基于尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶1解毒通路探討枸杞汁對鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯代謝的干預作用

賀永健，黃少文，劉瑞菁，萬發達，楊 婕，劉 煥，柳春紅,*

（1.華南農業大學食品學院，廣東省食品質量安全重點實驗室，廣東 廣州 510642；2.青海大漠紅枸杞有限公司，青海 西寧 810000）

基于尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶1解毒通路探討枸杞汁對鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯代謝的干預作用

賀永健1，黃少文1，劉瑞菁1，萬發達2，楊 婕1，劉 煥1，柳春紅1,*

（1.華南農業大學食品學院，廣東省食品質量安全重點實驗室，廣東 廣州 510642；2.青海大漠紅枸杞有限公司，青海 西寧 810000）

目的：通過大鼠毒性干預實驗觀察枸杞汁對鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（di-(2-ethylhexyl) phthalate，DEHP）染毒大鼠肝臟中尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶1（uridine diphosphate glucuronosyltransferase 1，UGT1）活性及代謝解毒的影響，探討枸杞汁對DEHP代謝的干預效果。方法：60 只雄性大鼠隨機分為對照組、DEHP組和枸杞汁干預組，每組20 只，DEHP組和干預組在DEHP一次染毒（3 000 mg/kg mb）后連續7 d分別灌胃生理鹽水和枸杞汁，對照組則給予同等體積的芝麻油或生理鹽水，期間每天收集大鼠24 h尿液。在染毒1、3、5、7 d后各組分別隨機處死5 只。采用試劑盒檢測肝臟UGT1的活力，高效液相色譜法檢測血清中的鄰苯二甲酸單（2-乙基己基）酯（mono-(2-ethylhexyl) phthalate，MEHP）以及尿液MEHP和鄰苯二甲酸（phthalic acid，PA）含量。結果：枸杞汁干預組大鼠第5天UGT1活性顯著高于DEHP組和對照組（p＜0.05），且相對于DEHP組血清中MEHP含量減少而尿液中MEHP和PA含量增加。結論：枸杞汁可能通過提高UGT1活力促進了DEHP的代謝與排泄，發揮了解毒效應，將來可能作為一種預防或對抗鄰苯二甲酸酯類物質或其他有毒化學物潛在危害的保健藥材或功能食品用于人群的健康防護。

鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯；尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶1；枸杞汁；干預

鄰苯二甲酸酯類物質（phthalate esters，PAEs）又稱酞酸酯，是生產塑料制品時廣泛使用的一種化學添加劑，加入該類物質可增加塑料的可塑性和柔韌性，以此來增強塑料制品的強度。PAEs可通過呼吸道、消化道和皮膚等途徑進入人體[1]，目前，在人的尿液、乳汁、血液和精液等體液中都已檢測出PAEs[2-5]。鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（di-(2-ethylhexyl) phthalate，DEHP）是一種重要的PAEs化合物，由于其易從塑料制品中遷移出來，導致其在環境中濃度逐漸升高，污染日趨嚴重[6]。已有研究表明DEHP及其代謝產物鄰苯二甲酸單（2-乙基己基）酯（mono-(2-ethylhexyl) phthalate，MEHP）的毒性作用具體表現為生殖內分泌毒性、胚胎發育毒性、免疫毒性、神經毒性以及血液和生化方面的改變等[7-9]。同時，也有研究認為DEHP的毒性作用可能為在體內的代謝產物MEHP所致[10]。在機體中，一部分DEHP直接以原型被吸收，另一部分受胰腺酶和腸道內一些酶的作用，迅速由雙酯轉化為單酯，主要代謝產物是MEHP，還有諸如鄰苯二甲酸單（2-乙基-5-氫己基）酯、鄰苯二甲酸單（2-乙基-5氧已基）酯等產物[11]。其產物的排出途徑之一是在尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶（the uridine diphosphate glucuronosyltransferase，UGT）的催化下與葡萄糖醛酸結合，實現Ⅱ相生物轉化，增強其水溶性、降低其生物活性從尿液中代謝排出[12-13]。部分DEHP會在24 h內經由尿液、糞便或者汗液排出體外，而MEHP則會在人體組織中長期蓄積，生物蓄積時間可長達6 個月[11,14]。UGT廣泛存在于機體各種組織中，肝臟中UGT酶活力最高。其主要作用是與Ⅰ相反應后的功能基團發生葡萄糖醛酸結合反應使其水溶性增加而隨膽汁或尿液排出體外。根據克隆的cDNA序列的相似性，Burchell等[15]建議將UGT分為UGT1和UGT2兩個家族，分別參與外源化學物（如酚）和內源膽紅素代謝和類固醇代謝，UGT1和UGT2兩個家族又可分為許多亞族酶系統。廣東省食品質量安全重點實驗室前期PAEs暴露的尿液生物標志物研究表明：大鼠尿液中的所有PAEs代謝物的酸水解產物鄰苯二甲酸（phthalic acid，PA）與PAEs暴露量有良好的相關性，即以尿液水解后的PA作為PAEs暴露的生物標志物，可很好地反映PAEs的外暴露水平[16]。

