大口黑鱸精子超微結構研究

喬志剛， 張曉光， 沈方方， 劉淑琰， 賈武

(河南師范大學水產學院，河南新鄉453007)

大口黑鱸精子超微結構研究

喬志剛， 張曉光， 沈方方， 劉淑琰， 賈武

(河南師范大學水產學院，河南新鄉453007)

為了解大口黑鱸Micropterussalmoides精子的超微結構，應用掃描電鏡和透射電鏡對大口黑鱸精子結構進行觀察。結果顯示，大口黑鱸精子由頭部、中段和鞭毛三部分組成，掃描電鏡下精子中段不明顯，無頂體；精子全長25.07 μm±4.93 μm(n=30)，頭部近球形，直徑1.73 μm±0.29 μm(n=30)，鞭毛長23.00 μm±4.86 μm(n=30)。頭部主要由細胞核構成，細胞核呈蘑菇形，染色質電子致密成簇，被電子透明區分開，核近鞭毛端向內凹陷，形成較淺的核窩。中段包括中心粒復合體和袖套，中心粒復合體由近端中心粒和遠端中心粒構成，近端中心粒位于核窩內，與細胞核橫軸平行，遠端中心粒為鞭毛的基部，位于核窩外，袖套內，與近端中心粒垂直，呈“T”字形。線粒體分布在袖套兩側的袖套腔中，形狀大小不一，總數(17±4)個(n=30)。鞭毛從袖套腔中伸出，主要由軸絲和側鰭構成，軸絲與遠端中心粒相接，有典型的“9+2”二聯微管結構，側鰭分布在鞭毛兩側。研究表明，大口黑鱸精子為硬骨魚類Ⅰ型精子，其袖套形狀以及線粒體的數目和大小與鱸形目Perciformes其他魚類的精子結構存在區別。

大口黑鱸； 精子； 超微結構

硬骨魚種類繁多，有21 000多種(楊萬喜等，2000)，其生殖特點不盡相同，已有研究顯示，硬骨魚類精子結構在系統發生和生物進化過程中有很高的多樣性和隨機性(Guoetal.，2016)。硬骨魚類精子結構由物種的分類地位和生殖方式共同決定。多種魚類精子的超微結構研究表明，同一科或亞科的魚類精子結構有很高的相似性，精子結構特征對于區分種間關系模式十分重要(Gusm?o-Pompianietal.，2005；Guoetal.，2016)。此外，精子結構能與一些普通形態學特征結合在一起，更好地運用在魚類系統發育分析中(Gusm?o-Pompianietal.，2005)。

大口黑鱸Micropterussalmoides俗稱加州鱸魚、黑鱸，隸屬硬骨魚綱Osteichthyes鱸形目Perciformes鱸亞目Porcoide太陽魚科Centrarchidae黑鱸屬Micropterus，肉質鮮美、生長快、易起捕，是一種純淡水、廣溫、肉食性的經濟魚類。大口黑鱸原產于美國加利福尼亞州，1983年初引入我國，經過試養與人工繁殖獲得成功，已成為我國重要的淡水養殖魚類之一(王利娟，2015)。目前，有關太陽魚科魚類精子結構的研究相對較少，對大口黑鱸的研究大多集中在與其生長性狀相關的方面(樊佳佳等，2009；陳乃松等，2010；李镕等，2011)。本研究旨在通過對大口黑鱸精子超微結構的觀察，探討大口黑鱸精子的結構特征，豐富太陽魚科魚類的生殖生物學資料，為該科魚類的繁育推廣提供科學參考。

1 材料和方法

1.1材料

實驗材料由河南省鶴壁市淇縣淇河鯽良種場提供。在大口黑鱸性成熟季節，挑選2齡、體質量0.8 kg左右、體型健壯、健康良好的雄魚10尾備用。

1.2方法

1.2.1采精方法采用絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，HCG)與促黃體素釋放激素類似物(luteinizing hormone releasing hormone-analog，LRH-A)的混合溶液進行人工催產，催產劑量為：每千克體質量的雄魚注射HCG 1 000 IU+LRH-A10 μg。注射后放入提前準備好的孵化池中，等待其精子成熟。水溫25 ℃，30 h(效應時間)后檢查精子成熟情況并采集。采精時腹部朝上，輕壓腹部，擠出膀胱中的尿液，醫用棉紗擦干魚體后采集精子(要求無糞便、無血液等污染)。放入盛有2.5%戊二醛溶液的玻璃瓶中，密封，標記，4 ℃冰箱保存，用于電鏡制樣和實驗觀察。

