基于高內涵分析的甘草炮制雷公藤減毒作用研究△

馬致潔，董捷鳴，王伽伯，龐晶瑤，3*，浦仕彪

(1.首都醫科大學 附屬北京友誼醫院，北京 100050；2.解放軍302醫院 全軍中藥研究所，北京 100039；3.首都醫科大學 附屬北京潞河醫院藥劑科，北京 101149；4.云南中醫學院 中藥學院，云南 昆明 650200)

基于高內涵分析的甘草炮制雷公藤減毒作用研究△

馬致潔1，董捷鳴1，王伽伯2，龐晶瑤1，3*，浦仕彪4*

(1.首都醫科大學 附屬北京友誼醫院，北京 100050；2.解放軍302醫院 全軍中藥研究所，北京 100039；3.首都醫科大學 附屬北京潞河醫院藥劑科，北京 101149；4.云南中醫學院 中藥學院，云南 昆明 650200)

目的在體外L02肝細胞模型上觀察甘草炮制雷公藤的減毒效果，為研究雷公藤低毒飲片提供依據。方法采用高內涵分析技術，檢測細胞存活情況，比較甘草炮制雷公藤和配伍雷公藤的減毒差異。結果雷公藤對肝細胞的損傷呈劑量依賴性，在IC50的劑量下，甘草炮制雷公藤和甘草配伍雷公藤都有顯著的減毒效果。結論采用高內涵分析方法更加直觀、具體地反映了甘草炮制雷公藤的減毒效果，為臨床安全用藥提供參考。

雷公藤；甘草；炮制減毒；高內涵分析

雷公藤始載于《神農本草經》，具有祛風除濕、通絡止痛、解毒殺蟲等功效?，F代藥理研究表明雷公藤具有抗炎、殺菌、解熱鎮痛及多種免疫調節功能。因雷公藤毒性較大，傳統方法外用較多，直至1974年首次將其內服用于治療類風濕性關節炎，并取得良好的療效。國內外大量基礎研究和臨床大規模、隨機、雙盲的前瞻性試驗均證實，雷公藤是迄今為止治療某些自身免疫性疾病療效最為確切的一味中藥[1-3]，幾乎沒有其他中藥可以替代。但常見的肝腎毒性嚴重制約著其臨床應用，因此開展雷公藤減毒新方法的研究具有重要的現實意義。

中醫理論認為炮制是緩解藥物毒性的有效措施之一，但雷公藤炮制方法鮮有古籍文獻記載，且目前常用的炮制方法減毒效果不佳。近年來對其研究主要集中在配伍減毒增效方面[4-6]，配伍甘草減毒的應用已具有較好的實驗和臨床基礎[7-9]，并且有學者對其主要成分進行結構修飾以期達到存效減毒的目的。

如法炮制是降低中藥毒性的重要方法，加輔料是毒性中藥炮制的常用方法，液體輔料常用到的有酒、醋、蜂蜜、姜汁以及甘草汁等，其中甘草性平、味甘，具有補脾益氣，可調節藥性，緩急解毒，歷代醫書對甘草解毒也廣為記載和流傳。但甘草作為保肝、護肝的常用解毒中藥，卻很少見其應用于具有肝毒性中藥的炮制。因此本課題組在中醫理論的指導下，擬從中藥炮制減毒的角度入手，采用甘草汁炮制雷公藤，在L02肝細胞模型上，借助高內涵分析方法，評價甘草汁炮制雷公藤的減毒效果，為開展雷公藤炮制減毒的相關研究提供基礎，同時也為雷公藤的臨床合理應用提供參考。

1 材料和儀器

1.1 試劑和藥物

RPMI1640完全培養基、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素、磷酸鹽緩沖液、二甲基亞砜(DMSO)，(Gibco公司)，96孔板(Costar 3599，康寧公司)，錫箔紙，除菌濾器(25 mm，0.22 μm)，細胞培養瓶(430720，康寧公司)，Hochest 33342(H3570，生命科學)，SYTOX?Orange Nucleic Acid Stain(S11368，生命科學)。

對乙酰氨基酚對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：100018-201409)；甘草由北京友誼醫院中藥房提供(批號：SAA11；產地：內蒙古)；雷公藤藥材，采自福建三明，經首都醫科大學附屬北京友誼醫院中藥劑科趙奎君主任藥師鑒定為衛矛科植物雷公藤TripterygiumwilfordiiHook.F.的干燥根。

1.2 儀器

高內涵篩選系統(ImageXpress Micro XL，Molecular Devices公司)，常規倒置顯微鏡(上海澤權儀器設備有限公司)，恒溫二氧化碳培養箱(NAPCO公司)，TC10TM自動細胞計數器(Bio-Rad公司)，臺式低速離心機(湖南赫西儀器裝備有限公司)，超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)，AL204微量分析天平(Mettler Toledo公司)，KQ5200E超聲提取清洗器、LGJ-18型冷凍干燥機(北京西四環科學儀器廠)，SN510C高壓蒸氣滅菌器(重慶雅馬拓科技有限公司)。

