基于轉錄組學技術探究新瓊四糖對過度疲勞性腸道損傷的保護作用

宋 佳，張 娜，李 晶，毛相朝，薛長湖，唐慶娟

（中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003）

基于轉錄組學技術探究新瓊四糖對過度疲勞性腸道損傷的保護作用

宋 佳，張 娜，李 晶，毛相朝，薛長湖，唐慶娟*

（中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003）

目的：運用轉錄組學探究新瓊四糖對過度疲勞性腸道損傷的保護作用。方法：雄性BALB/c小鼠被隨機分為正常組、力竭運動組、陽性對照低聚果糖組和新瓊四糖干預組，連續喂養16 d后，取小鼠結腸組織，應用RNA-seq技術對結腸組織RNA進行完全測序，并對測序結果進行分析。結果：過度疲勞引起小鼠結腸腫瘤標志物Zfp521和Zmynd8等鋅指蛋白表達量極顯著增加（p＜0.01）、抑癌因子Casz1、Zfp346等的表達顯著降低（p＜0.05），新瓊四糖可緩解過度疲勞造成的腸道損傷，下調腫瘤相關鋅指蛋白的表達，上調抑癌鋅指蛋白的表達。結論：新瓊四糖可保護腸道、緩解過度疲勞引發的腸道損傷、預防腫瘤的發生。

新瓊四糖；過度疲勞；鋅指蛋白；RNA-seq；低聚果糖

現代人生活工作壓力大，過度勞累且缺少充分休息已成為常態。過度疲勞損傷器官組織、降低機體免疫力[1]，尤其會破壞腸道微環境穩態、損傷腸道組織屏障、增加患病風險性。緩解過勞損傷，保障健康，已成為社會關注熱點。在眾多保健方法中，食療更健康、溫和，因此，功能食品研究便快速發展起來。

傳統的功能食品開發方法具有研究深入、目標明確的優勢，但是其所涉及的功能面窄、開發效率低下?；诠δ苄允称肪峭ㄟ^影響組織或細胞的基因轉錄、蛋白代謝水平等生理活動實現其保健功效的本質，研究者通過整體把握生物體內所發生的事件、事件間的相關性及其對所涉及生物過程的意義，便能發現活性物質的營養功效。轉錄組學分析技術是實現這一目的有效工具。通過研究活細胞在某一功能狀態下所含mRNA的類型和拷貝數[2]，研究者能從RNA水平上詮釋組織或細胞內的生物過程及其所執行的功能。轉錄組學分析技術早已應用于醫學、食品等研究領域，為探究食品功能的作用機理提供了有效指導，但極少用于發掘活性物質的新功能。

低聚糖是關注度極高的功能性成分，具有益生元功能，可改善腸道菌群帶來降血脂、降膽固醇、增強免疫力等多種功效[3]。新瓊寡糖（neoagarooligosaccharides），是海藻中提取的多糖——瓊膠，降解而來的低聚糖[4]，利于人體吸收。新瓊寡糖的功能性研究剛剛起步，被認為是一種有效的益生元[5]，有探索潛力。近年來，新瓊寡糖的制備工藝逐步得到提升，開發新瓊寡糖的新功能具有重要意義。

本研究以力竭運動小鼠構建過度疲勞模型，以公認的益生元——低聚果糖為陽性對照，采用轉錄組技術探究新瓊四糖對過度疲勞性腸道損傷的保護作用。鋅指蛋白是一類具有手指狀結構域的轉錄因子，參與細胞代謝、生長發育等多項功能，在腫瘤發生和機體免疫異常方面是有效的指示標志物[6]。過度疲勞引發體內多種腫瘤標志鋅指蛋白表達異常增加，本實驗研究新瓊四糖對腫瘤標志蛋白表達的影響，探究其保護機體、預防結腸腫瘤發生的功效，為功能食品研究提供新思路，并為新瓊四糖的開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