1.2.2掃描電鏡制樣將上述精子樣品用磷酸緩沖液(PBS，0.1 M，pH7.2～7.4)漂洗，滴加1%鋨酸進行再固定；依次用梯度乙醇(30%、50%、70%、80%、90%、100%、100%)、乙醇∶丙酮(3∶1、1∶1、1∶3)、丙酮(2次)脫水，每次10 min；二氧化碳臨界點干燥，干燥后的樣品放入離子鍍膜儀中噴金鍍膜。置掃描電鏡(日立-4800)下觀察并拍照。

1.2.3透射電鏡制樣將上述精子樣品用PBS(0.1 M，pH7.2～7.4)漂洗，滴加1%鋨酸進行再固定；依次用梯度乙醇(30%、50%、70%、80%、90%、100%、100%)、乙醇∶丙酮(3∶1、1∶1、1∶3)、丙酮(2次)脫水，每次10 min；環氧樹脂(Epon812)包埋，萊卡(Leica U7)超薄切片機切片，5%醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染法染色，日立HT-7700透射電鏡觀察、拍照。

1.2.4參數測量及數據統計分析采用Photoshop CS5、SPSS 20.0對圖片和數據分別進行處理、分析，所有數據以平均數±標準差表示。

2 結果

掃描電鏡結果顯示，大口黑鱸精子由頭部和鞭毛組成，中段不明顯，無頂體(圖版Ⅰ：1)。精子全長25.07 μm±4.93 μm(n=30)，頭部近球形，直徑1.73 μm±0.29 μm(n=30)，鞭毛長23.00 μm±4.86 μm(n=30)。

透射電鏡結果顯示，精子由頭部、中段和鞭毛組成，無頂體(圖版Ⅰ：4，8)。

精子頭部主要由細胞核構成，細胞核由雙層核膜包裹，除核底端外，周圍核膜與質膜緊密相連；細胞核呈蘑菇形，染色質電子致密且高度濃縮成簇，被一些電子透明區分散開(圖版Ⅰ：2)，細胞核近鞭毛端向內凹陷成較淺的核窩(圖版Ⅰ：4)。成熟的精子細胞核橫軸與鞭毛垂直(圖版Ⅰ：4)；未成熟的精子細胞核橫軸與鞭毛平行，尚未形成核窩，或細胞核發生旋轉但還未旋轉完全，細胞核橫軸與鞭毛處于既不平行，也不垂直的狀態(圖版Ⅰ：3)。

精子中段由袖套和中心粒復合體組成(圖版Ⅰ：4)。袖套呈筒狀，連于細胞核的后端。中央的空腔稱為袖套腔，袖套腔兩側袖套大小相似，內含少量細胞質、線粒體和囊泡。線粒體在兩側隨機分布，總數(17±4)個(n=30)，多種形態同時存在(圖版Ⅰ：4～7)。囊泡有2種類型：一種囊泡內充滿電子致密物質，一種無電子致密物質。位于袖套的細胞質膜因其所處的位置不同分為袖套內膜和袖套外膜，袖套內膜位于袖套的內側，包圍袖套腔，袖套外膜位于袖套的外側。中心粒復合體由近、遠端中心粒構成。成熟的大口黑鱸精子近端中心粒位于核窩內，與細胞核縱軸垂直，遠端中心粒與近端中心粒垂直，始于核窩末端，位于核窩外，并與鞭毛相連，形成鞭毛基部，近、遠端中心粒均具有“9+2”二聯微管結構(圖版Ⅰ：4，5)。

精子鞭毛細長(圖版Ⅰ：8)，起始部分位于袖套腔中，絕大部分伸出袖套之外。鞭毛的中心部分是軸絲。軸絲接于基體之后，具有典型的“9+2”二聯微管結構(圖版Ⅰ：4～7)。軸絲的外方存在由細胞質膜向兩側擴展而成的側鰭(圖版Ⅰ：9)。沒有囊泡和線粒體等結構(圖版Ⅰ：8)。

