雞Ⅱ型抗菌肽LEAP-2的原核表達(dá)及抑菌研究

許冬梅，武晉孝，田文霞，閆 芳，高文偉，馬海利，鄭明學(xué)，程志學(xué)，趙宇軍

雞Ⅱ型抗菌肽LEAP-2的原核表達(dá)及抑菌研究

許冬梅1，武晉孝2，田文霞3，閆 芳3，高文偉3，馬海利3，鄭明學(xué)3，程志學(xué)3，趙宇軍3

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷030801；2.山西省飼料獸藥檢查所，山西太原030027；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷030801）

為了研究雞Ⅱ型抗菌肽LEAP-2的體外表達(dá)產(chǎn)物的活性，試驗(yàn)進(jìn)行了肝臟樣品無菌采集，基因的克隆及密碼子優(yōu)化和表達(dá)，以表達(dá)產(chǎn)物對(duì)致病菌做紙片法藥敏試驗(yàn)，判斷其抑菌作用。結(jié)果表明，試驗(yàn)經(jīng)低溫處理獲得了較好的肝臟總RNA，克隆并優(yōu)化了雞LEAP-2基因；經(jīng)誘導(dǎo)得到了表達(dá)產(chǎn)物，形式為包涵體；抑菌試驗(yàn)表明，表達(dá)產(chǎn)物對(duì)16株分離致病菌具有抑制作用。

雞；LEAP-2；抗菌肽；原核表達(dá)；抑菌試驗(yàn)

雞LEAP-2，是肝臟表達(dá)Ⅱ型抗菌肽，為肝臟中產(chǎn)生并微量存在的一種抗菌肽[1-8]。在肉雞和蛋雞養(yǎng)殖中，細(xì)菌感染和繼發(fā)感染的治療是一類比較棘手的問題。現(xiàn)代生活中，人們膳食結(jié)構(gòu)的改變和對(duì)飲食質(zhì)量的要求使得肉雞和蛋雞的生產(chǎn)逐年增加，其幅度之大可以用指數(shù)增長(zhǎng)來形容。而動(dòng)物的大量集中和高密度飼養(yǎng)使得病原菌有了很好的滋生條件，同時(shí)藥物的殘留及有效的抗生素在獸醫(yī)領(lǐng)域的禁用，導(dǎo)致了養(yǎng)雞生產(chǎn)中針對(duì)細(xì)菌感染的藥物選擇越來越少，雞LEAP-2抗菌肽的發(fā)現(xiàn)為解決這種困境提供了一種新的思路[9-16]。

本研究針對(duì)從雞肝臟中克隆并優(yōu)化了密碼子的LEAP-2進(jìn)行了原核表達(dá)，旨在能夠提供一種可供選擇的抗菌產(chǎn)品來緩解生產(chǎn)中病原菌的困擾。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 5只2周齡健康紅布羅雞，購自太谷縣肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)。4株致病性大腸桿菌來源于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院預(yù)防系獸醫(yī)微生物實(shí)驗(yàn)室分離菌株。

1.1.2 主要試劑 DEPC溶液及DNA凝膠回收試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒Code#AT301-02、質(zhì)粒小提試劑盒、DNA限制性內(nèi)切酶Eco RI和Not I、反轉(zhuǎn)錄試劑盒E.coli DH5α，均購自天根生化科技（北京）有限公司；ITrizol試劑（貨號(hào)15596026），購自北京索萊寶科技有限公司；Trans5K DNAmarker，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；低分子蛋白Marker，購自上海酶聯(lián)生物研究所。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)NCBI基因庫中相關(guān)的序列設(shè)計(jì)引物，上游、下游引物序列分別為：LEAP-2 F （sense）：5′-GAA TTC ATG CAC TGC CT-3′，LEAP-2 R （anti-sense）：5′-GCG GCC GCT CAC TCGGACG-3′，引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.2 肉雞肝臟總RNA的提取 口腔內(nèi)剪斷雞眼兩側(cè)動(dòng)脈，放血處死肉雞，將整只雞浸泡于70%的乙醇中5 min，取出，在超凈臺(tái)上打開腹腔，剪取肝臟，于DEPC處理過的平皿中剪成碎片，每份稱取50～100 mg，保存于液氮中；另取一份放于-20℃冰箱內(nèi)提前降溫的研缽內(nèi)進(jìn)行研磨，磨到溶液變得透明；將液體轉(zhuǎn)移到1.5 mL的EP管中，取200μL氯仿加入，振蕩30 s后靜置10 min[5-7]，RNA的提取處理參照《分子克隆手冊(cè)》（2004-1）進(jìn)行。

