3 株益生菌體外降膽固醇能力及體內降血脂效果評價

韋云路，劉 義，王 瑤，孟祥飛，李平蘭*

（中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京食品營養與人類健康高精尖創新中心，教育部-北京市共建功能乳品重點實驗室，北京 100083）

3 株益生菌體外降膽固醇能力及體內降血脂效果評價

韋云路，劉 義，王 瑤，孟祥飛，李平蘭*

（中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京食品營養與人類健康高精尖創新中心，教育部-北京市共建功能乳品重點實驗室，北京 100083）

為探討動物雙歧桿菌LPL-RH、長雙歧桿菌TTF及植物乳桿菌LPL-1作為降血脂益生菌的潛力，測定3 株益生菌的體外膽固醇脫除率和膽鹽水解酶活力，同時以益生菌灌胃高脂飲食大鼠6 周后測定大鼠血脂含量變化。研究結果表明：菌株LPL-RH、TTF、LPL-1的體外膽固醇脫除率分別為23.8%、24.5%、20.9%，無顯著差異（P＞0.05）；且3 株菌均有膽鹽水解酶活性。菌株LPL-RH、TTF、LPL-1干預分別使高脂大鼠血清膽固醇含量分別降低17.3%、11.4%、10.1%；血清甘油三酯含量降低19.1%、16.8%、11.5%；血清低密度脂蛋白膽固醇含量降低24.0%、20.0%、10.0%；血清高密度脂蛋白膽固醇含量升高10.3%、5.2%和1.7%。綜合而言，3 株益生菌在體內對高脂飲食大鼠血脂有調節作用，均有開發為降血脂益生菌的潛力，其中動物雙歧桿菌LPL-RH的體內降脂能力最為突出。

益生菌；降膽固醇；降血脂

近年來，動脈粥樣硬化、冠心病、腦卒中等心腦血管疾病的發病人群數量不斷增加，已經成為嚴重威脅人類健康的一種常見疾病。據不完全統計，每年全球約有1 750萬 人死于心腦血管疾病，約占死亡總人數的33%[1]。動脈粥樣硬化是導致心腦血管疾病的重要原因，而高脂血癥是導致動脈粥樣硬化的重要危險因素之一。高脂血癥是指血液中的一種或幾種脂質水平異常。流行病學和臨床研究表明，血清膽固醇水平和心腦血管疾病的發生呈明顯正相關性，血清膽固醇水平每高出正常水平1 mmol，導致心血管疾病的風險便增加約35%[2]；同時，血清甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）水平增高或高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）水平降低也會增加心血管疾病發生的風險[3]。目前，臨床上常采用藥物治療和飲食干預的方法控制和降低血脂水平。但是藥物治療費用相對較高，且會存在不同程度的副作用[4]。飲食控制雖然能夠在一定程度上起到調節機體內脂質代謝的作用，但長期往往控制效果欠佳。相比之下，食用降血脂功能性食品可能是長期控制血脂更理想的方法。

益生菌通常被定義為當機體從膳食中攝入一定量后，能夠對宿主健康產生有益影響的一類具有活性的微生物[5]。目前，益生菌主要包括乳桿菌、鏈球菌和雙歧桿菌等，這些益生菌不僅在人體腸道內起著營養、激活免疫及抗感染、調節腸道菌群平衡等作用[6-8]，而且還具有抗過敏[9]、抗腫瘤[10]、治療炎癥性腸病[11]和改善酒精性脂肪肝[12]等多種益生功效。值得關注的是，研究表明一些益生菌如植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌和鼠李糖乳桿菌等及含益生菌的發酵制品有降膽固醇和調節血脂作用[13-16]。適量攝入這些益生菌可有效調節體內血脂水平，對預防心血管疾病的發生很有意義[17]。益生菌作為藥物輔助治療劑，還具有安全性高、副作用小等優點，頗具市場開發潛力。