圖版Ⅰ 大口黑鱸精子超微結構Plate Ⅰ The ultrastructure of sperm of Micropterus salmoides

1. 掃描電鏡下大口黑鱸精子結構， 比例尺=5 μm； 2. 精子頭部橫切， 比例尺=1 μm； 3. 未成熟精子縱切， 比例尺=1 μm； 4.成熟精子縱切， 比例尺=1 μm； 5. 精子中段橫切， 比例尺=500 nm； 6. 精子中段縱切， 比例尺=1 μm； 7. 精子中段縱切， 比例尺=500 nm； 8. 精子鞭毛縱切， 比例尺=1 μm； 9. 精子鞭毛橫切， 比例尺=500 nm； AX. 軸絲， CS. 袖套腔， DC. 遠端中心粒， E. 電子透明區， F. 鞭毛， H. 頭部， La. 側鰭， M. 線粒體， MP. 中段， MT. 微管， N. 細胞核， PC. 近端中心粒， V. 囊泡。

1. sperm under SEM， scale bar=5 μm； 2. cross section of the head， scale bar=1 μm； 3. longitudinal section of the immature sperm， scale bar=1 μm； 4. longitudinal section of the mature sperm， scale bar=1 μm； 5. cross section of the midpiece of the sperm， scale bar=500 nm； 6. longitudinal section of the midpiece， scale bar=1 μm； 7. longitudinal section of the midpiece， scale bar=500 nm； 8. longitudinal section of the sperm flagellum， scale bar=1 μm； 9. cross section of the sperm flagellum， scale bar=500 nm； AX. axoneme， CS. central space of the sleeve， DC. distal centriole， E. electron lucent area， F. flagellum， H. head， La. lateral fin， M. mitochondrion， MP. midpiece， MT. microtubule， N. nucleus， PC. proximal centriole， V. vesicle.

3 討論

3.1大口黑鱸精子的分型

大口黑鱸精子分為頭部、中段和鞭毛三部分，總長約25.07 μm，頭部無頂體，符合硬骨魚類精子結構的一般特征。精子細胞核發生轉動，細胞核橫軸與鞭毛垂直，屬于Ⅰ型精子，與Baccetti等(1987)、Sprando和Russel(1988)描述的太陽魚科精子類型一致。

3.2大口黑鱸精子頭部結構特征

3.3大口黑鱸精子中段結構特征

大口黑鱸精子中段的袖套結構、線粒體數目和形態與其他鱸形目魚類精子有明顯區別。研究表明，大口黑鱸精子中段由袖套和中心粒復合體組成。袖套呈筒狀，連于細胞核的后端。中央的空腔稱為袖套腔，袖套腔兩側袖套大小相似，內含少量細胞質、線粒體和囊泡，符合一般硬骨魚類精子的結構特征。線粒體在兩側隨機分布，總數(17±4)個，多種形態同時存在；囊泡存在2種類型，一種囊泡內充滿電子致密物質，一種無電子致密物質。研究表明，大口黑鱸精子的袖套結構十分明顯，但在其他學者對諸多鱸形目魚類精子結構的研究中，則鮮有精子中段袖套結構的報道(Lahnsteiner & Patzner，1995；García-Díazetal.，1999；Gwoetal.，2004；胡謀等，2014)，報道中所提及的中心粒復合體和線粒體被細胞質包圍形成的通道與袖套的結構功能類似，但其形態差別較大；且其中的線粒體數目極少，如鯛科有1～2個線粒體(Lahnsteiner & Patzner，1995；Gwoetal.，2004)，中棘魚科僅有1個線粒體(Jamieson，1991)，數量較多的須鯛科也僅含有5個線粒體(Mattei，1970，1991)，這些物種中線粒體的形狀和結構基本相同，多為球形，個體較大，直徑約1 μm，切面顯示內部有線粒體，相反，大口黑鱸精子中的線粒體數目多，而體積小。分析比較其他已有的研究，大口黑鱸精子結構中的袖套結構和線粒體數目與鯉科魚類更為相似(尤永隆，林丹軍，1996)，而線粒體的形態結構卻和部分兩棲類動物精子的線粒體結構相似(Selmietal.，1997)。