BALB/c小鼠（SPF級，雄性，4～6 周齡，體質量18～22 g） 北京維通利華實驗動物技術有限公司（許可證號：SCXK（京）2012-0001）。

低聚果糖（純度＞9 5%）、焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate，DEPC）處理水 北京索萊寶科技有限公司；RNAase-free DNase Ⅰ 日本寶生物有限公司；乙醇、異丙醇（均為化學純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Nanodrop 2000c超微量分光光度計 美國Agilent公司；Miseq測序平臺 美國Illumina公司；YLS-10B小鼠轉輪式疲勞儀 山東醫學科學院；薄層層析板 德國Merck公司；基質輔助激光解吸飛行時間（matrix-assisted laser desorption/ionization-time of fl ight，MALDI-TOF）質譜儀美國AB SCIEX公司；超導傅里葉變換核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）波譜儀 德國Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組及模型建立

雄性BALB/c小鼠適應性喂養1 周，按體質量隨機分為4 組，每組8 只，即正常組（N）、模型組（M，即力竭運動小鼠）、陽性對照低聚果糖組（FOS）、新瓊四糖組（NAT）。小鼠自由攝食，室內溫度保持21～24 ℃，相對濕度達到40%～55%，空氣流通，每日光照時間達12 h。正常組灌胃后自由活動，不做過度疲勞干預；模型組、低聚果糖組和新瓊四糖組，利用小鼠轉輪式疲勞儀給予力竭運動，轉速20 r/min，首日運動3 h，次日運動2 h，連續運動2 d，間歇5 d。按照相同的力竭運動計劃持續16 d（3 次運動）。低聚果糖組和新瓊四糖組在處理周期16 d內分別灌胃150 mg/（kg·d）的低聚果糖和新瓊四糖，模型組同正常組均灌胃等量生理鹽水。

1.3.2 瓊脂糖制備

瓊脂糖由本課題組自行制備[7]。首先提取到瓊膠酶的基因，將其與質粒pET-21（a+）構建重組表達載體，轉化大腸桿菌Escherichia coli BL21，實現瓊膠酶基因的重組原核表達，制備獲得重組瓊膠酶agWH50A。瓊膠酶和0.2%低熔點瓊脂糖混合，加入50 mmol/L KH2PO4-NaOH緩沖液（pH 7.0），于30 ℃孵育12～48 h。對不同時間點下的酶解液進行薄層色譜分析，結果表明，反應僅產生一種寡糖產物。再對酶解液進行4 ℃離心，去除多余瓊膠酶，取上清液凍干即得寡糖粉末。對純化的寡糖粉末以2,5-二羥基苯甲酸為輔助基質進行MALDI-TOF檢測，得其分子質量為653 D，與四糖分子質量相吻合（四糖630 D+Na+23 D，以及四糖630 D+K+39 D），證明是四糖。13C NMR分析顯示在化學位移δ 93、97處有顯著信號，結合文獻[8]推斷四糖的還原末端為半乳糖，上述兩處信號分別對應半乳糖游離異頭碳的α-、β-構象，由此表明所得寡糖為新瓊寡糖。

1.3.3 提取結腸組織RNA

取小鼠結腸組織（約0.1 g），加入1 mL Trizol試劑，進行勻漿處理，勻漿液轉入EP管并靜置5 min后，加入0.2 mL氯仿（純度≥99.0%）充分混勻，靜置10 min以沉淀蛋白。之后4 ℃、12 000 r/min離心15 min，轉移上清液至新EP管中，加入與上清液等體積的異丙醇溶液，充分混勻，室溫放置10 min以沉淀RNA。4 ℃、12 000 r/min離心10 min后棄上清液，沉淀加入1 mL 75%的預冷乙醇，用滅酶槍頭溫和吹打進行清洗。4 ℃、10 000 r/min離心5 min后吸棄上清液，沉淀于室溫條件下靜置晾干。根據沉淀產量添加適量DEPC處理水，充分溶解沉淀，即得到總RNA樣品。采用超微量分光光度計檢測RNA樣品含量，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA樣品純度。

