動脈粥樣硬化大鼠頸總動脈糖皮質激素誘導的腫瘤壞死因子受體配體的表達及意義

汪強　谷惠敏　王楷文

(江蘇省昆山市第一人民醫院心血管內科，*中心實驗室，江蘇昆山　215300)

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·論著·

動脈粥樣硬化大鼠頸總動脈糖皮質激素誘導的腫瘤壞死因子受體配體的表達及意義

汪強谷惠敏王楷文*

(江蘇省昆山市第一人民醫院心血管內科，*中心實驗室，江蘇昆山215300)

摘要目的： 通過檢測動脈粥樣硬化大鼠頸總動脈中糖皮質激素誘導的腫瘤壞死因子受體配體(glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor ligand， GITRL)的表達，探討GITRL在動脈粥樣硬化過程中的變化及意義。方法：建立大鼠動脈粥樣硬化模型，取其頸總動脈，觀察粥樣硬化病變，采用免疫組織化學及蛋白質印跡(Western blotting)法檢測GITRL的表達。結果：動脈粥樣硬化大鼠頸總動脈的血管壁脂質沉積明顯增多；彈性纖維不完整，連續性破壞、中斷。動脈粥樣硬化大鼠頸總動脈血管內GITRL的表達水平明顯高于非動脈粥樣硬化大鼠。結論：GITRL作為高脂飲食后表達上調的一種血管炎性分子，有望作為預測動脈粥樣硬化發生的一種獨立危險因素。

關鍵詞動脈粥樣硬化；糖皮質激素誘導的腫瘤壞死因子受體配體；炎性反應

當前，冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(簡稱冠心病)已成為威脅人類健康的主要“殺手”。冠心病患者如果動脈壁上的斑塊形成潰瘍或破裂，則會形成血栓，重者使整個血管血流完全中斷，而發生急性心肌梗死，甚至猝死[1]。

糖皮質激素誘導的腫瘤壞死因子受體配體(glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor ligand，GITRL)是屬于腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)家族的Ⅱ型跨膜蛋白，其胞外區與其他TNF家族成員有20%的同源性。GITRL主要是組成性地高表達于血管內皮細胞或一過性在抗原提呈細胞(如樹突狀細胞、B細胞、巨噬細胞)和一些腫瘤細胞表面表達[2]。GITRL是糖皮質激素誘導的腫瘤壞死因子受體(glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor，GITR)的天然配體，能夠跨膜將膜外的信號轉導到膜內。直接刺激GITRL可以像刺激GITR一樣增強單核巨噬細胞的功能，誘導巨噬細胞聚集，以劑量依賴的方式上調細胞因子白細胞介素8(interleukin-8，IL-8)、單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein，MCP-1)、IL-1和TNF-α的表達。GITRL在細胞的免疫反應、炎性反應等一系列生理病理過程中發揮著重要的作用。當內皮細胞受到損傷后，GITRL/GITR作為T細胞活化的共刺激分子，通過激發胞內信號來調控T細胞，進而誘發一系列的炎性因子、趨化因子的產生[3]。

本研究通過高脂飲食建立大鼠動脈粥樣硬化模型，觀察頸總動脈的血管病變及管腔的炎性反應程度，檢測頸總動脈中GITRL的表達，探索GITRL可能的炎性反應機制。

1資料與方法

1.1實驗動物及分組雄性SD大鼠60只，體質量150～250 g，購自上海斯萊克實驗動物中心。將60只大鼠隨機分為正常飲食組和高脂飲食組，每組30只。

1.2動脈粥樣硬化模型建立正常飲食組以基礎飼料喂養，高脂飲食組以高脂飼料喂養。高脂飼料配方：4%膽固醇，10%豬油，0.2%甲基硫氧嘧啶，86%基礎飼料(購自上海斯萊克實驗動物中心)。喂養時間為6個月。

1.3標本采集用10%水合氯醛溶液麻醉(0.1 g/100 g)大鼠，取頸部正中切口，暴露氣管，用血管鉗鈍性分離頸總動脈、頸靜脈及迷走神經，游離出一段長約2 cm的頸總動脈，在近心端和遠心端分別結扎，剪斷血管。將部分標本浸泡于10%甲醛溶液，用于病理分析，其余新鮮標本于液氮冰凍后用于分子生物學檢測。

1.4病理組織學染色將標本用石蠟包埋后切片，片厚2 μm。漂片水溫50℃，烘片溫度90℃。將石蠟切片裝上片架，置于60℃烘箱干烤1 h至石蠟融化，趁熱依次置于二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、95%乙醇、90%乙醇、85%乙醇、80%乙醇、75%乙醇、70%乙醇、雙蒸水中，各5 min。將脫水后的石蠟切片置于pH 6.0的0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液槽中，水浴加熱至100℃，維持30 min。隨后進行HE、油紅“O”及彈力纖維(EVG)染色。