中心粒復合體由近、遠端中心粒構成。大口黑鱸成熟精子的核窩較淺，僅近端中心粒位于核窩內，與細胞核縱軸垂直，遠端中心粒與近端中心粒垂直，始于核窩末端并與鞭毛相連，形成鞭毛基部，近、遠端中心粒均具有“9+2”二聯微管結構。一些鱸形目魚類精子結構中核窩較深(Lahnsteiner & Patzner，1995)，其中心粒復合體多在核窩內。

3.4大口黑鱸精子鞭毛結構特征

不同魚類的精子鞭毛側鰭形態不同，如須鯛科羊魚屬Mullus的紅鯔魚Mullusbarbatus精子鞭毛兩側均有側鰭；鯛科的重牙鯛Diplodussargus和牛眼鯛Boopboops精子鞭毛僅一側有側鰭(García-Díazetal.，1999)；而鯛科的真鯛和平鯛以及中棘魚科魚類精子鞭毛兩側均無側鰭(Jamieson，1991；Lahnsteiner & Patzner，1995)。目前，關于側鰭的作用缺乏統一解釋，其生物學意義仍有待進一步驗證。

陳乃松， 馬建忠， 周恒永， 等. 2010. 大口黑鱸對飼料中蛋氨酸需求量的評定[J]. 水產學報， 34(8)： 1244-1253.

樊佳佳， 白俊杰， 李小慧， 等. 2009. 大口黑鱸生長性狀的微衛星DNA標記篩選[J]. 遺傳， 31(5)： 515-522.

胡謀， 苗亮， 李明云， 等. 2014. 黃姑魚(Nibeaalbiflora)與大黃魚(Pseudosciaenacrocea)精子超微結構的觀察與比較[J]. 生物學雜志， 31(2)： 1-4.

李镕， 白俊杰， 李勝杰， 等. 2011. 大口黑鱸生長性狀的遺傳參數和育種值估計[J]. 中國水產科學， 18(4)： 766-773.

王利娟. 2015. 大口黑鱸保活運輸的研究[D]. 上海： 上海海洋大學.

楊萬喜， 應雪萍， 竺俊全， 等. 2000. 硬骨魚類精子發生及其在系統演化研究中的應用前景[J]. 東海海洋， 18(3)： 53-58.

尤永隆， 林丹軍. 1996. 鯉魚精子超微結構的研究[J]. 動物學研究， 17(4)： 377-383.

Baccetti B， Burrini AG， Collodel G，etal. 1987. On the undulating membranes of spermatozoa in some teleosts[J]. Acta EmbryologiaeetMorphologiae Experimentalis， 8： 215-221.

García-Díaz MM， Lorenti MJ， Gonzalez JA，etal. 1999. Comparative ultrastructure of spermatozoa of three marine teleosts of the genusSerranus：Serranusatricauda，SerranuscabrillaandSerranusscriba[J]. Journal of Submicroscopic Cytology and Pathology， 31(4)： 503-508.

Guo W， Shao J， Li P，etal. 2016. Morphology and ultrastructure ofBrachymystaxlenoktsinlingensisspermatozoa by scanning and transmission electron microscopy[J]. Tissue and Cell， 48： 321-327.

Gusm?o-Pompiani P， Oliveira C， Quagio-Grassiotto I. 2005. Spermatozoa ultrastructure in sciaenidae and polynemidae (teleostei： perciformes)with some consideration on percoideispermatozoa ultrastructure[J]. Tissue and Cell， 37： 177-191.

Gwo JC， Kuo MC， Chiu JY，etal. 2004. Ultrastructure ofPagrusmajorandRhabdosargussarbaspermatozoa (Perciformes： Sparidae： Sparinae)[J]. Tissue and Cell， 36(2)： 141-147.

Jamieson BGM.1991. Fish evolution and systematics： evidence from spermatozoa[M]. Cambridge： Cambridge University Press.

Lahnsteiner F， Patzner RA. 1995. Fine structure of spermatozoa of two marine teleost fishes， the red mullet，Mullusbarbatus(Mullidae)and the white sea bream，Diplodussargus(Sparidae)[J]. Journal of submicroscopic Cytology and Pathology， 27(2)： 259-266.

Lahnsteiner F， Patzner RA. 2008. Fish spermatology[M]. Oxford： Alpha Science Ltd.