鑒于目前降血脂益生菌的報道有限，開發更多的降血脂益生菌并評價其體內外活性，將為降血脂益生菌的開發與應用奠定重要基礎。本實驗室經過篩選，獲得了3 株有降血脂潛力的益生菌。本實驗通過測定3 株菌體外降膽固醇能力和膽鹽水解酶（bile salt hydrolase，BSH）活力，初步確定其降脂能力，進一步研究3 株菌對高脂飲食大鼠血脂的調節作用，為其作為降血脂益生菌的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌株、動物與試劑

動物雙歧桿菌（Bifidobacterium animalis）LPL-RH、長雙歧桿菌（B. longum）TTF、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）LPL-1，由本課題組凍干保存并提供。

SD大鼠，45 只，SPF級，雄性，5 周齡，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司（合格證號：SCXK（京）2016-0011），飼養于中國農業大學實驗動物平臺（合格證號：SYXK（京）2015-0028）。

鄰苯二甲醛、冰乙酸、濃硫酸、膽固醇、牛膽鹽、巰基乙酸鈉、氯化鈣、氯化鈉等 北京易秀博谷生物科技有限公司；膽固醇測定試劑盒、甘油三酯測定試劑盒、HDL-C測定試劑盒、LDL-C測定試劑盒 北京中生北控生物公司；基礎飼料、高脂飼料 北京華阜康生物有限公司。

1.2 儀器與設備

3K15高速臺式冷凍離心機 美國Sigma公司；AU480全自動生化分析儀 美國貝克曼公司；UV-1800紫外分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；恒溫培養箱 上海精宏實驗公司。

1.3 方法

1.3.1 體外降膽固醇能力測定

改良MRS培養基配制：在MRS培養基中添加L-半胱氨酸鹽酸鹽，使終質量濃度為0.04 g/100 mL。根據文獻[18]方法配制MRS高膽固醇培養基：在MRS培養基中添加膽鹽（終質量濃度為3 mg/mL）和膽固醇（終質量濃度為0.1 mg/mL）。將活化好的菌株，接種于MRS高膽固醇液體培養基，37 ℃厭氧培養16 h，菌液于9 000 r/min離心10 min，收集上清液，采用鄰苯二甲醛法測定膽固醇含量[19]，并根據公式（1）計算膽固醇脫除率。

式中：m1、m2分別為發酵前、后上清液中的膽固醇質量/μg。

1.3.2 菌株BSH活力測定

菌株BSH活力根據文獻[20]的方法測定。BSH篩選培養基配制：在MRS瓊脂平板的基礎上添加牛膽鹽（終質量濃度為2 g/L）、巰基乙酸鈉（終質量濃度為2 g/L）以及CaCl2（終質量濃度為0.37 g/L）。將滅菌的BSH篩選培養基傾入無菌的平板中，待培養基凝固后將無菌濾紙片均勻放在培養基上。吸取活化好的待測菌株菌液10 μL緩慢加在直徑約3～4 mm的濾紙片上，待菌液不再流動后，于37 ℃厭氧條件下培養72 h，觀察培養后濾紙片周圍是否有白色沉淀物產生，若出現白色沉淀則可初步驗證該菌含有BSH。

1.3.3 益生菌菌懸液的制備

取動物雙歧桿菌LPL-RH、長雙歧桿菌TTF和植物乳桿菌LPL-1凍干菌粉，用無菌生理鹽水重懸使菌體濃度約為109CFU/mL，每只大鼠灌胃1 mL重懸菌液。為保證灌胃益生菌活性，需每天灌胃前用生理鹽水制備灌胃菌液，現配現用。

1.3.4 實驗動物分組及處理

實驗用大鼠按照SPF級實驗動物的要求在屏障環境中進行飼喂和管理。飼養條件：動物房溫度為（22±2）℃，相對濕度為（50±10）%，嚴格按照12 h光照/黑暗循環，大鼠自由采食和進水。