傳統醫學認為，枸杞的一個重要作用是養肝護肝，且多認為其作用機制可能與其抗氧化有關。枸杞中含有枸杞多糖、多酚類、類胡蘿卜素、甾醇、各種蛋白質和游離氨基酸等成分，其藥理作用除了保護肝臟以外，還具有抗衰老、抗腫瘤、抗輻射及增強機體免疫力等作用[17-19]。正是由于大家對枸杞功效的認可，幾千年來枸杞一直被用作一種傳統的中藥和食品，廣泛用于煲湯、泡茶等[20]。

由于環境和食品包裝材料中的塑化劑普遍存在，導致人類無時無刻不在接觸PAEs，這也使得廣泛暴露而且對人體健康具有潛在威脅的PAEs得到特別的關注。本研究以大鼠為實驗對象，根據預防為主的衛生策略，從UGT1解毒通路探討枸杞汁對DEHP代謝的干預作用，以期為將來進一步挖掘枸杞的保健功能、開發解毒功能食品提供參考，同時也為揭示枸杞的養肝護肝機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠60 只，購自南方醫科大學動物實驗中心，實驗動物合格證號SCXK（粵）2013-0002，體質量180～210 g。

DEHP、MEHP、β-葡糖苷酸酶 美國Sigma公司；鄰苯二甲酸 德國Dr. Ehrenstorfer公司；枸杞汁 青海大漠紅枸杞有限公司；UGT1試劑盒 上海江萊生物科技有限公司；食品級芝麻油 海天味業。

1.2 儀器與設備

LC-20A高效液相色譜儀（配SPD-20A及RF-20A檢測器）日本島津公司；5810R臺式冷凍離心機 德國Eppendorf公司；EL204-IC電子天平 瑞士Mettler Toledo公司；FS 110超聲波清洗機 美國Thermo Fisher公司；大鼠代謝籠配不銹鋼支架 蘇州市標正有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗設計

60 只大鼠放置于動物房代謝籠中飼養，自由攝食和飲水，光/暗周期12 h/12 h（光照時間7:00～19:00），室內溫度為（22.0±0.5）℃，相對濕度為50%～60%。適應性飼養7 d后，按體質量采用隨機區組設計分組法分為3 組（每組20 只）：對照組、DEHP組和枸杞汁干預組。第1天上午9時，DEHP組和枸杞汁干預組以溶于芝麻油的DEHP溶液染毒，對照組則以等體積的芝麻油灌胃，1 h后枸杞汁干預組用枸杞汁灌胃，對照組和DEHP組則用等體積的生理鹽水灌胃。第2天開始，一直到第7天，每天上午9時，枸杞汁干預組繼續灌胃枸杞汁，對照組和DEHP組則灌胃等體積的生理鹽水。DEHP染毒劑量為3 000 mg/kg mb。所用枸杞汁為枸杞原汁，主要活性成分為枸杞多糖[20]，根據GB/T 18672—2014《枸杞》測得該枸杞汁中枸杞多糖質量濃度為10 mg/mL，結合Shan Xiaozhong等[21]研究中枸杞多糖的效應劑量和成年大鼠胃容量最大值，選擇灌胃劑量為8 mL/kg mb，即枸杞多糖灌胃劑量為80 mg/kg mb，此時枸杞多糖劑量接近顯著作用劑量，同時也避免了枸杞汁灌胃體積過大而造成損失。在灌胃1、3、5、7 d后的每個上午9時各組隨機處死5 只。

1.3.2 樣品采集

從首次灌胃開始，每天收集大鼠24 h尿液，測量體積并凍存于-80 ℃冰箱中。按實驗既定時間，對隔天處死的動物則采集血樣，離心后將血清-80 ℃凍存備測，同時在無菌操作臺迅速分離肝臟并-80 ℃冷凍保存。