1.3.4 RNA-seq測序技術

1.3.4.1 RNA純化、文庫構建及測序

RNA-seq測序參照文獻[9]的方法略有調整。采用Trizol試劑將組織中的全部RNA片段提出后，加入RNAase-free DNaseⅠ去除其中可能污染的基因組DNA。磁珠法提取mRNA并打碎成片段，經反轉錄酶和隨機引物合成雙鏈cDNA。依據Illumina工作手冊構建mRNA-seq文庫。測序在Illumina HiSeq2000平臺上進行，得到140 bp雙末端進行讀長。

1.3.4.2 基因拼接注釋

原始讀長中去除含有載體或測序引物、含有多個N和低質量的讀長。通過Trinity進行序列拼接。每個亞組分中最長的轉錄本，被稱之為unigene，用于功能注釋。4 組所有拼接得到的unigene，通過非冗余蛋白質數據庫（nonredundant protein database）、非冗余序列（nonredundant nucleotide sequences）和SwissProt，運用BLAST算法以E值10-5為限搜索，同時在真核生物的同源蛋白數據庫以E值10-3為限進行查找。Pfam蛋白家族聚類通過HMMER 3.0進行。每個基因模型的GO聚類和KEGG聚類分別通過BLAST2GOv2.5、KASS和KEGG自動注釋服務器完成。

1.3.4.3 基因表達分析

每個樣品中的單個基因無冗余讀長，通過和Trinity轉錄本進行比對，以RSEM為準則對匹配的讀長總量進行統計。經PRKM法篩選得到的匹配讀長，通過歸一化計算處理，得到全部基因豐度。讀長總量采用TMM法均一，組間差異表達分析采用DEGseq軟件進行分析。GO和KO豐度分析均基于已識別的差異表達基因。

2 結果與分析

2.1 RNA質量控制

采用1.3.3節方法提取各組小鼠結腸組織RNA，各組OD260nm與OD280nm比值均介于1.9～2.2之間。4 組RNA瓊脂糖凝膠電泳圖譜由圖1可知，28S亞基和18S亞基條帶清晰，且各組RIN值均大于8，表明RNA完整，可用作轉錄組學測序分析。測序文庫構建過程中，RNA均被打碎成（142.00±5.00）bp的片段（正常組（142.30±32.60）bp、模型組（1 4 5.6 0±3 2.7 0）b p、低聚果糖組（144.90±33.20）bp、新瓊四糖組（145.50±32.60）bp，均小于200 bp），可實現深度測序。采用DESeq2換算系數對原始讀取數量進行標準化制作MA圖（圖2），統計各組基因的表達情況。MA圖用來圖形化展示基因表達譜的數據，數據被轉換成M和A的值，M為log2（fold change），其中fold change指兩組表達量的比值變化，A為平均表達值。MA圖以M作為y軸，A作為x軸，圖中每個點代表一個基因。由圖2可知，模型組對正常組小鼠的每個基因平均標準化counts的變化值，模型組引起基因差異表達數量較大，1 053 個基因顯著變化。

圖1 各組小鼠結腸提取的RNA瓊膠糖凝膠電泳結果Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of total colon RNA from all mouse groups