大鼠適應性喂養1 周后，隨機分為5 組，每組9 只，飼喂不同飲食，分別為正常對照（ND）組：給予基礎飼料正常飲食；高脂（HFD）組：給予高脂飼料飲食；LPL-RH干預（HFD+RH）組：給予高脂飼料飲食+動物雙歧桿菌LPL-RH；TTF干預（HFD+TTF）組：給予高脂飼料飲食+長雙歧桿菌TTF；LPL-1干預（HFD+LPL-1）組：給予高脂飼料飲食+植物乳桿菌LPL-1（HFD+LPL-1）。干預組每天定時灌胃相應的益生菌懸液，連續灌胃6 周。

1.3.5 體質量增加量及攝食量的測定

實驗開始和結束時稱取各組大鼠體質量，計算大鼠體質量增加量；每2～3 d，記錄一次大鼠的攝食量，并按照公式（2）計算食物利用率。

1.3.6 大鼠血脂水平檢測

實驗結束前，大鼠禁食不禁水12 h后，眼眶采血約1.5 mL，分離血清，-80 ℃保存，用于相關指標檢測。參考膽固醇、甘油三酯、HDL-C、LDL-C測定試劑盒的說明書測定血清中膽固醇、甘油三酯、HDL-C、LDL-C含量。按公式（3）計算動脈硬化指數（atherogenic index，AI）。

式中：cTC為血清膽固醇濃度/（mmol/L）；cHDL-C為血清HDL-C濃度/（mmol/L）。

1.4 數據統計分析

數據結果以 ±s表示，采用SPSS 17.0統計軟件，對數據進行單因素方差分析，以p＜0.05表示組間具有顯著差異。

2 結果與分析

2.1 益生菌的體外膽固醇脫除率

體外降膽固醇實驗是初步判定菌株是否具有潛在降脂能力的重要標準。由圖1可知，在培養16 h后，動物雙歧桿菌LPL-RH、長雙歧桿菌TTF和植物乳桿菌LPL-1的體外膽固醇脫除率分別可達到（23.8±1.9）%、（24.5±1.9）%、（20.9±3.6）%，且統計學分析結果表明，菌株之間膽固醇脫除率無顯著性差異（P＞0.05）。

目前報道中，各菌株的體外膽固醇脫除率各異。劉麗莉等[21]報道了來源于發酵果蔬食品中的6 種乳酸菌的體外膽固醇脫除率，在18.5%～28%之間不等。林斌等[22]從自然發酵的酸乳中分離得到一株植物乳桿菌HLX37，在培養24 h后，其膽固醇脫除率可達（37.33±2.55）%。Dilmi-Bouras[23]報道的來源于酸奶的幾株嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌也具有降低培養基中總膽固醇的能力。相比之下，本研究所選取的3 株益生菌的體外降膽固醇能力處于一般水平。

圖1 菌株體外膽固醇脫除率Fig. 1 Cholesterol removal rates of the strains in vitro

2.2 益生菌的BSH活性

圖2 菌株BSH平板檢測結果Fig. 2 Determination of bile salt hydrolase activity

BSH能夠將結合態的膽鹽水解為非結合態的膽鹽，而非結合態的膽鹽在水中的溶解性較低，在酸性條件下能夠與培養基中的Ca2+結合形成沉淀。因此，若菌株具有BSH活性，就能夠在BSH篩選培養基中觀察到沉淀[24]。從圖2中結果可以觀察到動物雙歧桿菌LPL-RH、長雙歧桿菌TTF和植物乳桿菌LPL-1周圍都產生了白色沉淀，且菌落周圍可以看到明顯的顆粒狀沉淀，說明所選取的這3 株益生菌都具有BSH活性。

有報道稱，益生菌尤其是乳桿菌屬和雙歧桿菌屬作為生物治療劑，可以通過產生BSH來直接影響宿主膽鹽代謝，從而調節血清膽固醇水平[25]。菌株所產生的BSH能夠解離腸道中的膽汁鹽，導致氨基酸殘基的釋放和解偶聯的膽汁酸的形成。而解偶聯的膽汁酸的溶解性較低，能夠共沉淀膽固醇并與膳食纖維結合，隨糞便排出體外，從而降低體內膽固醇水平[26]。同時，能夠產生BSH的菌株具有存活和定植于腸道中的優勢。因此，BSH活性也可以作為體外評價菌株降脂能力的一個重要指標。本研究中，3 株益生菌都具有BSH活性，具有調節血脂水平的潛力。