1.3.3 樣品分析

1.3.3.1 肝微粒體UGT1活力測定

采用差速離心法制備大鼠肝微粒體。取適量肝臟剪碎，用0.05 mol/L pH 7.4 Tris-HCl緩沖液反復沖洗，按1∶4（m/V）加入0.05 mol/L pH 7.4 Tris-HCl緩沖液，用玻璃勻漿器制成肝勻漿。將制備好的肝勻漿在超速冷凍離心機上10 000×g離心20 min。取上清液100 000×g離心60 min，上清液為胞液，淡紅色沉淀即為肝微粒體[22]。以上所有操作均在冰浴上進行。其UGT1活力參照試劑盒說明書測定。

1.3.3.2 樣品中MEHP質量濃度測定

將凍存樣品取出解凍后13 000 r/min離心5 min。移取適量樣品（1 mL尿液或0.4 mL血清）上清液超聲處理5 min，然后加入250 μL醋酸銨溶液（1 mol/L，pH 6.5）和20 μL β-葡糖苷酸酶，搖勻、密封放入37 ℃的水浴中酶解90 min。酶解處理后的樣品中加入3 mL乙酸乙酯，渦旋振蕩器上充分振蕩5 min后，以4 000 r/min離心5 min。吸取上層乙酸乙酯相至10 mL離心管中，在氮吹儀上吹至近干。下層樣品中再加入3 mL乙酸乙酯，重復以上步驟3 次。用500 μL乙腈溶解，經0.22 μm有機系微孔濾膜過濾后轉移至液相進樣瓶中，用于高效液相色譜分析[23]。

1.3.3.3 樣品中PA質量濃度測定

將凍存樣品取出解凍后12 000 r/min離心20 min，取1 mL上清液，加入20 μL β-葡糖苷酸酶、250 μL 1 mol/L醋酸銨緩沖液，37 ℃恒溫振蕩90 min。再加250 μL濃度為5 mol/L的NaOH溶液，于（95±5）℃水浴回流加熱90 min，用體積分數50%鹽酸水溶液將水解液pH值調為1～2，漩渦振蕩3 min后，超聲波振蕩20 min。加入3 mL正己烷，漩渦振蕩3 min，4 000 r/min離心5 min，棄去正己烷層，加入3 mL乙酸乙酯，漩渦振蕩3 min，4 000 r/min離心5 min，取乙酸乙酯層，剩余液體中再加入3 mL乙酸乙酯，重復上述操作，將4 次萃取液合并，40 ℃氮氣吹至近干。用1 mL色譜級甲醇復溶，超聲5 min易于溶解，用0.22 μm有機濾膜過濾，用于高效液相色譜分析[16]。

1.3.3.4 MEHP和PA排泄率計算

分別根據式（1）、（2）計算MEHP和PA的排泄率。

式中：mDEHP為DEHP實際攝入量/g；MDEHP為DEHP的相對分子質量（390.56）；mMEHP為樣品中MEHP的質量/g；MMEHP為MEHP的相對分子質量（278.34）；mPA為樣品中PA的質量/g；MPA為PA的相對分子質量（166.13）。

1.4 數據統計分析

采用Excel軟件錄入數據，使用SPSS 18.0軟件進行統計學分析，實驗數據用 ±s表示，多組間比較采用單因素方差分析。進一步進行組間兩兩比較，若方差齊時，采用LSD檢驗；若方差不齊，采用Tamhane’s檢驗，差異顯著水平為p＜0.05，極顯著水平為p＜0.01。

2 結果與分析

2.1 染毒及干預條件下大鼠肝臟UGT1活力的動態變化

圖1 肝臟UGT1活力的變化趨勢Fig. 1 Variation in hepatic UGT1 activity during administration

大鼠肝臟UGT1活力的變化趨勢如圖1所示。對照組和DEHP組的UGT1活力變化趨勢相對平穩；枸杞汁干預組呈現上升后下降的趨勢，且在第5天的UGT1活力與對照組和DEHP組相比，差異都有顯著性意義（p＜0.05）。

2.2 染毒及干預條件下大鼠血清中MEHP檢出量的變化

表1 大鼠血清MEHP檢出量（n＝5）Table 1 MEHP concentration in serum of rats at different administration times (n= 5)

由表1可知，對照組大鼠血清在實驗期間未檢測到MEHP；DEHP組大鼠血清的MEHP檢出量隨時間延長而下降，直到染毒后第7天才沒有MEHP檢出；枸杞汁干預組大鼠血清僅在染毒后第1天有MEHP檢出，且檢出量低于DEHP組，染毒后第3天已無MEHP檢出。其中在第1天DEHP組血清的MEHP檢出量與對照組相比差異極顯著（p＜0.01）。

