黑脈羊肚菌多酚分級制備及其抗氧化活性

廖 霞，李葦舟，鄭少杰，盧可可，石 芳，吳素蕊，明 建,3,*

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650223；3.重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶 400715）

黑脈羊肚菌多酚分級制備及其抗氧化活性

廖 霞1，李葦舟1，鄭少杰1，盧可可1，石 芳1，吳素蕊2，明 建1,3,*

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650223；3.重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶 400715）

以黑脈羊肚菌為原料，采用不同極性溶劑提取多酚，分別得到乙酸乙酯相、甲醇相和水相多酚提取物，通過高效液相色譜分析其組分，測定其對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力、2,2’-聯氨-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS）自由基清除能力和抗氧化能力指數（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）值，并探討該多酚提取物含量與抗氧化相關性。結果表明，黑脈羊肚菌總酚含量為20.109 mg/g，其中水相組分多酚含量最高（14.478 mg /g），甲醇相次之（5.443 mg/g），乙酸乙酯相組分多酚含量最低（0.188 mg/g）。3 種溶劑的多酚提取物組成中，葒草素含量均為最高。水相組分清除DPPH自由基能力最強，甲醇相組分清除ABTS+·能力最強，乙酸乙酯相組分具有較高的ORAC值。多酚含量與DPPH自由基清除率、ORAC值具有顯著相關性（p＜0.05）。

黑脈羊肚菌；極性溶劑；抗氧化能力；高效液相色譜

羊肚菌是一種珍貴的食藥用真菌[1]，屬盤菌綱盤菌目羊肚菌屬，因其子實體極似羊肚而得名[2]。黑脈羊肚菌（Morchella angusticeps Peck）是其中常見的品種之一，春末夏初生于針葉林地，在我國主要分布于云南、西藏、甘肅等12 個地區[3-4]。黑脈羊肚菌中富含多糖[5]、蛋白質[6]、粗纖維[7]、多種常量和微量元素[8]，是一種集營養、保健、藥用功能于一體的優質資源，具有抗氧化、抗細胞增殖、增強免疫和誘導細胞凋亡等生物功能活性[9-11]。很多研究普遍認為活性多糖是羊肚菌中主要的活性物質，但也有研究發現黑脈羊肚菌體內富含多酚類物質，具有一定的抗氧化作用[12]。

由于多糖功能活性為人們熟知，因此對羊肚菌胞外多糖活性研究較多[13-15]，對羊肚菌多酚的研究比較少，對黑脈羊肚菌的研究更少。用不同極性有機溶劑萃取植物多酚的研究不少[16-17]，但關于萃取黑脈羊肚菌多酚的研究鮮見報道。孫瓊[18]采用不同極性溶劑萃取杏鮑菇黃酮類化合物，其中氯仿相總黃酮含量最高，乙酸乙酯相次之，水飽和正丁醇相和石油醚相最少，且不同極性部位均有一定的抗氧化作用。本研究采用不同極性溶劑萃取黑脈羊肚菌多酚類物質，比較各萃取組分的多酚含量和抗氧化活性，分析其多酚組分，為黑脈羊肚菌綜合利用和產品開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（分析純）、2,2’-聯氨-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS）、抗壞血酸、熒光素鈉鹽（fluorescein disodium salt，FL）、6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸（6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，Trolox） 美國Sigma公司；2,2’-偶氮二異丁基脒鹽酸鹽（2,2’-azobis(2-methylpropionamidine) dihydrochloride，ABAP）日本Wako Chemicals公司；蘆丁 成都科龍化工試劑廠；乙腈（色譜級） 德國Merck公司；其他化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