2.3 益生菌對高脂飲食大鼠體質量及攝食量的影響

表1 各組大鼠體質量增加量、攝食量及食物利用率情況Table 1 Body weight gain, total food intake and eff i ciency of conversion of ingested food of rats in each group

由表1可知，與ND相比，HFD大鼠體質量顯著增加（p＜0.05）；與HFD組相比，HFD+RH組、HFD+TTF組大鼠的最終體質量都明顯降低（p＜0.05），且與ND組（P＞0.05）相當。各組的攝食量間沒有顯著性差異（P＞0.05），說明益生菌干預不會影響大鼠的攝食量；與ND組相比，HFD組的食物利用率顯著增加（p＜0.05），HFD+RH組、HFD+TTF組和HFD+LPL-1組的食物利用率較HFD組低，接近ND組（P＞0.05）。

2.4 益生菌對高脂飲食大鼠血脂的影響

2.4.1 益生菌對大鼠血清中膽固醇的影響

圖3 各組大鼠血清膽固醇水平Fig. 3 Serum total cholesterol levels of rats in each group

如圖3所示，高脂飲食誘導可以使血清膽固醇濃度顯著升高（p＜0.05），益生菌干預后，大鼠血清膽固醇濃度明顯下降（p＜0.05）。與HFD組相比，HFD+RH組、HFD+TTF組和HFD+LPL-1組的大鼠血清膽固醇濃度分別下降了17.3%、11.4%和10.1%，且均有顯著性差異（p＜0.05）。但是，HFD+RH組、HFD+TTF組和HFD+LPL-1組的大鼠血清膽固醇濃度仍然高于ND組。因此，3 種益生菌干預都能使高脂大鼠血清中膽固醇濃度降低，但無法降低至正常水平。

膽固醇為機體必需營養成分，不僅是細胞膜的組成部分，同時在體液免疫、神經傳導及物質代謝中起著重要的生理作用。但當外源性膽固醇攝入過多時，易在血管壁上沉積，形成斑塊使血管管腔狹窄，阻礙血液循環，心腦組織長期缺氧便可引發心腦血管疾病，因此，控制血清膽固醇含量在正常范圍具有重要的意義。本研究中，3 株菌均有降低膽固醇的效果，同時體外結果表明3 株菌具有一定的膽固醇脫除率和BSH活性。因此，推測其降膽固醇的作用主要來源于兩方面：一方面是益生菌能夠吸收或同化去除膽固醇[27]；另一方面，菌株通過產生BSH，將結合膽酸分解為游離膽酸，游離膽酸可與膽固醇結合形成復合物，沉淀下來，進而起到降低膽固醇含量的作用[28]。

2.4.2 益生菌對大鼠血清中甘油三酯的影響

圖 4 各組大鼠血清甘油三酯水平Fig. 4 Serum triglycerides levels of rats in each group

圖4 結果表明，高脂飲食誘導可使大鼠血清甘油三酯濃度升高。與ND組相比，HFD組大鼠血清中甘油三酯濃度升高了45.6%，差異顯著（p＜0.05）。與HFD組相比，HFD+RH組、HFD+TTF組和HFD+LPL-1組大鼠血清甘油三酯濃度分別下降19.1%、16.8%和11.5%，其中HFD+TTF組與HFD組相比，差異顯著（p＜0.05）。但是各干預組大鼠血清甘油三酯濃度顯著高于ND組（p＜0.05），因此，3 株益生菌都具有降低血清甘油三酯濃度的效果，但無法降低至正常水平。甘油三酯主要存在于乳糜微粒和極低密度脂蛋白中，后者居多[29]。