圖2 模型組對正常組小鼠的基因MA圖Fig. 2 MA plot of M vs N

2.2 過度疲勞對腸道基因表達的影響

分析過度疲勞小鼠結腸組織的轉錄組學結果，研究基因表達情況。通過和基因文庫進行比對，模型組中18 804 個表達基因的名稱及功能得到確認。其中2 987 個基因顯著表達（p＜0.05），44.66%基因表達上調（fold change≥1.10，其中22.67%的基因fold change＞1.2），35.99%的基因表達下調（fold change≤0.90，其中5.79%基因fold change＜0.8）。在眾多基因中，有89 個基因確定為鋅指蛋白家族基因（p＜0.05，|1－fold change|≥0.05），為顯著表達中所含個體最多的一類蛋白（表2）。其中，有20 個鋅指蛋白功能集中在腫瘤相關方面（圖3c，p＜0.05），12 個鋅指蛋白促進腫瘤增殖或在腫瘤細胞中表達量增加[10-19,28-29]（圖3c，以下稱腫瘤正相關蛋白），6 個鋅指蛋白可抑制腫瘤增殖或在腫瘤細胞中表達下調[20-25]（圖3c），2 個鋅指蛋白可能與腫瘤有關，表達的改變尚不明確或因環境而變[26-27]。通過比較模型組和低聚糖（包括低聚果糖組和新瓊四糖組，后同）組結果發現，低聚糖引起的模型組中表達量改變的基因個體，和模型組對正常組基因引起表達改變的基因個體有重合（圖3a，p＜0.05，|1－fold change|≥0.05），進一步對比發現，模型組中上調的基因，在低聚糖組中會發生下調；模型組中下調的基因在低聚糖組中會發生上調（圖3b，p＜0.05，|1－fold change|≥0.05）。因而提出過度疲勞引發腫瘤相關的鋅指蛋白表達的改變，低聚糖通過影響此類蛋白的表達保護機體。在低聚果糖組中，25 種顯著變化的鋅指蛋白中有9 種，即Zfp521、Zfr、Zmynd8、Zbtb38、Zfp345、Zfp13、Zfp503、Zfp512、Zmat2均涉及腫瘤發生（圖3b）。鋅指蛋白Zfp521，在小鼠B細胞過表達會導致血癌的發生[10]，模型組中其表達上調1.2 倍（P＝0.004）。Kuroyanagi等[11]發現Zmynd8可促進斑馬魚前列腺腫瘤中的血管生成，Lin Xiao等[12]將腫瘤特異性內皮細胞體外培養，發現脫離腫瘤環境的細胞中仍存在Zfp503的過表達，認為Zfp503可作為哺乳動物癌癥的穩定信號，孟瑩瑩等[13]發現ZBTB38在卵巢漿液性囊腺癌等癌癥中有較高程度的擴增。上述2 種鋅指蛋白Zmynd8和Zfp503，模型組中其表達量均上調（P值分別為7.56×10-5和0.009），上調程度均為1.20 倍。

表2 模型組小鼠結腸中表達顯著的蛋白Table 2 Top ten proteins signif i cantly differentially expressed in colon tissues of model mice

圖3 各組結腸基因表達韋恩圖及熱圖Fig. 3 Venn map and heat map showing gene expression in colon tissues from different groups

新瓊四糖組中，11 種顯著變化的鋅指蛋白涉及腫瘤增殖、神經傳遞、T細胞免疫等多種功能，其中有5 種，即Zmynd12、Zfp521、Zmynd8、Zfr、Zbtb7c鋅指蛋白與腫瘤形成相關。模型組中，前3 種鋅指蛋白顯著過表達，上調程度分別為1.23、1.20 倍和1.20 倍。對于這些在模型組中表達顯著增加的腫瘤正相關鋅指蛋白，新瓊四糖和低聚果糖都表現出抑制或緩解增加的作用，提示它們可能具有抵抗腫瘤發生的功效，值得進一步研究。

2.3 轉錄組分析技術預測低聚糖功能特性的可行性分析

如圖3b所示，低聚果糖的加入抑制了腫瘤正相關鋅指蛋白的轉錄表達。鋅指蛋白Zfp345、Zfp13、Zfp503、Zfp521、Zmat2、Zbtb38、Zfr、Zmynd8表達量均顯著降低（p＜0.05），且相較于模型組，表達量下降不低于10%（圖4和圖3b）。Zfp521是編碼一種含有N端轉錄抑制基序的轉錄因子，在軟骨細胞中間接靶向Cyclin D1，推動細胞周期由G1期進入到S期。鋅指蛋白Zfr[17]，作為一種哺乳動物體內高保留的RNA-binding轉錄因子，也可作用于細胞周期蛋白Cyclin A、Cyclin D1促進細胞增殖、腫瘤生長。

圖 4 低聚果糖和新瓊四糖對腫瘤增殖相關的鋅指蛋白表達的影響Fig. 4 Effect of FOS and NAT on the expression of zinc fi nger proteins related to tumor proliferation