XHF-D均質機 寧波新芝生物科技有限公司；JYL-A110粉碎機 上海恒平科學儀器有限公司；HH-6數顯恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司；1-15PK離心機 美國Sigma公司；UV-2450紫外-可見分光光度計、SPD-M20A高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography，HPLC） 日本島津公司；DHG-9140A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海齊欣科學儀器有限公司；85-2數顯恒溫磁力攪拌器 金壇市易晨儀器制造有限公司；5810臺式高速離心機 德國Eppendorf公司；RE-5296旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠；LGJ-10真空冷凍干燥 北京松原華興科技發展有限公司；KQ-100超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；722分光光度計 上海精科科學儀器廠；PB-10 pH計 德國賽多利斯公司；SpectraMax M2多功能酶標儀 美國Molecular公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預處理

黑脈羊肚菌產自云南，由中華全國供銷總社昆明食用菌研究所提供。采摘后12 h內速凍，于-20 ℃下凍藏，實驗前取出冷凍羊肚菌于50 ℃烘箱烘干至恒質量，用中藥粉碎機粉碎，過60 目篩后密封備用。

1.3.2 多酚提取

參考Chideh等[19]的方法，根據實驗室條件稍作修改，準確稱取25 g黑脈羊肚菌粉末，加入500 mL石油醚，磁力攪拌24 h，于3 500 r/min離心10 min，棄去上清液，殘渣重復操作兩次，棄去上清液。向離心后的殘渣中加入乙酸乙酯于室溫處理3 次（每次500 mL，24 h），3 500 r/min離心10 min，合并收集上清液，抽濾后于45 ℃旋轉蒸干，定容至10 mL，為乙酸乙酯相提取物。離心后的殘渣用甲醇處理3 次，合并收集上清液，抽濾后于45 ℃旋轉蒸干，定容至25 mL，為甲醇相提取物。離心后的殘渣用水處理1 次，收集上清液，抽濾后于45 ℃旋轉蒸干，定容至25 mL，為水相提取物。

1.3.3 多酚含量測定

標準曲線的制作：參考Chu Yifang等[20]方法，稱取25 mg沒食子酸，加入適量去離子水充分溶解，定容至25 mL，得到1 mg/mL沒食子酸溶液。用去離子水配制成質量濃度分別為0、20、40、60、80、100、150、200、250、300 μg/mL的沒食子酸標準液。取200 μL標準液加入試管中，再依次加入800 μL去離子水、200 μL福林-酚試劑，振搖試管使樣品充分混合，避光保存6 min，再加入2 mL 7% Na2CO3溶液和1.6 mL去離子水，避光條件下放置90 min后于760 nm波長處測定吸光度。以多酚質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為：y＝0.003 8x+0.054（R2＝0.991 5）。

多酚含量測定：采用福林-酚法，取3 種溶劑提取獲得的多酚提取液（可作適當稀釋，200 μL），并用去離子水補至1 mL，后續操作同標準曲線的制備。結果以每克黑脈羊肚菌樣品中所含的沒食子酸當量表示，以干質量計。

1.3.4 HPLC鑒定羊肚菌多酚組分

參照Palacios等[21]的方法做適當修改，將3 種溶劑提取獲得的多酚提取液和多酚標準品經0.45 μm有機濾膜過濾后使用HPLC檢測。

色譜條件：色譜柱為B D S C18反相柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A為0.1%冰乙酸；流動相B為100%乙腈，梯度洗脫程序為：0～2 min 0% B；2～5 min 5% B；5～23 min 40% B；23～28 min 80% B；28～32 min 5% B；進樣量：10 μL；柱溫：25 ℃；流速：0.7 mL/min；檢測波長254 nm。

1.3.5 黑脈羊肚菌多酚抗氧化活性測定

1.3.5.1 DPPH自由基清除率測定

參考Gangopadhyay等[22]方法并稍作修改。分別吸取100 μL的0、2.5、5、10、20、40 μg/mL不同溶劑提取的多酚提取液和100 μL 120 μmol/L DPPH溶液，一式3 份點樣到96孔酶標板，37 ℃溫育30 min，在515 nm波長處測定吸光度Ai。以水作空白對照，測定空白對照樣吸光度Aj，抗壞血酸作為陽性對照。按公式（1）計算樣品DPPH自由基清除率。