研究發現，極低密度脂蛋白及乳糜微粒對血管內皮細胞具有細胞毒性作用、能夠促進泡沫細胞的形成和誘發炎癥反應，使甘油三酯沉積在血管壁中，促進動脈粥樣硬化形成，進而引發心腦血管疾病。Al-Sheraji等[15]研究表明含有B. pseudocatenulatum G4和B. longum BB536的發酵乳能夠有效降低高脂飲食大鼠血清甘油三酯含量。一些研究表明，益生菌可以利用碳水化合物生成短鏈脂肪酸及其鹽類，如丙酸鹽、醋酸鹽等，起到抑制和降低脂肪酸合成的效果[30]。

2.4.3 益生菌對大鼠血清中LDL-C的影響

LDL被稱為是動脈硬化因子，其作用是將肝臟內合成的膽固醇運送到肝臟外圍細胞。LDL-C是臨床檢驗的指標，它代表了血清中LDL的水平。益生菌干預6 周后，各組大鼠血清中LDL-C濃度變化情況如圖5所示。與ND組相比，HFD組大鼠血清中LDL-C濃度顯著性升高（p＜0.05）。與HFD組相比，3 種益生菌干預使高血脂大鼠血清中LDL-C濃度降低，HFD+RH組、HFD+TTF組和HFD+LPL-1組大鼠血清LDL-C濃度分別下降24.0%、20.0%和10.0%，其中，HFD+RH組、HFD+TTF組與HFD組相比，差異顯著（p＜0.05）。

圖5 各組大鼠血清LDL-C水平Fig. 5 Serum LDL-C levels of rats in each group

LDL為血清中膽固醇的主要攜帶者，可通過不同方式發生氧化修飾，轉變為氧化低密度脂蛋白[31]。氧化低密度脂蛋白是誘導血管內皮細胞損傷及功能障礙的一個重要因素，可通過激活細胞特異受體、誘導相關基因和蛋白的表達，破壞內皮屏障作用和加重血管炎癥反應[32]，在動脈粥樣硬化的發生發展過程中起著重要的作用。Shrivastava等[33]研究發現，嗜酸乳桿菌可顯著降低血清中LDL-C含量；含有植物乳桿菌K12的發酵乳也能夠顯著降低高脂飲食小鼠的血清LDL-C含量[34]，這與本研究結果一致。因此，3 株益生菌對大鼠血清LDL-C的升高具有緩解作用。

2.4.4 益生菌對大鼠血清中HDL-C的影響

HDL可介導膽固醇的逆轉運，將血液中多余的膽固醇從周圍組織轉運至肝臟進行再循環，減少脂質在血管壁的沉積[35]。HDL還可調節內皮細胞NO的生成和活性，改善血管內皮功能[36]；通過抗氧化、抗炎、抗血栓、促纖溶以及清除毒性磷脂等作用，起到保護血管功能的作用[37]。研究表明，HDL對動脈壁具有直接保護作用，并能使動脈粥樣硬化病變消退，因此，HDL被稱為“抗動脈硬化因子”。HDL-C是臨床檢驗的指標，它代表了血清中HDL的水平[38]。

益生菌干預6 周后，各組大鼠血清中HDL-C濃度變化情況如圖6所示。與ND組相比，HFD組大鼠血清中HDL-C濃度顯著性降低（p＜0.05）。與HFD組相比，3 種益生菌干預使高脂大鼠血清中HDL-C濃度有不同程度的升高，HFD+RH組、HFD+TTF組和HFD+LPL-1組大鼠血清HDL-C含量分別升高10.3%、5.2%和1.7%，其中，HFD+RH組與HFD組相比，差異顯著（p＜0.05）。因此，動物雙歧桿菌LPL-RH能夠使高血脂大鼠血清HDL-C濃度有一定程度升高，保護血管功能。

