎間盤退行性病變中表達呈正反饋通路加速其病程進展有關。

腰椎間盤；退行性改變；ADAMTS-7；TNF-α；機制

腰椎間盤屬于人體重要組成部分，主要位于脊柱兩椎體之間，并由髓核、纖維環及軟骨終板組成，近年來腰椎間盤突出癥已成為中老年人中較為常見脊柱退行性疾病之一[1]。臨床將腰椎間盤突出癥定義為椎間盤纖維環破裂后，突入到椎管內的髓核、殘留纖維環及覆蓋在其表面的后韌帶壓迫鄰近神經根而產生的臨床綜合征，對患者身心健康造成嚴重影響[2]。目前臨床對其發病機制尚未完全明確，早期學者研究指出在長期不良機械負荷下，當施加在椎間盤壓力超過椎間盤自身膨脹力時，會引發髓核破裂出血，表明機械應力損傷在椎間盤突出癥病理過程中發揮重要作用[3]；而隨著臨床對本病病理研究的逐漸深入，細胞因子、炎性介質等在椎間盤突出癥中的作用的研究日益廣泛，近期有研究報告指出ADAMTS-7可能參與腰椎間盤退行性改變疾病演變過程中[4]，但尚未完全明確，為此筆者展開臨床對照研究，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料2014年3月至2016年2月我院手術切除腰椎間盤突出癥患者退變的椎間盤組織40例(依據后外層纖維破裂與否分為破裂組及未破裂組)及同期20例腰椎骨折患者正常腰椎間盤組織(對照組)。納入標準：①符合腰椎間盤突出癥相關診斷標準；②入院后經MRI診斷確診；③納入研究前無慢性腰背痛史；④符合赫爾辛基宣言，自愿簽署相關知情同意書；⑤首次確診為腰椎間盤突出癥。排除標準：①合并惡性腫瘤；②妊娠期及哺乳期婦女；③合并急慢性炎癥性疾病；④合并自身免疫性疾病或結締組織疾病；⑤對本研究依從性不好。所有標本在采集前均已告知，患者及其家屬知情并自愿簽署知情同意書，本院倫理委員會批準同意。其中破裂組18例，男12例，女6例，年齡25～60歲[(45.18±6.25)歲]，椎間盤節段：L3-4、L4-5、L5-S1各3、10、5例；未破裂組22例，男14例，女8例，年齡27～58歲[(46.31±6.58)歲]，椎間盤節段：L3-4、L4-5、L5-S1各5、12、5例；對照組20例，男15例，女5例，年齡24～58歲[(44.98±6.52)歲]，椎間盤節段：L3-4、L4-5、L5-S1各5、10、5例。三組基線資料比較差異均無統計學意義(P> 0.05)；具有可比性。

1.2方法石蠟切片HE染色：①石蠟切片制作：將采集的髓核組織制成標本，采用4%的甲醛固定液將其固定10 h，固定后的組織塊在脫水前必須采用流水液將其固定液清洗干凈，脫水硬化后，將組織塊由無水酒精中取出，并放入二甲苯及無水酒精等量混合溶劑中1 h左右，隨后包埋，并修整蠟塊，展片的同時將其粘好，最后烘干待用；②切片HE染色：脫蠟處理后，對切片進行染色處理，染色成功后取出切片以蓋玻片蓋住，將封好的切片放置于恒溫箱中干燥處理。ADAMTS-7 mRNA表達量測定：①RNA提取：從-70 ℃超低溫冰箱中取出腰椎間盤髓核組織標本80 mg放在研缽內，將組織塊放置于研缽中，加入少量液氮，迅速研磨，待組織變軟，再加入少量液氮研磨，重復3次將組織加入Trizol后，室溫下靜置5 min使其完全裂解，并將其放入-70 ℃低溫處保存，常規離心去除沉淀后，并經過純化最終待用；②RNA濃度測定，定量取RNA樣品2 μL，采用紫外分光光度計Q5000對RNA在260 nm下的吸光度進行定量，并最終采用RT-PCR檢測RNA。ADAMTS-7蛋白質表達量測定：①烤片將切片置于60 ℃烤箱中3 h，脫蠟入水，放入1%甲醇雙氧水，室溫10 min后，蒸餾水洗1次，于切片上滴加抗原修復液，室溫放置10 min，在切片上滴定正常山羊血清封閉液，室溫20 min后，將多余液體甩出去，隨后在切片上滴加生物素化第二抗體，室溫20 min；切片上滴加辣根酶標記鏈酶卵白素工作液，直至DAB顯色，蘇木素染色1 min后，用自來水沖洗干凈，采用中性樹脂封片，每次實驗采用PBS代替第一抗體做陰性對照；②結果判斷：ADAMTS-7蛋白在免疫組織化學檢測中，細胞漿著色呈棕黃色者為陽性細胞，深棕黃色表明強陽性表達，深棕黃色為弱陽性表達，而無著色為陰性表達。