1.3.5.2 ABTS+·清除率測定

參考Soong等[23]方法測定，將5 mL 7 mmol/L ABTS溶液和88 μL 140 mmol/L過硫酸鉀溶液混合，在室溫、避光條件下靜置過夜（12～16 h），形成ABTS儲備液。將生成的ABTS儲備液用10 mmol/L pH 7.4的磷酸鹽緩沖液稀釋，使其在室溫條件下于734 nm波長處吸光度為0.70±0.02，得到ABTS工作液。將3 種溶劑提取獲得的多酚提取液做相應稀釋后，取3 mL的0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μg/mL不同溶劑提取的多酚提取液和1 mL ABTS工作液于10 mL試管中，以抗壞血酸為陽性對照，混合均勻后30 ℃水浴反應6 min，然后于734 nm波長處測定吸光度Ai，以水作空白對照，測定空白對照樣吸光度Aj。按公式（2）計算樣品ABTS+·清除率。

1.3.5.3 ORAC值測定

參照文獻[24-25]的方法，并根據本實驗室條件稍作修改，即分別精確吸取20 μL磷酸緩沖液（空白液）、Trolox標準液（6.25 μmol/L）和0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μg/mL的不同溶劑提取的多酚提取液，一式3份點樣到96 孔黑色底部透明的酶標板。在37 ℃溫育10 min，加入200 μL 0.96 μmol/L熒光工作液，再在37 ℃溫育20 min并間歇搖動，迅速加入新鮮配制的119 mmol/L ABAP工作液20 μL，于激發波長485 nm、入射波長520 nm條件下立即讀數，每4.5 min進行一次讀數，檢測2.5 h，共讀數35 次。根據測定值計算抗氧化能力指數（oxygen radical absorbance capacity，ORAC），按公式（3）計算熒光衰減曲線下的面積（AUC），帶入Trolox標準曲線，計算出1 μg/mL樣品的ORAC值，結果以μmol TE/L表示。

式中：f1為第一次熒光讀數值；fi為第i次熒光讀數值；CT為間隔測定時間。

1.3.6 數據統計分析

數據采用Origin 8.0和Excel 2007軟件統計分析，實驗重復3 次，結果用 ±s表示，并用SPSS軟件進行統計處理，采用ANOVA進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 黑脈羊肚菌不同溶劑提取物中多酚含量

表1 黑脈羊肚菌不同溶劑提取物中多酚含量Table 1 Polyphenol contents of various extracts from Morchella angusticeps Peck

由表1可知，黑脈羊肚菌不同溶劑提取物中多酚含量具有顯著性差異，乙酸乙酯相和甲醇相含量分別為0.188、5.443 mg/g，水相組分含量為14.478 mg/g，總酚含量為20.109 mg/g，比香菇和猴頭菇[26]中總酚含量高。其中水相提取物多酚含量最高，占總酚含量72%，乙酸乙酯相含量最低，與Anacristina等[27]報道的8 種歐洲食用菌中水相提取物比甲醇相提取物多酚含量高的趨勢一致。

2.2 黑脈羊肚菌不同溶劑多酚提取物中多酚組分分析

通過HPLC法進一步研究黑脈羊肚菌多酚組成和含量。圖1為6 種標準品的HPLC圖，各種多酚標準品在色譜柱上的保留時間差異明顯。通過計算標準品峰面積與含量之間的關系，得到多酚標準品的回歸方程見表2。由表2可知，甲醇相中含有沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸、對羥基苯甲酸、咖啡酸、葒草素6 種多酚類成分，水相中含有沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、葒草素5 種多酚類成分，乙酸乙酯相中含有沒食子酸、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、葒草素這4 種多酚類成分。除葒草素外，有關菌類文獻報道過含有其他5 種多酚類成分[28-29]。3 種溶劑提取的多酚中，葒草素含量均為最高，甲醇相、水相、乙酸乙酯相中分別為339.56、3 625.05、20.97 μg/g。甲醇相和乙酸乙酯中含量最低的是對羥基苯甲酸，分別為67.81、2.09 μg/g，水相中最低的是原兒茶酸230.55 μg/g。