1.5病理診斷動脈粥樣硬化的標準動脈粥樣硬化大鼠動脈管壁增厚，平滑肌細胞增生，細胞排列紊亂，彈性纖維層結構不清，局部管壁向管腔突出，形成纖維增生性斑塊(由平滑肌細胞及脂類堆積形成)。部分斑塊表面出現纖維帽，纖維帽下由增生的平滑肌細胞、巨噬細胞及泡沫細胞組成[6]。

1.6GITRL表達的檢測

1.6.1蛋白質印跡(Western blotting)法取冰凍的頸總動脈組織，加入預冷并預混有蛋白酶抑制劑cocktail的放射免疫沉淀試驗(RIPA)裂解液100 μL，勻漿震蕩混勻，置冰浴裂解20 min，12 000 r/min 離心10 min后收集上清液，用BCA法測定蛋白樣品濃度。將蛋白樣品與等體積2×上樣緩沖液混勻，置于100 ℃水浴，煮沸5 min。配制120 g/L聚丙烯酰胺凝膠，按照每泳道蛋白總量相等的原則計算上樣量并上樣，80 V電壓下電泳20 min，待蛋白樣品條帶壓縮后以100 V電壓電泳90 min。300 mA恒流轉膜3 h。取出PVDF膜，用30 g/L牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)封閉1 h；以1∶200稀釋的鼠抗GITRL抗體(美國Biolegend公司)在室溫孵育3 h，TBST洗滌5 min，洗3次；以 1∶10 000 稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG孵育1 h，TBST洗滌5 min，洗3次；以 ECL-plus 為底物反應1 min后，用美國GE公司Typhoon分子成像系統掃描并記錄結果。

1.6.2免疫組織化學法將經過抗原熱修復的石蠟切片平鋪在濕盒內，滴加甲醇稀釋的3%過氧化氫溶液，室溫放置30 min，以滅活內源性過氧化物酶；用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗滌5 min，重復3次；滴加3% BSA，封閉非特異結合位點，室溫放置30 min；去除多余的BSA溶液，滴加以3% BSA溶液1∶200稀釋的GITRL抗體，4℃過夜，次日晨取出；倒去多余的抗體溶液，用PBS洗滌5 min，重復3次，滴加3% BSA溶液 1∶200 稀釋的生物素標記的羊抗兔IgG，37℃孵育1 h；PBS洗滌5 min，重復3次，滴加以PBS 1∶100稀釋的ABC溶液，37℃孵育1 h；用PBS洗滌5 min，重復3次，滴加3,3′-二氨基聯苯胺(3,3′-diaminobenzidine，DAB)顯色劑，室溫顯色，隨時觀察，適時終止顯色反應。

2結果

2.1大鼠動脈粥樣硬化模型的建立及驗證2組大鼠喂養前體質量差異無統計學意義；喂養6個月后，高脂飲食組體質量高于正常飲食組(P<0.01)。在喂養的過程中，正常飲食組死亡4只，出現頸總動脈粥樣硬化2只；高脂飲食組死亡6只，出現頸總動脈粥樣硬化22只。與正常飲食組相比，高脂飲食組大鼠動脈粥樣硬化發生率明顯升高(P<0.01)。見表1。

表1正常飲食組與高脂飲食組大鼠一般情況比較(n,%)

項目正常飲食組(n=30)高脂飲食組(n=30)喂養前體質量/g196.3±10.1189.9±9.5喂養后體質量/g213.1±4.9572.3±8.7*死亡4(13.3)6(20)動脈粥樣硬化2(7.7)22(91.7)*

注：與正常飲食組比較，*P<0.01

正常飲食組大鼠頸總動脈血管壁各層結構完整，內膜光滑，內襯單層內皮細胞，中膜由3～5層彈力膜和平滑肌細胞相間組成，細胞排列有序，外膜由結締組織組成，EVG染色顯示血管內壁彈性纖維完整、無中斷；高脂飲食組大鼠血管內壁彈性纖維不完整，連續性破壞、中斷；見圖1。正常飲食組大鼠可見頸總動脈內膜完整、排列整齊，中膜平滑肌細胞體積、排列正常，內膜及中膜均未見泡沫細胞及脂質沉堆積，高脂飲食組大鼠內膜內皮細胞腫脹、變性，部分缺失，內膜明顯增厚，含大量的泡沫細胞，中膜平滑肌細胞增生，內膜及中膜均可見泡沫細胞及脂質堆積。見圖2。高脂飲食組大鼠血管壁脂質物質明顯增多，見圖3。

A：正常飲食組；B：高脂飲食組

A：正常飲食組；B：高脂飲食組

A：正常飲食組；B：高脂飲食組

2.2血管組織中GITRL的表達情況免疫組織化學結果顯示，高脂飲食組頸總動脈血管組織表達的GITRL量明顯增加，見圖4。Western blotting結果也顯示，高脂飲食組大鼠頸總動脈中GITRL蛋白表達水平較正常飲食組增加，差異有統計學意義，見圖5。