圖5 低聚果糖和新瓊四糖對抑癌因子及周期蛋白表達的調控作用Fig. 5 Effect of FOS and NAT on the expression of tumor suppressors and cyclin proteins

如圖5所示，模型組Cyclin A1、Cyclin A2、Cyclin D1表達顯著上調（fold change分別為1.25、1.22、1.33，p＜0.05，p＜0.01），在低聚果糖組其表達均與模型組相比極顯著降低（fold change分別為 0.84、0.82、0.86，p＜0.01）。該結果提示，低聚果糖可能通過影響鋅指蛋白，間接抑制細胞周期蛋白表達，延緩細胞進程，從而降低腫瘤發生風險。此外，低聚果糖對抑癌因子有促表達作用。Casz1和Zfp346是重要的抑癌鋅指蛋白轉錄因子。在成神經細胞瘤中，Casz1通過抑制腫瘤細胞生長和轉移，激活其分化成正常功能細胞，而減少細胞的數量，阻止其擴散[20]。模型組中Casz1的表達顯著降低（p＜0.05），顯著上調Casz1蛋白的表達（P＝4.99×10－3）。Zfp346，又稱為JAZ[21]，通過介導細胞周期阻滯和凋亡來抑制癌細胞增長。細胞周期蛋白是與真核細胞的細胞周期呈同步周期性濃度升降的蛋白質，包括S期周期蛋白Cyclin A，G1期周期蛋白Cyclin C、Cyclin D、Cyclin E和M期周期蛋白Cyclin B。Yang Mingli等[22]發現JAZ抑制了A型周期蛋白，但對E型周期蛋白和D型周期蛋白沒有顯著影響。Dallal等[10]則發現Zfp521敲除后D型周期蛋白表達減少，腫瘤癥狀減輕。低聚果糖降低了Zfp346、Cyclin A、Cyclin D（圖5）周期蛋白的表達，但對Cyclin E型周期蛋白（數據未顯示）沒有顯著影響。

2.4 新瓊四糖對鋅指蛋白基因表達的影響

圖6 低聚果糖和新瓊四糖對鋅指蛋白基因表達的影響Fig. 6 Effect of FOS and NAT on the expression of zinc fi nger proteins

由圖6可知，與低聚果糖組相似，鋅指蛋白基因Zfp521、Zmynd8、Zfr在新瓊四糖組中與模型組相比也呈現顯著下調趨勢（fold change分別為0.88、0.89、0.92，p＜0.05，p＜0.01）。Zmynd12為轉錄因子，在細胞異化生成腫瘤時過表達[16]，模型組基因表達量為正常組的1.23 倍（p＜0.01）。新瓊四糖組與模型組相比其表達顯著降低（fold change為0.93，p＜0.05 ）。除此之外，對于其他腫瘤正相關鋅指蛋白均有下調的影響趨勢（圖4），同時增加了抑癌因子的表達。抑癌因子Casz1和Zfp346的表達上調，細胞周期蛋白Cyclin D1表達明顯被抑制（fold change為0.91），對Cyclin A1、Cyclin A2也起到抑制效果（圖5）。

3 討 論

本實驗采用小鼠力竭運動模擬過度疲勞損傷，運用轉錄組學技術提取基因信息。通過對基因表達變化信息的分析，從獲得的眾多數據中，鎖定鋅指蛋白，發現多種結腸組織腫瘤標志物鋅指蛋白表達異常。鋅指蛋白作為轉錄因子，可以激活相關靶基因的表達，執行相應功能。模型組中促進腫瘤發生或腫瘤細胞中表達顯著增加的一類鋅指蛋白表達的一致性增加，提示組織內細胞增殖活動加強，腫瘤發生風險性增加。低聚果糖是功能豐富的低聚糖，已有文獻證明其有減肥、抗炎等眾多功效[3]，本實驗中，以低聚果糖作為樣本，進行轉錄組學功能預測分析方法的建立。轉錄組結果表明，低聚果糖通過抑制腫瘤增殖鋅指蛋白Zfp345、Zfp13、Zfp503、Zfp521、Zmat2、Zbtb38、Zfr、Zmynd8的表達，激活抑癌因子基因Casz1和Zfp346表達，調控細胞周期蛋白和細胞分化進程，而減少細胞數量，延緩腫瘤增殖趨向，展現了其對腫瘤的抵抗潛力。而此前有文獻證明其確有抗腫瘤、抗癌功效[30-32]。這提示轉錄組學方法可用于預測活性物質的功能，低聚果糖功能預測結果和文獻[30-32]成果相吻合便是很好的佐證。