圖1 多酚標準品HPLC色譜圖Fig. 1 HPLC chromatogram for a standard mixture of polyphenols

表2 黑脈羊肚菌多酚組分和含量Table 2 Polyphenol composition of various extracts from Morchella angusticeps Peck

2.3 黑脈羊肚菌不同溶劑多酚提取物清除DPPH自由基能力

圖2 黑脈羊肚菌多酚提取物對DPPH自由基的清除率Fig. 2 DPPH radical scavenging capacity (IC50) of polyphenols in various extracts from Morchella angusticeps Peck

DPPH自由基在有機溶劑中穩定并在517 nm波長處有強吸收，抗氧化物質能與其孤對電子配對，使光吸收減弱，從而測得清除效果[30]。在一定濃度范圍內，黑脈羊肚菌多酚提取物清除DPPH自由基能力隨多酚含量增加而增強。由圖2可知，乙酸乙酯相、甲醇相和水相的半數抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值分別為13.070、12.363、11.754 μg/mL，與抗壞血酸相比，均較弱。其中水相多酚提取物清除DPPH自由基能力最強，與甲醇相多酚提取物相比無顯著性差異（P＞0.05），但顯著強于乙酸乙酯相多酚提取物（p＜0.05），這可能與不同溶劑提取的多酚組分不同有關。

2.4 黑脈羊肚菌不同溶劑多酚提取物清除ABTS+·能力

圖3 黑脈羊肚菌各多酚提取物ABTS＋·清除率Fig. 3 ABTS radical scavenging capacity (IC50) of polyphenols in various extracts from Morchella angusticeps Peck

ABTS經活性氧氧化后，可生成穩定的藍綠色陽離子ABTS+·，抗氧化物質可與ABTS+·發生反應而使反應體系退色，根據吸光度的變化可以測定抗氧化能力[31]。在一定濃度范圍內，隨著多酚含量增加，ABTS+·清除率增強。由圖3可知，乙酸乙酯相IC50值最大（0.466 μg/mL），顯著高于水相（0.440 μg/mL）（p＜0.05），甲醇相IC50值為0.308 μg/mL，顯著低于水相（p＜0.05），表明甲醇相組分具有較好的ABTS+·清除能力。3 種溶劑的多酚提取物對ABTS+·清除率均高于抗壞血酸。

2.5 黑脈羊肚菌不同溶劑多酚提取物ORAC值

圖 4 黑脈羊肚菌多酚提取物ORAC值Fig. 4 ORAC values of polyphenols in various extracts from Morchella angusticeps Peck

根據ABAP自由基破壞熒光探針，使熒光強度產生變化的原理，以Trolox為定量標準，熒光強度變化大小反映ABAP的破壞程度，當抗氧化劑存在時，它可延緩ABAP引起的熒光變化，其抑制程度反映了它對自由基的抗氧化能力[32]。ORAC值越大，抗氧化能力越強。由圖4可知，3 種溶劑多酚提取物中，乙酸乙酯相抗氧化能力最強，ORAC值為101.408 μmol TE/L，顯著高于甲醇相的81.483 μmol TE/L（p＜0.05），而水相的ORAC值最低，為41.345 μmol TE/L，不足乙酸乙酯相多酚ORAC值的一半，且顯著低于甲醇相（p＜0.05）。

2.6 黑脈羊肚菌3種多酚提取物含量與抗氧化能力相關性分析

表3 多酚提取物含量與抗氧化能力相關性Table 3 Correlation between polyphenol contents and antioxidant activity

黑脈羊肚菌多酚提取物含量與抗氧化能力相關性分析結果見表3。多酚含量與DPPH自由基清除率呈顯著負相關（p＜0.05），與ORAC值呈極顯著負相關（p＜0.01），而多酚含量與ABTS+·清除率相關性很差?？寡趸u價方法之間，除DPPH自由基清除率與ORAC值有顯著正相關性（p＜0.05），其余間均無顯著相關性。由于，不同抗氧化活性評價方法的作用機理不同，也會導致評估結果不同，采用不同的抗氧化活性評價方法，更能全面體現其生物學意義[33]。