1.2.3 LEAP-2基因擴(kuò)增 基因擴(kuò)增的體系：上游引物 1 pmol，2×TSReaction Mix 10 μL，TransScript RT/RI Enzyme Mix 1 μL，RNA 5 μL，RNase Free ddH2O至20μL。PCR反應(yīng)條件為：42℃30 min，85℃5 s，放置在-20℃?zhèn)溆谩EAP-2基因PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 2μL，dNTPMixture 1.6μL，上下游引物各1μL，Taq DNA聚合酶0.2μL，cDNA 1μL，ddH2O 13.2μL。PCR條件：94℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性 1 min，52 ℃ 30 s，72 ℃延伸 1 min，30個(gè)循環(huán)；擴(kuò)增產(chǎn)物連接到T載體送交上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1.2.4 LEAP-2原核表達(dá) 鑒于雞LEAP-2基因?yàn)?60 bp左右，交上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，使用載體為PGEX-6P-1，合成之前進(jìn)行密碼子優(yōu)化，LEAP-2基因與載體鏈接使用HindⅢ與BamhⅠ定向連接，命名為PGEX-6P-LEAP-2，IPTG 0.8 moL/L，37℃2 h，誘導(dǎo)菌離心后經(jīng)超聲波裂解，再經(jīng)變性復(fù)性之后經(jīng)GST標(biāo)簽柱層析進(jìn)行鑒定[3，6-7，15]。

1.2.5 紙片法檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物的抑菌作用 制備直徑為3mm的定量濾紙紙片，浸入質(zhì)量濃度為0.1mg/L的表達(dá)產(chǎn)物純化液中，30 s后取出備用；將山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院預(yù)防系獸醫(yī)微生物實(shí)驗(yàn)室分離的雞4株致病性大腸桿菌接種至營(yíng)養(yǎng)肉湯，37℃培養(yǎng)8 h，將肉湯以三角玻璃棒均勻涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂表面，共4個(gè)平皿，將紙片輕輕貼附于瓊脂表面，37℃培養(yǎng)過夜觀察結(jié)果，測(cè)量抑菌環(huán)直徑，并記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 肉雞肝臟mRNA提取

肝臟經(jīng)低溫處理研磨后進(jìn)行電泳，結(jié)果顯示，肝臟總RNA提取效果良好。

2.2 LEAP-2基因擴(kuò)增結(jié)果

經(jīng)PCR擴(kuò)增后獲得了目標(biāo)基因，大小為263 bp，經(jīng)測(cè)序并于NCBI基因庫中進(jìn)行BLAST同源性序列檢索，確定為L(zhǎng)EAP-2基因（圖1）。

2.3 LEAP-2表達(dá)

密碼子優(yōu)化后的合成基因經(jīng)誘導(dǎo)及經(jīng)過層析柱純化，主要存在于沉淀中，大小為33 ku（圖2）。

2.4 紙片法抑菌

經(jīng)37℃培養(yǎng)后，對(duì)4個(gè)平皿進(jìn)行抑菌圈直徑測(cè)量，表達(dá)蛋白的復(fù)性產(chǎn)物對(duì)4株山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院預(yù)防系獸醫(yī)微生物實(shí)驗(yàn)室保存菌株的抑菌圈均在6 mm左右，結(jié)果表明，該表達(dá)產(chǎn)物具有一定的抑菌作用，其結(jié)果列于表1。

表1 表達(dá)產(chǎn)物對(duì)4株致病性大腸桿菌的抑制作用 mm

3 討論

雞LEAP-2是一類體內(nèi)表達(dá)量很小的多肽，在實(shí)際應(yīng)用中直接從動(dòng)物體提取，成本較高，較難在實(shí)際生產(chǎn)中得到應(yīng)用，利用生物技術(shù)進(jìn)行制備是一種新的選擇[17-18]。

肝臟總RNA的提取相對(duì)來說比較困難，因?yàn)樵诟闻K內(nèi)有較其他組織中多的RNA酶，在提取過程中注意對(duì)低溫和操作的嚴(yán)謹(jǐn)性有較高的要求。筆者在綜合了其他組織RNA提取的文獻(xiàn)資料后，經(jīng)過對(duì)幾種不同方法的比較，得到了比較有效的肝臟總RNA。

很多組織可以產(chǎn)生抗菌肽，肝臟表達(dá)的抗菌肽具有一定的使用前景[19-20]，從產(chǎn)生部位來看，可以直接對(duì)經(jīng)由消化道進(jìn)入血液系統(tǒng)的微生物進(jìn)行第一時(shí)間處理，但其表達(dá)量的限制，使得直接提取成本較高，本研究的表達(dá)雖然嘗試了體外表達(dá)的生物學(xué)技術(shù)，然而表達(dá)的效果依然不能有效降低生產(chǎn)成本。因此，對(duì)該抗菌肽的生產(chǎn)應(yīng)用技術(shù)措施仍有待繼續(xù)探索。

［1］ CASTERLOW S L，LI H，GILBERT E R，et al.An antimicrobial peptide is downregulated in the small intestine of Eimeria maxima-infected chickens[J].Poult Sci，2011，90（6）：1212-1219.

［2］TAPIA E，MONTESC，REBUFEL C，et al.Expression of an optimized Argopecten purpuratus antimicrobial peptide in E.coli and evaluation of thepurified recombinant protein by in vitro challenges against important plant fungi[J].Peptides，2011，32：1909-1916.

［3］海力且木·艾力，徐鑫，劉忠淵.光滑鱉甲抗菌肽的原核表達(dá)條件優(yōu)化及其抗菌活性[J].昆蟲學(xué)報(bào)，2016，59（1）：8-15.

