人參水提取物對羥自由基的抑制作用

遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧 大連 1166001

人參水提取物對羥自由基的抑制作用

李紅艷倪雪嬌張旭陳宏偉

遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧 大連 1166001

目的比較人參不同水溶性提取物對羥自由基(·OH)的抑制作用。方法運用正交試驗設計，提取人參水溶性有效部位；采用水楊酸法測定·OH清除率；通過方差分析和樣本聚類分析優選·OH抑制劑提取工藝。結果共提取得到16個樣品，其中12號樣品·OH清除率最大，在1g/L濃度下，其抑制率可達105.08%。結論人參水提取物中含有羥自由基清除劑，其最佳提取工藝為：pH8，料液比1∶10，4℃提取3次，每次12h。

人參水提取物；正交試驗；羥自由基；抗氧化

人參(PanaxginsengC.A.Meyer.)是我國傳統中草藥，具有抗氧化、增強免疫、神經保護等多種藥理作用[1-2]?？偨Y文獻發現，人參多種作用都與其抗氧化活性密切相關，有關人參有效成分的抗氧化活性已有多篇報道[3-5]，作者前期也報道了人參的抗氧化作用[2]，并對多種抗氧化酶尤其是人參SOD進行了大量研究。然而，目前報道多是對某種成分進行抗氧化研究，很少進行活性導向下的有效成分分離，對人參中·OH抑制劑的提取分離實驗者尤其未見報道。筆者通過正交實驗制備不同提取條件下的人參水提取物，并測定其·OH清除率，為探索人參中·OH抑制劑的提取工藝及其活性導向下的有效成分分離奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 生曬參購自陽光大藥房，產地為吉林長白山，經本校鑒定教研室張慧教授鑒定，為4～5年生園參；BP-211D電子天平(Sartorius)；ALPHA12冷凍干燥機(Christ)；MR-96A型酶標儀(深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 人參水提取物的制備 生曬參，粉碎，平均分成16份，每份0.5 g。按照正交設計助手Ⅱv3.0L16(45)正交設計表，采用緩沖溶液(0.2MNa2HPO4-檸檬酸緩沖液，pH4.0；0.2MNa2HPO4-NaH2PO4緩沖液，pH6.0；0.2MNH4Cl-氨水緩沖液，pH8.0、pH10.0)提取，考察的因素水平如下：pH4、6、8、10；料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20(m∶v)；提取時間6、12、18、24h；提取溫度4、20、40、60℃；提取次數1、2、3、4次。各提取液4℃5000rpm離心10 min，收集上清，合并各次上清液，0.45μM濾膜過濾，各留取1 mL用于實驗，標記為1-16號樣品，其余液體冷凍干燥后，-20℃保存。

1.2.2 羥自由基清除能力測定 參照文獻[6]，采用Fenton法，于96孔板中分別加入FeSO4(6mM)、樣品、H2O2(6mM)各20 μL，靜置10 min，加入水楊酸溶液(6mM)20 μL，靜置30min，測定510 nm處的吸光度A值，以蒸餾水作空白，每個樣品3個復孔，計算羥自由基清除率。清除率=A空-(A樣-A對)/A空。A空為不加樣品的A值，A對為不加水楊酸時的A值。

1.2.3 樣本聚類分析 以樣品提取率和·OH清除率為聚類要素，運用SPSS13.0軟件，對16個樣品進行分析，采用離差平方和法(Ward'Method)計算類間距離。

1.2.4 驗證性實驗 根據羥自由基清除率，優選提取工藝，并按此工藝，重復試驗3次，按照上述方法測定并計算提取液羥自由基清除能力(1g/L)，進行驗證性實驗。

1.2.5 數據統計分析 采用正交設計助手Ⅱv3.0進行數據統計分析，以R值最小列為誤差項，進行數據顯著性檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 人參水提取物的制備 利用正交實驗，共制備得到16個樣品，各樣品的提取條件及提取率見表1。

2.2 人參水提物對羥自由基的抑制作用 利用Fenton法測定各樣品的·OH清除率，并根據樣品濃度及其實驗用體積，折算出各樣品單位濃度即1g/L(提取物濃度)下的羥自由基清除率(表1)；同時，以·OH清除率(提取物1g/L)為評價指標，對實驗結果進行方程分析(表2)。由表1可見，12號和14號樣品羥自由基清除率最高且相近；由表2可見，提取溫度(D)和料液比(B)對實驗結果影響顯著(P<0.05)。

表1 人參水提取物的羥自由基清除率

注：A→E五因素的四個水平(1→4)分別為：pH4、6、8、10；料液比(倍)5、10、15、20；提取時間(h)6、12、18、24；提取溫度(℃)4、20、40、60；提取次數1、2、3、4次。樣品提取率=凍干后樣品質量/用于凍干的樣品體積×樣品總體積/0.5×100%