3 結 論

黑脈羊肚菌總酚含量為20.109 mg/g，其中水相組分含量最高為14.478 mg/g，貢獻率占72%，乙酸乙酯相組分含量最低為0.188 mg/g，甲醇相含量為5.443 mg/g。采用HPLC分析3 種不同溶劑獲得的多酚提取物組分，初步鑒定甲醇相中含有6 種已知多酚類成分，水相中含有5 種，乙酸乙酯相中含有4 種，且葒草素含量均為最高，甲醇相、水相、乙酸乙酯相中分別為339.56、3 625.05、20.97 μg/g。體外抗氧化結果表明，水相多酚提取物清除DPPH自由基能力最強，甲醇相多酚提取物清除ABTS+·能力最強，而乙酸乙酯相ORAC值最高?？梢姡? 種不同溶劑提取的多酚抗氧化效果不相同，這與3 種溶劑多酚提取物的組分不同、粗提物中其他非酚類抗氧化化合物的存在及各化學抗氧化方法原理不同有密切關系。

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Fractionation and Antioxidant Activity of Polyphenols from Morchella angusticeps Peck

LIAO Xia1, LI Weizhou1, ZHENG Shaojie1, LU Keke1, SHI Fang1, WU Surui2, MING Jian1,3,*
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China;2. Kunming Edible Fungi Institute, All China Federation of Supply and Marketing Cooperatives, Kunming 650223, China;3. Chongqing Engineering Research Center for Special Foods, Chongqing 400715, China)

Phenolic components were sequentially extracted from Morchella angusticeps Peck using solvents with different polarities. As a result, ethyl acetate extract, methanol extract and water extract were obtained, and the phenolic components were identified by high performance liquid chromatography. Then, the 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging capacity, 2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate) (ABTS) radical scavenging capacity and oxygen radical absorbance capacity (ORAC) of the extracts were determined, and the correlation between phenolic contents of the extracts and antioxidant activity was investigated. The results revealed that the total polyphenol content of M. angusticeps Peck was approximately 20.109 mg/g. The highest content of polyphenols (14.478 mg/g) was detected in the water extract, followed by the methanol extract (5.443 mg/g), and the ethyl acetate extract had the lowest content of polyphenols(0.188 mg/g). Orientin was the most abundant in all three extracts. The DPPH radical scavenging capacity of the water extract was the strongest, the methanol extract possessed the highest ABTS radical scavenging capacity, and ethyl acetate extract exhibited the highest ORAC value. An excellent correlation between ABTS radical scavenging activity or ORAC value and polyphenol contents was observed.

Morchella angusticeps Peck; polar solvents; antioxidant activity; high performance liquid chromatography

10.7506/spkx1002-6630-201723005

TS201.2

A

1002-6630（2017）23-0026-06

廖霞, 李葦舟, 鄭少杰, 等. 黑脈羊肚菌多酚分級制備及其抗氧化活性[J]. 食品科學, 2017, 38(23): 26-31.

10.7506/spkx1002-6630-201723005. http://www.spkx.net.cn

2017-02-20

國家自然科學基金面上項目（31471576）；中央高?；究蒲袠I務費專項資金項目（XDJK2016E113）；

云南省科技廳科技創新人才計劃項目（2008OC008）；

重慶市特色食品工程技術研究中心能力提升項目（cstc2014pt-gc8001）

廖霞（1992—），女，碩士研究生，研究方向為食品化學與營養學。E-mail：994671521@qq.com

*通信作者：明建（1972—），男，教授，博士，研究方向為食品化學與營養學。E-mail：mingjian1972@163.com

LIAO Xia, LEI Weizhou, ZHENG Shaojie, et al. Fractionation and antioxidant activity of polyphenols from Morchella angusticeps Peck[J]. Food Science, 2017, 38(23): 26-31. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201723005. http://www.spkx.net.cn