2.3 染毒及干預對大鼠尿液MEHP檢出量和排泄率的影響

表2 大鼠尿液中MEHP檢出量和排泄率Table 2 Urinary concentrations and excretion rates of MEHP in rats

由表2可知，對照組尿液在實驗期間未有MEHP檢出；DEHP組和枸杞汁干預組尿液MEHP的檢出量都隨時間延長而呈下降趨勢；在相同時間點枸杞汁干預組尿液MEHP的檢出量和排泄率都高于DEHP組。綜合表1、2，枸杞汁干預組大鼠相對于DEHP組，其MEHP在血清中持續的時間短，被代謝和排出的速率快。

2.4 染毒及干預對大鼠尿液中PA的檢出量和排泄率的影響

表3 大鼠尿液中PA的檢出量和排泄率Table 3 Urinary concentrations and excretion rates of PA in rats

由表3可知，對照組尿液在實驗期間未有PA檢出；DEHP組和枸杞汁干預組尿液PA的檢出量都隨時間延長而呈下降趨勢；在相同時間點枸杞汁干預組尿液PA的檢出量和排泄率基本都高于DEHP組。

3 討 論

葡萄糖醛酸結合反應是生物體內重要的Ⅱ相代謝途徑，主要是由UGT催化完成的。肝臟是UGT含量最豐富也是葡萄糖醛酸結合代謝最活躍的器官，大量的葡萄糖醛酸化反應在此發生[24]。本研究發現，DEHP染毒之后采用枸杞汁干預，其肝臟UGT1活力在第5天上升至最高，且與對照組和DEHP組相比都有顯著性差異（p＜0.05）；同時，枸杞汁干預組血清中MEHP檢出量相對于DEHP組都減少而尿液中MEHP檢出量都增加。相應的變化數據表明枸杞汁干預增加UGT1的活力，UGT1活力增加則促進了代謝產物MEHP的排泄，由此將減少有毒產物MEHP潴留對機體的影響。從UGT1變化趨勢來看，UGT1活力在第5天升高后的第7天并沒有持續上升，反而開始下降，這可能是因為本實驗DEHP是一次性染毒，UGT1是促進DEHP排泄的，隨著時間延長，動物體內的DEHP會逐漸排出。由于需要代謝排泄的DEHP減少，需要去與DEHP初級代謝物結合的UGT1也就會減少，所以UGT1不會一直升高。

大鼠尿液中PA是PAEs（本實驗為DEHP）所有尿液代謝產物的共同酸水解產物，反映DEHP的總體排出量[16]。在本研究中大鼠尿液中PA檢出量均隨時間延長而逐漸降低，但枸杞汁干預組相對于DEHP組檢出量更高，且排泄率也有不同程度增加，表明枸杞汁使DEHP的總代謝產物排出增加。大鼠血清MEHP檢出量在枸杞汁干預后的第1天就低于DEHP組，第3天未檢出，一方面可能是枸杞汁通過誘導UGT1來加速MEHP的排泄，另一方面可能也存在枸杞汁抑制DEHP吸收的作用，后者還有待于進一步探討研究。PAEs為一類人工合成的內分泌干擾物，有學者研究指出，枸杞對同為內分泌干擾物的雙酚A有緩解其所造成的生殖損傷毒性作用，是有效中藥成分之一[25]。本研究則從枸杞汁對Ⅱ相解毒酶UGT1的誘導方面來探討枸杞的解毒效應，從另一角度證實了枸杞對肝臟的保護作用及對外源有毒物質的干預效應。枸杞多糖是枸杞中主要的生物活性成分，具有廣泛的藥理作用，對機體的免疫功能和抗氧化能力有顯著的增強作用[26-27]，結合枸杞多糖對內分泌干擾物誘導的損傷起到的緩解作用[28]，推測枸杞多糖可能是枸杞汁發揮解毒效應的一個重要成分。

UGT是Ⅱ相代謝中最重要的酶，與常見的Ⅰ相CYP450酶相比，研究相對滯后。本實驗通過比較DEHP染毒后大鼠血清中MEHP檢出量、尿液中MEHP和PA檢出量與UGT1活力的實時變化，探討了UGT1在DEHP代謝中發揮的作用和相關機制。實驗結果顯示大鼠體內DEHP的代謝與UGT1有著密切聯系。Silva[13]和Koch[29]等研究報道，UGT在DEHP初級代謝物的Ⅱ相生物轉化階段中起到重要的催化作用，促進其進一步轉化為親水的葡糖苷酸結合物，其中的機制可能是UGT與DEHP代謝物結合而增強水溶性，同時減弱生物活性，并促進其排泄。從已有的文獻來看，DEHP對代謝酶的影響可能有兩條途徑，一方面，DEHP或其代謝物對Ⅰ相代謝酶有直接的誘導作用[30]，可能也對UGT1有同樣的直接誘導效應；另一方面，DEHP可通過孕烷X受體途徑引起Ⅰ相代謝酶活力增加[31]，其進入機體后也可能激活孕烷X受體通路再進一步調節UGT1的表達。此外，UGT是組成型雄烷受體的下游效應靶基因之一[32]，所以DEHP也可能通過誘導組成型雄烷受體而對UGT1的轉錄產生影響。