Lahnsteiner F. 2003. The spermatozoa and eggs of the cardinal fish[J]. Journal of Fish Biology， 62(1)： 115-128.

Maricchiolo G， Laurà R， Genovese L，etal. 2010. Fine structure of spermatozoa in the blackspot sea breamPagellusbogaraveo(Brünnich， 1768) with some considerations about the centriolar complex[J]. Tissue and Cell， 42： 88-96.

Matos E， Matos P， Corral L，etal. 1995. Ultrastructural study of the spermatozoon ofCrenicichlasaxatilis(Pisces， teleostei) from the Amazon region[J]. Psycho Oncology， 4(1)： 33-38.

Mattei X. 1970. Spermiogeneses comparee des poisons[M]. New York： Academic Press， Inc： 57-69.

Mattei X. 1991.Spermatozoon ultrastructure and its systematic implications in fishes[J]. Canadian Journal of Zoology， 69(12)： 3038-3055.

Quagio-Grassiotto I， Gameiro MC， Schneider T，etal. 2003. Spermiogenesis and spermatozoa ultrastructure in five species of the Curimatidae with some considerations on spermatozoa ultrastructure in Characiformes[J]. Neotropical Ichthyology， 1(1)： 135-145.

Selmi MG， Brizzi R， Bigliardi E. 1997. Sperm morphology of salamandrids (Amphibia， Urodela)： implications for phylogeny and fertilization biology[J]. Tissue and Cell， 29(6)： 651-664.

Sprando RL， Russel LD. 1988. Spermiogenesis in bluegill (Lepomismacrochirus)： a study of cytoplasmic events including cell volume changes and cytoplasmic elimination[J]. Journal of Morphology， 198(2)： 165-177.

StudiesontheMicro-ultrastructureofMicropterussalmoidesSperm

QIAO Zhigang， ZHANG Xiaoguang， SHEN Fangfang， LIU Shuyan， JIA Wu

(Fisheries College， Henan Normal University， Xinxiang， Henan Province 453007， China)

The current study investigated the ultrastructure of largemouth bass (Micropterussalmoides) sperm using scanning electron microscope and transmission electron microscope. The sperm ofM.salmoideswas composed of three major parts： a nearly spherical head without an acrosome， a unconspicuous midpiece， and a slender flagellum. The full-length of sperm is 25.07 μm±4.93 μm (n=30) with a spherical head length of 1.73 μm±0.29 μm in diameter (n=30) and a slender flagellum length of 23.00 μm±4.86 μm long (n=30). The head of sperm is mainly composed of a mushroom-shaped nuclei， and the clustering electron-dense is separated by an electronlucent area. The nucleus near the flagellum segment is a depression， and it forms shallow nuclear fossa. The midpiece of sperm contains the centriolar complex and the sleeve. The centriolar complex is composed of the proximal and distal centriole. The proximal centriole is located inside the nuclear fossa and parallel to the cross axis of nuclei. The ‘T’ shape distal centriole locates outside the nuclear fossa and inside the sleeve is the base of flagellum， and it is perpendicular to the proximal centriole. There are 17±4 unequally sized mitochondria (n=30) inside the central space of both sides of sleeve. The flagellum of sperm stretched out of the central space of sleeve is mainly composed of the axoneme and the lateral fin. The axoneme comprised microtubule configurations in a ‘9+2’ microtubule pattern. The lateral fins are distributed on both sides of flagella. These results revealed that the sperm ofM.salmoidesshould be categorized as Type I， which is clearly distinct from the sperm of other species from order Perciformes in the shape of sleeve， the number and shape of mitochondria. The sleeve structure ofM.salmoidesis accord with the typical sleeve structure of teleost sperm， but the shape and the number of mitochondria ofM.salmoidesare similar with amphibian species， indicating thatM.salmoidesis more original in phylogenetic development than other species of Perciformes.

Micropterussalmoides； sperm； ultrastructure

10.11984/j.issn.1000-7083.20170205

2017-06-27接受日期2017-09-20

河南省高等學校重點科研項目(17B240003)； 淡水生態與生物技術國家重點實驗室開放課題(2017FB08)

喬志剛(1965—)， 博士， 教授， 從事水產苗種工程及集約化健康養殖研究， E-mail：hnsddsyy@126.com

Q952.4； Q959.4

A

1000-7083(2017)06-0686-05