新瓊四糖作為一種新型益生元，其功能尚未完全闡明，用轉錄組學分析技術對其進行功能性研究發現其對顯著增加的腫瘤正相關鋅指蛋白Zfp521、Zmynd8和Zfr等有明顯的抑制作用，并且同樣促進了抑癌因子Casz1、Zfp346表達量的增加，降低腫瘤發生風險性，起到有效預防保護作用。為確定此功效及作用機制，仍需要進一步的實驗研究。此外，新瓊四糖也引起炎癥等鋅指蛋白表達的改變，提示其可能具有抗炎功效。

綜上所述，本研究嘗試建立轉錄組技術輔助功能成分功效預測新方法，為功能食品研究提供了技術參考。采用此方法對新瓊四糖進行功能預測，發現其對過度疲勞引發的腸道損傷具有保護作用，預防腫瘤的發生，挖掘新瓊四糖的潛在價值，為未來的研究提供方向。

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Protective Effect of Neoagarotetraose against Over-Exhaustion-Induced Gut Injury in Mice Revealed by RNA-Seq

SONG Jia, ZHANG Na, LI Jing, MAO Xiangzhao, XUE Changhu, TANG Qingjuan*
(College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

Purpose: To explore the protective effect of neoagarotetraose against over-exhaustion-induced gut injury by RNA-seq analysis. Methods: Male BALB/c mice were randomly divided into normal control group,over-exhaustion model group (both the groups were gavaged with saline), over-exhaustion plus fructooligosaccharide (FOS)group (positive control), and over-exhaustion plus neoagarotetraose (NAT) group. After sixteen days of administration,colon tissues from the mice in each group were collected, and then RNA was extracted for RNA-seq analysis. Results:Over-exhaustion resulted in signif i cantly increased expression of zinc fi nger proteins Zfp521 and Zmynd8, associated with inflammation and tumor proliferation (P ＜ 0.01), and significantly reduced expression of tumor suppressors Casz1 and Zfp346 (P ＜ 0.05). NAT could relieve over-exhaustion-induced gut injury by downregulating the expression of zinc fi nger proteins related to tumor proliferation and upregulating the expression of tumor-suppressing zinc fi nger proteins. Conclusion:NAT can protect against over-exhaustion-induced gut injury in mice and prevent the occurrence of tumors.

neoagarotetraose; over-exhaustion; zinc fi nger protein; RNA-seq; fructooligosaccharide

10.7506/spkx1002-6630-201723022

TS201.4

A

1002-6630（2017）23-0135-06

宋佳, 張娜, 李晶, 等. 基于轉錄組學技術探究新瓊四糖對過度疲勞性腸道損傷的保護作用[J]. 食品科學, 2017, 38(23):135-140.

10.7506/spkx1002-6630-201723022. http://www.spkx.net.cn

SONG Jia, ZHANG Na, LI Jing, et al. Protective effect of neoagarotetraose against over-exhaustion-induced gut injury in mice revealed by RNA-seq[J]. Food Science, 2017, 38(23): 135-140. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201723022. http://www.spkx.net.cn

2016-10-03

國家自然科學基金面上項目（31271923）；國家自然科學基金聯合基金項目（U1406402）

宋佳（1992—），女，碩士研究生，研究方向為食品營養學。E-mail：nianhua_letter@163.com

*通信作者：唐慶娟（1971—），女，教授，博士，研究方向為食品營養學。E-mail：tangqingjuan@ouc.edu.cn