A：正常飲食組；B：高脂飲食組

圖5　Western blotting法檢測正常飲食組和高脂飲食組

3討論

動脈粥樣硬化是全身性疾病，頸總動脈與冠狀動脈粥樣硬化之間有一定相關性，故頸總動脈粥樣硬化可作為預測冠心病的獨立因素[4-5]。動脈粥樣硬化多發生在大、中動脈的血管壁，是由多種慢性炎性刺激引起的一系列病理改變，與低密度脂蛋白膽固醇水平增高、脂質堆積、內皮功能障礙、細胞聚集、局部血管平滑肌細胞遷移性增殖等因素密切相關[6]。血管內皮細胞具有控制凝血和纖溶、調節血管張力和血管生長的功能。血管損傷后，內皮細胞黏附、遷移并產生多種細胞炎性因子、趨化因子、細胞黏附分子和蛋白水解酶，引起白細胞黏附、血小板激活和血栓形成，并引起血管平滑肌細胞的增生、遷移和凋亡以及細胞外基質的增生和重構。內皮細胞不僅分泌縮血管物質(如內皮素1和血管緊張素Ⅱ)，還能分泌舒血管物質(如NO)。動脈粥樣硬化即內皮細胞功能受損致使內皮素/NO平衡失調并由此導致血管收縮和平滑肌細胞增生的一種病理狀態。

雖然，目前GITR/GITRL的作用機制還不明確，但許多動物模型的研究已經證實，體內GITR與其配體GITRL結合能夠促進免疫系統過度活化，從而誘發或增加一系列炎性因子的表達。

本研究結果發現，動脈粥樣硬化組大鼠頸總動脈組織中GITRL的表達水平較正常飲食組大鼠明顯升高，提示GITRL可以作為診斷動脈粥樣硬化的相對特異的生物標志物及血管炎性反應的預測指標。今后可通過進一步研究血漿中GITRL與其他相關因素的關系以及在冠心病人群中開展研究確定GITRL在冠心病診斷治療中的價值。

參考文獻

[1]Acar RD, Bulut M, Ergün S, et al. Does cardiac rehabilitation improve left ventricular diastolic function of patients with acute myocardial infarction？[J]. Turk Kardiyol Dern Ars, 2014,42(8):710-716.

[2]Liu Y, Tang X, Tian J, et al. Th17/Treg cells imbalance and GITRL profile in patients with Hashimoto′s thyroiditis [J]. Int J Mol Sci, 2014,15(12):21674-21686.

[3]Carrier Y, Whitters MJ, Miyashiro JS, et al. Enhanced GITR/GITRL interactions augment IL-27 expression and induce IL-10-producing Tr-1 like cells [J]. Eur J Immunol, 2012,42(6):1393-1404.

[4]Lloyd-Jones DM, Walsh JA, Prineas RJ, et al. Association of electrocardiographic abnormalities with coronary artery calcium and carotid artery intima-media thickness in individuals without clinical coronary heart disease (from the Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis (MESA)) [J]. The American Journal of Cardiology, 2009,104(8):1086-1091.

[5]Zhang Y, Guallar E, Qiao Y, et al. Is carotid intima-media thickness as predictive as other noninvasive techniques for the detection of coronary artery disease?[J]. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology,2014,34(7):1341-1345.

[6]Gratchev A, Ovsiy I, Manousaridis I, et al. Novel monocyte biomarkers of atherogenic conditions [J]. Current pharmaceutical design, 2013,19(33):5859-5864.

基本項目：國家自然科學基金(編號：31400131；81401677)

Expression and Significance of Glucocorticoid-Induced Tumor Necrosis Factor Receptor Ligand in Carotid Artery of Rats with Atherosclerosis

WANGQiangGUHuiminWANGKaiwen*DepartmentofCardiovascularMedicine,*TheCentralLaboratory,TheFirstPeople′sHospitalofKunshan,Kunshan215300,China

AbstractObjective： To explore the change in the expression of glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor ligand(GITRL) in atherosclerotic process and its significance, by detecting the expression of GITRL in carotid artery of rats with atherosclerosis.Methods： Rat model of atherosclerosis was established and the atherosclerotic lesions were observed. The expression of GITRL in carotid artery was analyzed by immunohistochemical method and Western blotting. Results： The lipid deposition increased significantly in carotid artery of rats with atherosclerosis. The elastic fibers were incomplete and discontinuous. The endovascular expression level of GITRL was significantly higher in the carotid artery of atherosclerosis rats than that in the carotid artery of non-atherosclerosis rats.Conclusions： As a vascular inflammatory molecule, produced after high-fat diet, GITRL may become an independent risk factor for predicting the occurrence of atherosclerosis.

Key WordsAtherosclerosis；Glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor ligand；Inflammatory reaction

中圖分類號R

文獻標識碼A