殼聚糖抗氧化效果的研究

張鳳洪 王立紅 李源 董惠峰/鼎正動物藥業(yè)（天津）有限公司

黃艷興/天津市薊州區(qū)牧業(yè)發(fā)展服務中心

殼聚糖抗氧化效果的研究

高晶晶/天津國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院

張鳳洪 王立紅 李源 董惠峰/鼎正動物藥業(yè)（天津）有限公司

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殼聚糖（聚β(1，4)-2-氨基-2-脫氧-D-葡萄糖）是甲殼素N-脫乙?；漠a(chǎn)物，化學名稱是，廣泛存在于蝦蟹、昆蟲的甲殼中，研究顯示殼聚糖對機體具有清除自由基、抵抗過氧化損傷等作用。據(jù)統(tǒng)計，全世界范圍內(nèi)加工蝦蟹所產(chǎn)生的廢棄物——蝦蟹殼，每年可達1.54×108t，這些廢棄物給環(huán)境帶來了嚴重的污染。從環(huán)境保護和廢物利用的角度出發(fā)，試驗前期從廢棄的蝦蟹殼內(nèi)采用酸浸一堿解法和濃堿水解法提取加工得到甲殼素衍生物——殼聚糖。本實驗通過測定殼聚糖提取物對羥基自由基、超氧陰離子自由基、DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基的清除作用及金屬螯和能力，對蝦蟹殼提取的殼聚糖抗氧化效果進行研究，旨在為廢棄蝦蟹殼殼聚糖的回收利用相關研究提供理論依據(jù)。

一、試驗材料與方法

（一）試驗材料

從蝦蟹殼內(nèi)提取分離的殼聚糖；VC，醫(yī)藥純；鄰二氮菲，硫酸亞鐵，鹽酸，三羥甲基氨基甲烷（Tris），鄰苯三酚，1，1-二苯基-2-三硝基苯肼，鐵氰化鉀，乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）等為分析純。

（二）試驗方法

1.殼聚糖對自由基的清除作用

（1） 采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法檢測殼聚糖對羥基自由基的清除作用。取1 ml 0.75 mol/L鄰二氮菲溶液加入2 ml PBS溶液，分別與1 ml不同濃度的樣品液充分混勻，加入0.75 mmol/L硫酸亞鐵溶液1 ml與0.01% H2O21 ml，于 37℃下溫育 60 min，于 536 nm處測其吸光度As。同時以去離子水作為空白對照組，檢測其Ab，不加樣品加H2O2測Ap。以Vc為標準對照，按下式計算羥自由基清除率：

清除率(D%)=(As-Ap)/(Ab-Ap)×100

（2）采用鄰苯三酚自氧化法檢測殼聚糖對超氧陰離子自由基的清除作用。取2.4 ml pH 8.2 Tris-HCl緩沖液，加入不同濃度的樣品液0.1 ml，混勻后加入8 mol/l的鄰苯三酚溶液0.3 ml，混勻，4 min后加入1滴濃HCl溶液中止反應，測得A325值，以去離子水為對照測A0，以Vc為標準對照，按下式計算超氧陰離子自由基清除率：

清除率(D%)=(A0-A325)/A0×100

（3） 清除DPPH自由基能力的測定。殼聚糖清除DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基能力的測定。配制5種不同質(zhì)量濃度的樣品。取2 ml樣品加入2 ml，含0.2 mmol/l DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）的無水乙醇溶液，混勻，常溫反應30 min，在波長517 nm處測定吸光度（Ai）。將樣品換為無水乙醇，測定吸光度（Ao），同時，測定2 ml樣品液和2 ml無水乙醇混合液的吸光度（Aj），計算清除率I。

以抗壞血酸Vc做陽性對照，實驗重復3次，取平均值。

2.金屬鰲合能力的測定

參考Decker 等的方法測定金屬鰲合能力。樣品管中加入不同濃度殼聚糖溶液1 ml，再加入3.7 ml蒸餾水、0.1 ml 2 mmol/L 的FeCl2溶液混合均勻，最后加入0.2 ml 5 mmol/L的菲洛嗪啟動反應，空白管用蒸餾水代替樣品液，標準管用蒸餾水代替FeCl2溶液，以上三組在室溫放置10 min后，在562 nm 測定吸光值，用EDTA作為陽性對照，設三組平行，用以下公式計算金屬螯合能力（%）