［4］WANGQ，ZHU F，XIN Y，et al.Expression and purification of antimicrobial peptide buforinⅡb in Escherichia coli[J].Biotechnol Lett，2011，33（11）：2121-2126.

［5］ WANG A，SU Y，WANG S，et al.High efficiency preparation of bioactive human α-defensin 6 in Escherichia coli Origami（DE3）pLysSby soluble fusion expression[J].Appl Microbiol Biotechnol，2010，87（5）：1935-1942.

［6］ FENG X，LIU C，GUO J，et al.Recombinant expression，purification，and antimicrobial activity of a novel hybrid antimicrobial peptide LFT33 [J].Appl Microbiol Biotechnol，2012，95 （5）：1191-1198.

［7］韓宗璽，馬德瑩，劉勝旺，等.重組雞抗菌肽Gallinacin-9的原核表達(dá)及其抗菌活性的鑒定 [J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2008，39（10）：1426-1431.

［8］韓文瑜，孫長(zhǎng)江.抗菌肽的研究現(xiàn)狀與展望[J].中國(guó)獸藥雜志，2009（10）：11-19.

［9］ MITTA G，VANDENBULKE F，HUBERT F，et al.Involvement of mytilins in messel antimicrobial defense[J].Biol Chem，2000，275（17）：12954-12962.

［10］ OREN Z，SHAI Y.A class of highly potent antibacterial peptides derived from pardaxin，a poreforming peptide isolated from moses sole fish Pardachirus marmoratus[J].Eur J Biochem，1996，237（1）：303-310.

［11］王軍，龐廣昌.抗菌肽抗菌機(jī)理的研究現(xiàn)狀及趨勢(shì)[J].食品科學(xué)，2005，26（8）：526-529.

［12］DAHER K A，SELSTED M E，LEHER R I.Direct inactivation of virus by human granulocyte defensins[J].Journal of Virology，1986，12：1068-1074.

［13］洪華珠，鐘春英，葉雯，等.幾種離體動(dòng)物細(xì)胞抗菌肽的誘導(dǎo)及抗菌活性的初步研究 [J].華中師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2005（4）：514-517，541.

［14］馮興軍，王建華，單安山.抗菌肽基因工程研究及其表達(dá)策略[J].中國(guó)生物工程雜志，2006（3）：63-67.

［15］魏洪濤，董震，張國(guó)利.人β防御素-2基因的克隆及原核表達(dá)載體的構(gòu)建[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2006（4）：358-360.

［16］張海文，施平偉，胡詩慧.抗菌肽CJH對(duì)LPS免疫應(yīng)激仔豬血液生理生化指標(biāo)的影響 [J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2017（9）：148-150.

［17］王鵬舉，譚煥波，蘇文成.菌絲霉素MP1106融合蛋白的復(fù)性及純化方法[J].生物技術(shù)通報(bào)，2017，33（9）：94-100.

［18］王一娟，何義進(jìn)，謝駿，等.抗菌肽對(duì)河蟹生長(zhǎng)、免疫及抗氧化能力的影響[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（2）：340-343.

［19］蔡云川，趙書燕，林黑著.不同蛋白水平下添加抗菌肽對(duì)赤點(diǎn)石斑魚影響的研究 [J].上海海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，26（3）：383-391.

［20］朱德偉，蔡國(guó)林，陸健.一種豬溶菌酶來源的抗菌六肽的分離鑒定及其性質(zhì)[J].生物工程學(xué)報(bào)，2017，33（6）：1046-1056.

Study on Prokaryotic Expression and Bacteriostasis Activity of Chicken Type II Antimicrobial Peptide LEAP-2

XUDongmei1，WUJinxiao2，TIANWenxia3，YANFang3，GAOWenwei3，MA Haili3，ZHENGMingxue3，CHENGZhixue3，ZHAOYujun3
（1.Collegeof Life Science，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China；2.Feed and Veterinary Drug Inspection Department of Shanxi Province，Taiyuan 030027，China；3.Collegeof Animal Science and Veterinary，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

Todeterminetheantibiotic activity of chicken LEAP-2 expressed in vitro,the geneof LEAP-2 was applied by RT-PCR instructed by the sequence NM_001001606,and then wasdone with codon optimization and cloned into pGEX-6P-1.After expressed in E.coli DE3,the expressed product was managed to do antibiotic experiment by bacteriostasis circle test.Theresults showed that chicken LEAP-2 gene had a satisfied gain under liquid nitrogen processing,LEAP-2 was cloned and after optimized then expressed by incusion bodiestype,antimicrobial susceptibility test result showed that 16 E.coli strain owned in laboratory was sensitived tothe protein.

chicken;LEAP-2;antimicrobial peptide;prokaryotic expression;bacteriostatic test

S831.5

A

1002-2481（2017）12-1998-03

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.12.24

2017-08-29

山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目（20140311021-3）

許冬梅（1974-），女，山西太谷人，講師，碩士，主要從事動(dòng)物遺傳及機(jī)制研究工作。趙宇軍為通信作者。