2 方法

2.1 樣品制備

2.1.1 雷公藤藥材提取方法 稱取600 g雷公藤生藥材，打粉機打碎成粗顆粒狀。8倍體積(4800 mL)60%的乙醇水浸泡12 h后，超聲提取3次，每次45 min，過濾，合并3次濾液。濾液于旋轉蒸發儀濃縮至一定體積后冷凍干燥成粉末，備用。

2.1.2 甘草配伍雷公藤制備方法 稱取已粉碎的雷公藤藥材粗顆粒600 g，生甘草片200 g，置于同一容器。6400 mL溶劑中浸泡12 h后，超聲提取3次，每次45 min，過濾，合并3次濾液。濾液于旋轉蒸發儀濃縮至一定體積后，冷凍干燥成粉末，備用。

2.1.3 甘草汁炮制雷公藤制備方法 稱取雷公藤生藥材600 g(打粉機打碎成粗顆粒狀)及生甘草飲片200 g。

2.1.3.1 甘草汁制備方法 8倍體積的純凈水(1600 mL)浸泡甘草飲片30 min，煎煮20 min，煎煮液濾出，相同步驟重復煎煮兩次后合并濾液，濃縮至合適體積(約200 mL需能完全浸泡雷公藤)，備用。

2.1.3.2 甘草汁炮制雷公藤方法 用上述所得甘草汁浸泡雷公藤30 min，待甘草汁基本被雷公藤藥材吸盡；于恒溫100 ℃炒10 min至雷公藤藥材表面不粘手，得雷公藤炮制品。

2.1.3.3 雷公藤炮制樣品的提取方法 取上述制得的雷公藤炮制品，按照2.1.1項下雷公藤藥材提取制備方法，制得雷公藤炮制品的供試樣品。

2.2 正常人肝L02細胞的細胞毒性評價方法

正常人肝L02細胞，在含有10%的胎牛血清、100 U·mL-1的青霉素、100 μg·mL-1的鏈霉素的培養基中，37 ℃、5% CO2條件下進行常規培養，實驗均在細胞生長對數期進行。細胞均勻接種在96孔板中，每孔5000個細胞，鋪板24 h后給藥(由于雷公藤提取物不易溶于水，每孔細胞加入0.1%的DMSO助溶)，待給藥24 h后進行熒光染色。本實驗采用二重熒光標記法，用濃度為1 μmol·L-1的SYTOX?Orange Nucleic Acid Stain(Abs/Em：547/570 nm)標記死細胞的細胞核顯橙色，用質量濃度為1 μg·mL的Hochest 33342(Ex/Em：350/461 nm)標記所有細胞的細胞核顯藍色，于37 ℃避光孵育15 min后，由高內涵儀器直接對細胞進行成像分析。統計結果，并分析各孔的細胞存活情況。

2.3 統計方法

用ImageXpress Micro XL高內涵軟件對圖像進行分析處理，實驗數據以GraphPad Prism 5.0、OriginPro 8.5、IBM SPSS Statistics 20軟件處理，所有數據均采用獨立樣本t檢驗進行統計學分析，設P<0.05具有統計學差異。

3 結果

3.1 雷公藤提取物對正常人肝L02細胞的毒性分析及其IC50值

本實驗設10個質量濃度梯度(C1～C10)，分別為12、9、6、3、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625 mg·mL-1，最高質量濃度為12 mg·mL-1，用ImageXpress Micro XL高內涵儀器，采用二重熒光標記法(Hochest 33342標記所有的細胞，SYTOX?Orange Nucleic Acid Stain標記死細胞)，以每孔活細胞的百分比作為評價指標，用GraphPad Prism 5.0軟件處理，結果lgIC50值為-0.127 3，計算IC50值為0.746 mg·mL-1(約0.75 mg·mL-1)，見圖1。

圖1 雷公藤提取物作用于肝L02細胞的IC50值

3.2 雷公藤配伍甘草對肝細胞減毒作用的比例篩選

為進一步篩選甘草減弱雷公藤對肝細胞毒性作用的適宜配比，本實驗采用0.75 mg·mL-1雷公藤與不同質量濃度(0.25、0.125、0.083 mg·mL-1)的甘草進行配伍，雷公藤與甘草的比例分別是3∶1，6∶1，9∶1，比較雷公藤單用(0.75 mg·mL-1)及與甘草不同配伍比例(3∶1，6∶1，9∶1)對細胞的抑制效果。圖2結果顯示，3∶1與6∶1的比例在肝細胞體外實驗上都能達到有效的減毒效果。但考慮到甘草在體內的首過效應等問題，為保證體內減毒效果，故選擇較大的甘草的比例[雷公藤-甘草(3∶1)]進行后續實驗研究。

注：*P<0.05,下同。圖2 雷公藤與甘草不同配伍比例樣品的細胞抑制率

3.3 高內涵分析方法評價雷公藤不同樣品作用于肝細胞的毒性情況

實驗取雷公藤對肝細胞毒性的IC50值為0.75 mg·mL-1，對乙酰氨基酚3 mg·mL-1作為肝細胞毒性的陽性對照，甘草與雷公藤的配伍比例為1∶3，甘草炮制雷公藤用藥比例為1∶3，分析比較雷公藤單用、甘草炮制雷公藤、雷公藤配伍甘草作用于細胞的毒性差異。