金屬螯合能力（%）=[A空白-（A樣品-A標準）]/A空白×100

二、結(jié)果與分析

（一）殼聚糖對自由基的清除作用

（1）采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法檢測殼聚糖對羥基自由基的清除作用。以Vc為參照，研究了殼聚糖對羥基自由基的清除作用，從圖1看出Vc和泥殼聚糖均隨著濃度的升高，清除羥基自由基的能力增強，并且在一定的濃度范圍內(nèi)，抑制率與濃度均呈現(xiàn)良好的線性關系，殼聚糖對羥基自由基的清除作用稍弱于Vc的清除作用。

圖1 Vc和殼聚糖對羥自由基的清除作用

（2）采用鄰苯三酚自氧化法檢測殼聚糖對超氧陰離子自由基的清除作用。殼聚糖對超氧陰離子自由基結(jié)果見圖2，隨著濃度的增加，Vc和殼聚糖對超氧陰離子自由基的清除作用逐漸增強，當濃度增加到2.0 mg/ml以上時對自由基的清除作用減慢，但總體說來Vc對超氧陰離子自由基的清除作用強于殼聚糖。

圖2 Vc和殼聚糖對超氧陰離子自由基的清除作用

（3）清除DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）自由基能力的測定。殼聚糖對DPPH自由基的清除作用在質(zhì)量濃度0.1～0.5 mg/ml的范圍內(nèi)，殼聚糖清除DPPH自由基的能力隨質(zhì)量濃度增大而增大，且呈良好的線性正相關，Vc的線性方程：y=108.24x+48.516 R2=0.9255， 殼 聚 糖 的 線 性 方 程 ：y=86.78x+38.85 R2=0.9165。以清除率為50% 時樣品的質(zhì)量濃度值作為評價對自由基清除能力的指標，即半數(shù)清除質(zhì)量濃度。由線性相關方程可得，Vc和殼聚糖清除DPPH 自由基的半數(shù)清除質(zhì)量濃度值分別為0.014 mg/ml和0.128 mg/ml。

圖3 殼聚糖對DPPH自由基的清除率

（二）金屬螯和能力的測定

殼聚糖對金屬螯合能力的影響結(jié)果見圖5，從圖中可以看出，EDTA表現(xiàn)出很強的螯合活性，在濃度為0.4 mg/ml時達到最大，為99.61%，隨后略有下降。殼聚糖對金屬的螯合能力總體來說低于EDTA，在0.2～1 mg/ml的濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的升高，呈上升趨勢。

圖4 殼聚糖對金屬螯合能力的影響

三、討論

本研究對蝦蟹殼提取的殼聚糖抗氧化效果進行檢測。結(jié)果表明，殼聚糖提取物對不同自由基的清除能力不同，殼聚糖濃度為0.5 mg/ml時，DPPH自由基清除率為80%左右，超氧陰離子自由基清除率為20%左右。并且低濃度殼聚糖提取物對自由基的清除能力較低，殼聚糖濃度達2.5 mg/ml時超氧陰離子自由基清除率僅為約40%，羥自由基清除率僅為約30%。周元敬等人表示殼聚糖對自由基的清除效率隨著殼聚糖濃度的增大而升高，與本實驗研究結(jié)果相同。Je等人經(jīng)研究表示，5～1 kDa的殼聚糖在3 mg/ml時可清除95%以上的DPPH自由基，且自由基的清除率隨著殼聚糖相對分子質(zhì)量的增大而降低，因此從廢棄蝦蟹殼內(nèi)提取出的殼聚糖分子量尚待進一步研究。

本實驗中，從廢棄蝦蟹殼內(nèi)提取出的殼聚糖濃度為2.5 mg/ml時金屬螯合率即可達到80%左右，證明其具有較高的金屬螯合能力，這與殼聚糖的結(jié)構有關。殼聚糖是一種天然高分子，在其分子結(jié)構的重復單元中存在氨基氮、羥基氧及N_乙酰氨基，由于這些基團的存在，使殼聚糖通過氫鍵或鹽鍵形成具有類似網(wǎng)狀結(jié)構的籠形分子，從而對金屬離子有著穩(wěn)定的配位作用，因而能同過渡金屬離子形成配鍵而具有極強的螯合能力。

（略）