綜上所述，大鼠肝臟中UGT1對DEHP代謝物的排出具有促進作用，枸杞汁能夠顯著上調UGT1活力，降低血清中MEHP含量，加速DEHP的清除，進而可以對抗因DEHP潴留造成的毒性作用。本研究初步證實了枸杞汁對DEHP暴露具有明顯的干預效應，即枸杞將來可能作為一種預防或對抗PAEs或其他有毒化學物潛在危害的保健藥材或功能食品。

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Intervention Effect of Lycium barbarum Juice on the Metabolism of Di-(2-ethylhexyl) phthalate Based on the Uridine Diphosphate Glucuronosyltransferase 1 Detoxif i cation Pathway

HE Yongjian1, HUANG Shaowen1, LIU Ruijing1, WAN Fada2, YANG Jie1, LIU Huan1, LIU Chunhong1,*
(1. Key Laboratory of Food Quality and Safety in Guangdong Province, College of Food Science, South China Agricultural University,Guangzhou 510642, China; 2. Qinghai Red Magic Wolfberry Co. Ltd., Xining 810000, China)

Purpose: This study aimed to explore the intervention ef f ect of Lycium barbarum juice (LBJ) on the metabolism of di-(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) by analyzing the activity of uridine diphosphate glucuronosyltransferase 1 (UGT1)and metabolic detoxif i cation prof i le in the liver of rats exposed to DEHP. Methods: Sixty Sprague Dawley male rats were randomly divided into three groups (n = 20 each): control group, DEHP group and LBJ group. The DEHP and LBJ groups were administered with normal saline and LBJ respectively by gavage once daily for 7 consecutive days after receiving a single dose of 3 000 mg/kg mbDEHP dissolved in sesame oil. The control group was treated with normal saline for 7 days after receiving the same volume of sesame oil of. Urine samples were collected for 24 hours daily during the experimental period. Totally 5 rats were sacrif i ced randomly in each group after 1, 3, 5 and 7 days of exposure. The activity of UGT1 was determined by an enzyme linked immunosorbent assay kit while the contents of mono-(2-ethylhexyl) phthalate (MEHP) in serum and urine and phthalic acid (PA) in urine were detected by high performance liquid chromatography. Results: The activity of UGT1 in the LBJ group signif i cantly increased on the 5thday compared to the DEHP and control groups (P ＜ 0.05).The content of serum MEHP in the LBJ group decreased signif i cantly, whereas the contents of urine MEHP and PA increased compared to DEHP group. Conclusion: LBJ can promote the metabolism and excretion of DEHP through improving the activity of UGT1, making it a healthcare product or functional food against the potential hazard of phthalate esters (PAEs) or other poisonous chemicals.

di-(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP); uridine diphosphate glucuronosyltransferase 1(UGT1); Lycium barbarum juice (LBJ); intervention

2016-09-08

農業部農產品質量安全監管項目（GJFP201501202）；廣東省科技計劃項目（2013B020204001）

賀永健（1993—），男，碩士，研究方向為營養與食品安全。E-mail：heyongjian93@126.com

*通信作者：柳春紅（1968—），女，教授，博士，研究方向為營養與食品安全。E-mail：liuch@scau.edu.cn

10.7506/spkx1002-6630-201723031

R114；R151.41

A

1002-6630（2017）23-0196-05

賀永健, 黃少文, 劉瑞菁, 等. 基于尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶1解毒通路探討枸杞汁對鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯代謝的干預作用[J]. 食品科學, 2017, 38(23): 196-200.

10.7506/spkx1002-6630-201723031. http://www.spkx.net.cn

HE Yongjian, HUANG Shaowen, LIU Ruijing, et al. Intervention effect of Lycium barbarum juice on the metabolism of di-(2-ethylhexyl) phthalate based on the uridine diphosphate glucuronosyltransferase 1 detoxif i cation pathway[J]. Food Science, 2017, 38(23):196-200. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201723031. http://www.spkx.net.cn