1.3觀察指標與檢測判定①人體腰椎間盤髓核組織TNF-α、ADAMTS-7表達情況。②髓核組織中ADAMTS-7蛋白表達量比較。③髓核組織中TNF-α、ADAMTS-7 mRNA表達量比較。

1.4統計學方法采用SPSS 19.0統計學軟件對數據進行分析和處理。計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗；計數資料比較采用χ2檢驗。P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1人體腰椎間盤髓核組織TNF-α、ADAMTS-7表達情況對照組髓核細胞多為單個髓核細胞(圖1a)，未破裂組髓核細胞輕度聚集，呈現雙核形態(圖1b)，破裂組髓核細胞高度聚集，呈多核形態，細胞聚集，成纖維細胞增多，纖維化明顯，并且隨著腰椎間盤退變程度加重，TNF-α表達量隨之增加(圖1c)。ADAMTS-7在對照組腰椎間盤髓核組織髓核組織呈現弱陽性表達(圖2a)；ADAMTS-7蛋白在未破裂組及破裂組椎間盤髓核組織中分別呈現陽性表達及強陽性表達(圖2b，2c)。

2.2三組髓核組織中ADAMTS-7蛋白表達量比較

三組ADAMTS-7蛋白表達量由高到低排序為破裂組>未破裂組>對照組(P< 0.05)，見表1。

圖1 髓核組織TNF-α表達 a：對照組；b：未破裂組；c：破裂組

圖2 髓核組織ADAMTS-7表達 a：對照組；b：未破裂組；c：破裂組

組別ADAMTS?7蛋白表達量對照組(n=20)028±010破裂組(n=18)066±030未破裂組(n=22)051±021

2.3三組髓核組織中TNF-α、ADAMTS-7mRNA表達量比較破裂組TNF-α、ADAMTS-7 mRNA表達量高于未破裂組及對照組，而未破裂組TNF-α、ADAMTS-7 mRNA表達量高于對照組(P< 0.05)，見表2。

表2 三組TNF-α、ADAMTS-7 mRNA表達量比較

3 討論

腰椎間盤是一種位于相鄰兩腰椎椎體之間的纖維軟骨盤，現代醫學研究表明椎間盤退變過程較為復雜，其不僅表現在形態學上的變化，并伴隨著椎間盤組織學及生化性質的系統性變化，而一旦椎間盤退變時，其基質降解會隨之增加，使得髓核突出而壓迫脊神經根或脊髓，最終會引起椎間盤源性腰背部疼痛及相應的神經根的病變[5]。腰椎間盤生理性退變與患者年齡、椎間盤營養供應減少、自身免疫、炎性間質、細胞因子等有關，而近期相關指出ADAMTS-7在腰椎間盤突出癥疾病發生及進展中發揮著重要作用[6]。