配制高質量濃度的雷公藤溶液，稀釋為0.75 mg·mL-1(含0.1%的DMSO)，配制含等濃度雷公藤的甘草汁炮制品(雷公藤炮品)和雷公藤配伍甘草的樣品(雷公藤配品)，稀釋的終濃度樣品同樣含有0.1%的DMSO，陽性對照和空白對照也加入0.1%的DMSO。將各樣品均勻加入到預先種好的細胞中，復6孔，24 h后染色分析。用ImageXpress Micro XL高內涵儀器分析，采用二重熒光標記法(Hochest 33342標記所有細胞顯藍色，SYTOX?Orange Nucleic Acid Stain標記死細胞顯橙色)，以細胞抑制率作為評價指標，用OriginPro 8.5軟件作圖。

圖3 高內涵染色技術分析雷公藤不同樣品對肝細胞的作用

從圖3細胞核染色情況來看，陽性對照組與雷公藤組的細胞毒性作用較大，死細胞數目較多，而雷公藤炮制品與配品的死細胞數目相對較少，細胞毒性較小。由圖4的細胞抑制率更能準確反映出對乙酰氨基酚和雷公藤對細胞的毒性作用之大，同時反映出甘草炮制雷公藤可有效減低肝細胞的毒性，其減毒效果與雷公藤配伍甘草相當，且P<0.05，差異具有統計學意義。

圖4 雷公藤不同樣品的細胞抑制率

4 討論

研究結果顯示，在細胞水平上，甘草汁炮制雷公藤與雷公藤配伍甘草兩種方法都能有效降低雷公藤對肝細胞的毒性作用，且甘草汁炮制的雷公藤更便于臨床應用，為以后開發雷公藤的低毒飲片奠定基礎。

本研究選擇人正常肝細胞系L02細胞，結合高內涵分析技術評價甘草炮制雷公藤的減毒效果。高內涵分析技術是近幾年發展起來的新藥篩選技術，該技術在保留了高通量能力的基礎上，不再是在分子水平針對某種單一靶標進行的篩選，而是在細胞水平針對生物體內多系統、多途徑、多種靶標進行的實施動態篩選，提供了細胞水平全方位的檢測平臺，為藥物毒理學研究提供了高效的使用工具[10]。

并且該技術已廣泛用于新藥研發的早期篩選、毒性評價及毒性機制的研究等方面[11]。本實驗利用其高通量、直觀動態監測的優勢，嘗試對甘草炮制雷公藤減毒作用進行早期評估，研究結果顯示甘草炮制雷公藤能有效降低雷公藤對肝細胞的毒性，為后續深入研究提供參考。后期課題組將在此基礎上開展甘草炮制雷公藤減毒的體內效果評價及機制研究，為雷公藤的臨床合理用藥提供科學依據。

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CompatibilityAttenuatedResearchofGlycyrrhizaConcoctedTripterygiumwilfordiiBasedonHighContentAnalysis

MAZhijie1，DONGJieming1，WANGJiabo2，PANGJingyao1，3*，PUShibiao4*

(1.BeijingFriendshipHospital，CapitalMedicalUniversity，Beijing100050，China；2.ChinaMilitaryInstituteofChineseMedicine，302MilitaryHospital，Beijing100039，China；3.DepartmentofPharmacy，BeijingLuheHospitalAffiliatedtoCapitalMedicalUniversity，Beijing101149，China；4.TraditionalChineseMedicineCollegeYunnanUniversityofTCM，Kunming650200，China)

Objective：To observe the compatibility attenuated effect ofGlycyrrhizaconcoctedTripterygiumwilfordiion L02 hepatocyte modelinvitro，and provide the basis for the study ofT.wilfordiilow toxicity decoction pieces.MethodsThe effects of concocted attenuating and compatibility attenuated ofGlycyrrhizaandT.wilfordiiwere compared by using High Content Analysis technology.ResultsA dose dependent relation existed betweenT.wilfordiiand hepatic cells injury，that bothGlycyrrhizaconcoctedT.wilfordiiandGlycyrrhizacompatibilityT.wilfordiihad a significant attenuated effect under the dose of IC50.ConclusionConcocting attenuated effect ofGlycyrrhizaandTripterygiumwilfordiiwas specifically reflected through High Content Analysis technology，the results provide reference for clinical safe drug use.

Tripterygiumwilfordii；Glycyrrhiza；concocting attenuated；High Content Analysis

首都衛生發展科研專項(首發2016-4-2024)；北京市醫院管理局“青苗”人才培養計劃項目(QMI20160106)；北京友誼醫院院啟動項目(YYDQKT2014-20)

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龐晶瑤，臨床藥師，研究方向：中藥藥理，E-mail: pjy101411@163.com；浦仕彪,博士，副教授，研究方向：肝病的中醫診療研究，E-mail: pushi511@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.11.013

2017-01-12)