圖6 各組大鼠血清HDL-C水平Fig. 6 Serum HDL-C levels of rats in each group

2.5 益生菌對高脂飲食大鼠AI的影響

圖7 益生菌對大鼠AI的影響Fig. 7 Effect of probiotics on AI of rats in each group

AI是國際醫學界制定的一個衡量動脈粥樣硬化程度的指標，AI數值越小動脈粥樣硬化的程度就越輕，引發心腦血管病的危險性就越低[39]。由圖7可知，高脂飲食可誘導AI升高，與ND組相比，HFD組大鼠AI顯著升高（p＜0.05），患心血管疾病的風險很高。與HFD組相比，HFD+RH組、HFD+TTF組和HFD+LPL-1組使大鼠AI分別降低了32.3%、19.4%和9.7%，其中HFD+RH組效果最明顯（p＜0.05）。張澤生等[16]采用4 種不同益生菌灌胃高脂飲食大鼠6 周后，發現益生菌干預能夠顯著降低大鼠AI，預防和減少動脈粥樣硬化的發生。與本研究結果相似，說明益生菌干預可降低機體動脈粥樣硬化的患病風險。

3 結 論

本研究選取的3 株益生菌，動物雙歧桿菌LPL-RH、長雙歧桿菌TTF和植物乳桿菌LPL-1的體外膽固醇脫除率分別為（23.8±1.9）%、（24.5±1.9）%、（20.9±3.6）%，都具有BSH活性。3 株菌在體內對高脂飲食大鼠血脂有調節作用，其中動物雙歧桿菌LPL-RH調節大鼠血清脂質水平的效果好，能夠使高脂大鼠血清膽固醇、甘油三酯和LDL-C分別降低17.3%、19.1%和24.0%，HDL-C升高10.3%。3 株益生菌均有作為功能性食品用益生菌，調節血脂和預防心血管疾病的潛力，值得進一步研究和開發。

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Cholesterol-Lowering Ability in Vitro and Hypolipidemic Effect in Vivo of Three Probiotic Strains

WEI Yunlu, LIU Yi, WANG Yao, MENG Xiangfei, LI Pinglan*
(Key Laboratory of Functional Dairy, Co-Constructed by Ministry of Education and Beijing Government, Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health, College of Food Science and Nutritional Engineering,China Agricultural University, Beijing 100083, China)

This study aimed to investigate the hypolipidemic potential of Bifidobacterium animalis LPL-RH, B. longum TTF and Lactobacillus plantarum LPL-1. The cholesterol-lowering ability and bile salt hydrolase activity were determined.Then, the effect of probiotic intervention on blood lipids in high-fat diet fed SD rats was examined. The results showed that the cholesterol removal rates of B. animalis LPL-RH, B. longum TTF and L. plantarum LPL-1 were 23.8%, 24.5% and 20.9%, respectively, with no signif i cant differences among them. All three probiotics had bile salt hydrolase activity. The assays in vivo showed that intervention with LPL-RH, TTF and LPL-1 decreased serum cholesterol by 17.3%, 11.4% and 10.1%, triglycerides by 19.1%, 16.8% and 11.5%, and low-density lipoprotein cholesterol by 24.0%, 20.0% and 10.0%, and increased high-density lipoprotein cholesterol by 10.3%, 5.2% and 1.7% in hyperlipidemia rats, respectively. In summary,the three strains have the potential to be developed as lipid-lowering probiotics, with B. animalis LPL-RH having the best lipid-lowering ability.

probiotics; cholesterol-lowering; hypolipidemic

10.7506/spkx1002-6630-201723021

TS201.3

A

1002-6630（2017）23-0129-06

韋云路, 劉義, 王瑤, 等. 3 株益生菌體外降膽固醇能力及體內降血脂效果評價[J]. 食品科學, 2017, 38(23): 129-134.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201723021. http://www.spkx.net.cn

WEI Yunlu, LIU Yi, WANG Yao, et al. Cholesterol-lowering ability in vitro and hypolipidemic effect in vivo of three probiotic strains[J]. Food Science, 2017, 38(23): 129-134. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201723021. http://www.spkx.net.cn

2017-04-14

國家自然科學基金面上項目（31271827；31671831）

韋云路（1991—），女，碩士研究生，研究方向為食品微生物。E-mail：495680187@qq.com

*通信作者：李平蘭（1964—），女，教授，博士，研究方向為食品微生物。E-mail：lipinglan@cau.edu.cn