ADAMTS-7是一種含有Ⅰ型血小板結合蛋白基序解聚蛋白樣金屬蛋白酶，早期研究就證實了其在哺乳動物及無脊椎動物的體內廣泛存在[7]，其與解聚蛋白樣金屬蛋白酶ADAMs及基質金屬蛋白水解酶等屬于家屬蛋白酶家族成員，其中蛋白多糖聚酶ADAMTS-7被認為參與椎間盤退變過程，由于髓核一半成分為聚集蛋白聚糖，而蛋白聚糖的降解可引起髓核的退變，因而臨床考慮其可能參與腰椎間盤退行性病變過程中[8]。筆者于本文展開臨床對照性研究，本研究結果顯示，隨著腰椎間盤退變程度加重，TNF-α表達量隨之增加，ADAMTS-7蛋白在對照組腰椎間盤髓核組織呈現弱陽性表達，而其在未破裂組及破裂組椎間盤髓核組織中分別呈陽性表達及強陽性表達。研究結果還顯示，三組ADAMTS-7蛋白表達量、mRNA表達量及TNF-α mRNA表達量由高到低排序：破裂組>未破裂組>對照組，初步證實了ADAMTS-7在腰椎間盤退行性病變患者中存在高表達現象，并且隨著腰椎間盤退行性病變患者疾病嚴重程度加重，其ADAMTS-7及TNF-α表達量隨著增加，與既往文獻報告相符[9]。由于ADAMTS是髓核細胞退變過程中的一類重要關鍵酶，很長時間內，ADAMTS與髓核退變關系成為臨床研究熱點，而早期研究中主要發現了ADAMTS-4、ADAMTS-5在髓核組織中呈明顯高表達現象[10]，而有關ADAMTS-7在腰椎間盤退行性病變患者中的相關性研究較少；國外學者動物實驗研究指出ADAMTS-7的高表達可引起幼鼠短趾畸形和軟骨骨化障礙，并且當其高表達時可加速關節軟骨破壞及骨性關節病程進展[11，12]；而本研究結果證實了ADAMTS-7及TNF-α在腰椎間盤退行性病變過程中起到重要作用，與另一骨性關節炎模型試驗得出的ADAMTS-7可上調TNF-α的表達及活性，而TNF-α可通過NF-κB信號通路誘導ADAMTS-7表達，并證實在軟骨退變和骨性關節炎病程進展中ADAMTS-7與TNF-α共同促進正反饋回路的觀點相符[13]。

綜上所述，ADAMTS-7與TNF-α在腰椎間盤退行性病變過程中發揮重要作用，ADAMTS-7促進腰椎間盤退行性病變進展的可能機制與TNF-α通過NF-κB信號通路誘導ADAMTS-7表達有關。

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ExpressionofADAMTS-7anditsmechanisminpatientswithdegenerativechangesinlumbarintervertebraldisc

JIANGPeng-fei，MAZhang-wen，ZHANGMin-ze，DENGYa-jun

(DepartmentofOrthopedics，AffiliatedHospital，Yan’anUniversity，Yan’an716000，China)

ObjectiveTo investigate the expression of new type metalloproteinase (ADAMTS-7) in patients with degenerative lumbar disc and explore its mechanism.MethodsThe degenerative lumbar disc tissue samples from 40 patients with lumbar disc herniation undergoing the surgical resection of the degenerative disc tissue in our hospital from March 2014 to February 2016 were collected.The samples were divided into the rupture group and the non-rupture group based on whether the posterior outer fiber ruptured or not.At the same time，normal lumber disc tissue samples from 20 patients with lumbar vertebrae fractures were also collected as the control group.Qualitative and quantitative detection of tumor necrosis factor α (TNF-α) and ADAMTS-7 were performed by using semi-quantitative RT-PCR and immunohistochemistry.ResultsThe expression levels of TNF-α was increased with the degree of degeneration of lumbar intervertebral disc.ADAMTS-7 protein was shown weakly positive expression in the nucleus pulposus of the lumbar intervertebral disc in the control group while it was positive and strongly positive expression in the nucleus pulposus of the rupture group and the non-rupture group.The expression levels of ADAMTS-7 protein，mRNA and TNF-α in the three groups ranged from high to low：the rupture group > the non-rupture group > the control group (P< 0.05).ConclusionThere are high expressions of ADAMTS-7 and TNF-α in the nucleus pulposus of patients with degenerative changes in lumbar intervertebral disc.The more serious degeneration is，the higher expression level is.The mechanism may be related to the expressions of ADAMTS-7 and TNF-α as the positive feedback pathways，which can accelerate the disease progression of the degenerative lesions in lumbar intervertebral disc.

Lumbar intervertebral disc；Degenerative changes；ADAMTS-7；TNF-α；Mechanism

陜西省自然科學基金資助項目(編號：2012 JM741203)

R681.5+3

A

1672-6170(2017)06-0101-04

2017-03-21；

2017-05-23)