表2 羥自由基清除率方差分析

2.3 16個樣品的聚類分析 為了方便比較各樣品間的差距，對16個樣品以提取率、·OH清除率(提取物)和·OH清除率(生藥)為評價指標進行聚類分析，結果見圖1?！H清除率%(生藥，1g/L)等于·OH清除率%(提取物，1g/L)與樣品提取率的乘積(結果未列)。由圖1可見，當距離為5時，16個樣品被聚為2類，即12、14、7聚為一類，其余聚為1類，這與單純以·OH清除率(提取物)為評價指標的聚類結果(未列)一致。比較各樣品的提取條件，不難看出，低溫和弱堿性pH是獲取較高活性·OH抑制劑的共性條件。

綜合圖1和表1，12號(A3B4C2D1E3)和14號(A4B2C3D1E4)樣品羥自由基清除率最高且相近；同時，據表1直觀分析結果，A3與A4、B4與B2、C2與C3接近，考慮到成本的節約和工藝的可行性，最終確定人參水提物中·OH抑制劑的最佳提取條件是A3B2C2D1E3，即pH8，料液比1∶10，4℃提取3次，每次12h。

2.4 驗證性實驗 按照上述優選的提取方法A3B2C2D1E3，精密稱取0.200g生曬參粉，3次浸提液合并，實驗平行3份，所得樣品羥自由基清除率分別為100.64%、98.25%、94.38%，平均值97.76%，表明該提取工藝下的人參水提取物羥自由基抑制率較高且穩定可行。

3 討論

前期研究表明，人參中含有多種抗氧化酶[7]，其中人參SOD已被分離得到[8]，其體外活性已有多篇報道[5-7]，對·OH抑制劑的研究目前未見報道。論文參考前期抗氧化酶的提取工藝，考慮到中醫的傳統用藥習慣和人類追求健康飲食的心里，避免使用有機溶劑，采用緩沖溶液提取法制備人參水溶性提取物，并基于正交實驗能夠較全面地考察多因素多水平，具有實驗次數少、方法簡便、結果準確可靠等優點。運用正交試驗設計優選·OH抑制劑的提取工藝，結果表明，人參水提物中含有·OH抑制劑，其活性受溫度、料液比、pH等影響，尤其受溫度影響最大，以低溫活性較高。根據實驗結果，并參考前期研究結果[7]，推測該·OH抑制劑很可能是一種抗氧化酶類，如過氧化氫酶(CAT)。

比較各提取物·OH清除率，以12號樣品最高(105.08%)；但比較相同生藥濃度(1g/L)下各樣品·OH清除率，則4號樣品最高(3.11%)。因4號樣品的提取率(6.72)是12號樣品(1.67)的4倍(表1)，但其·OH清除率(1g/L生藥)僅為12號樣品的1.8倍(3.11%4號，1.75%12號)，筆者認為，12號樣品的提取條件更有利于獲得高活性·OH抑制劑。綜合實驗結果，作者以提取物·OH清除率為評價指標，確定A3B2C2D1E3為最佳提取工藝。當然，本實驗僅是對·OH抑制劑提取工藝的初步研究，更為理想的提取方法還需要在此基礎上，縮小各水平的跨度做進一步探索。另外，本實驗為實驗室小試，放大生產后，提取條件可能會發生變化，其活性導向下的有效成分的分離純化尚需進一步研究。

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InhibitoryEffectofGinsengWaterExtractonHydroxylRadical

LI Hongyan NI Xuejiao ZHANG Xu CHEN Hongwei

College of Pharmacy, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Dalian 116600, China

ObjectiveComparing the inhibitory effect of different Water-soluble Extracts on Hydroxyl Radical.MethodsUsing orthogonal test design, extraction of ginseng water soluble effective parts; the hydroxyl radical scavenging rate of each extract was determined by salicylic acid method.ResultsSample No. 4 the highest yield (6.72%), Sample No. 12 hydroxyl radical scavenging maximum (105.08%).ConclusionGinseng water extract contains hydroxyl radical scavenger, the optimum extraction process is pH 8, feed ratio 1∶10，extraction 3 times, each time 12h at 4℃.

Ginseng Water Extract; Orthogonal Test; Hydroxyl Radicals; Anti-oxidation

遼寧省教育廳項目(L201606)；中國博士后科學基金項目(2013M530945)。

李紅艷(1982-)，女，漢族，博士研究生，副教授，研究方向為中藥藥理學。E-mail：lhywaiw @163.com

R285.5

A

1007-8517(2017)22-0018-03

2017-09-08 編輯：鄧佳麗)