中華絨螯蟹細胞色素CYP2基因的克隆與表達分析

蒲紅雙，侯紅漫，高祥剛，赫崇波，張公亮，許藝迪，鮑相渤，劉衛東

( 1. 大連工業大學 食品學院，遼寧 大連 116034； 2. 遼寧省海洋水產科學研究院，遼寧省海洋水產分子生物學重點實驗室，遼寧 大連 116023 )

中華絨螯蟹細胞色素CYP2基因的克隆與表達分析

蒲紅雙1,2，侯紅漫1，高祥剛2，赫崇波2，張公亮1，許藝迪2，鮑相渤2，劉衛東2

( 1. 大連工業大學 食品學院，遼寧 大連 116034； 2. 遼寧省海洋水產科學研究院，遼寧省海洋水產分子生物學重點實驗室，遼寧 大連 116023 )

為研究細胞色素CYP2基因在中華絨螯蟹蛻皮及生長發育中的作用，本試驗通過逆轉錄聚合酶鏈式RT-PCR反應以及cDNA末端快速擴增RACE技術獲得了中華絨螯蟹CYP2基因cDNA全長。用實時熒光定量PCR技術，分析該基因在中華絨螯蟹蛻皮過程中各組織的相對表達量。試驗結果顯示，中華絨螯蟹CYP2的 cDNA全長1772 bp，編碼491個氨基酸序列，包括一個84 bp的5′端非編碼區，一個212 bp的3′端非編碼區、一個1475 bp的開放閱讀框，經BLAST比對，該核苷酸序列與岸蟹、三疣梭子蟹的相似性分別為66%、64%。實時熒光定量PCR結果顯示，中華絨螯蟹蛻皮前，CYP2基因在鰓中的表達量相對最高；在肝胰臟、肌肉中表達量略低于鰓；在Y器官、眼柄、胸神經節、腦神經節、腸中少量表達；在心和胃中表達量最低。中華絨螯蟹在不同的蛻皮時期中，通過熒光定量試驗得出，肝胰臟中CYP2基因表達量在蛻皮前期和蛻皮期最高；眼柄中CYP2基因表達量從蛻皮期到蛻皮后期有上升趨勢；鰓中CYP2基因表達量在蛻皮前期最高；Y器官、腦神經節和腸中CYP2基因表達量在蛻皮期最高；肌肉中CYP2基因表達量在蛻皮前期最高；胸神經節和胃中CYP2基因表達量在蛻皮后期最高；Y器官中CYP2基因在蛻皮前期表達量高于蛻皮后期和蛻皮期。以上試驗結果表明，CYP2對中華絨螯蟹蛻皮生長中的調控可能起到重要作用。

中華絨螯蟹；CYP2；蛻皮；基因克隆

目前越來越多的研究證實，甲殼動物的蛻皮生長過程需要多種激素協同調控，蛻皮激素在甲殼動物蛻皮生長過程中起到關鍵性的作用[1-3]。蛻皮激素在甲殼動物中的存在方式多種多樣，而其主要的是以 20-羥蛻皮甾酮(20E) 形式存在。細胞色素P450酶系(CYP)是廣泛存在于生物體內的一類代謝酶系。 細胞色素P450酶系家族成員在 20E 合成和降解中發揮重要作用[4]。細胞色素P450酶系作為本家族中最為古老的家族之一，它參與外源和內源物質在動植物等體內的代謝和轉化。細胞色素P450研究最先見于昆蟲，受各種外源物質的誘導，而細胞色素P450家族在相關研究中證明其在甲殼動物蛻皮中也起到重要的調節作用[5-7]。

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)在我國廣泛分布于遼河、黃河、長江、甌江和閩江等江河流域，其肉味鮮美、營養豐富[8]。自 20 世紀 80 年代以來，中華絨螯蟹養殖業發展迅速，目前已成為水產養殖支柱產業之一[9]。螃蟹的生長離不開蛻皮，而細胞色素P450與螃蟹的蛻皮有很大的相關性。因此研究CYP2基因在中華絨螯蟹蛻皮生長中的作用，具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

取自盤錦野生中華絨螯蟹(體質量約70 g)，暫養于養殖室，使用泵氧系統，模擬自然生長環境，投喂養殖飼料。用解剖剪活體解剖3只中華絨螯蟹心、Y器官、眼柄、肝胰臟、肌肉、胸神經節、腦神經節、腸、鰓、胃，用于組織表達分析。將中華絨螯蟹分為蛻皮后期、蛻皮間期、蛻皮前期和蛻皮期[3]。各取3只蛻皮后期、蛻皮前期、蛻皮期的中華絨螯蟹的心、Y器官、眼柄、肝胰臟、肌肉、胸神經節、腦神經節、腸、鰓、胃，用于蛻皮周期中CYP2基因相對表達量分析。將新鮮組織器官放液氮中暫時冷凍，待解剖結束將樣品保存于冰箱-80 ℃備用。

1.2 總RNA的提取和cDNA的合成

取上述中華絨螯蟹的各組織于液氮中研磨，使用TIANGEN 動物組織總RNA提取試劑盒進行總RNA的提取，核酸蛋白測定儀(NanoPhotometer)與1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質量及完整性。

取中華絨螯蟹肝胰臟組織提取的總RNA為模板，按照PrimerscriptTMReverse transcriptase (TaKaRa)試劑盒說明書反轉錄合成cDNA用于基因序列的克隆。分別提取蛻皮周期中各時期的上述10種組織樣品的RNA，使用Primescript RT Reagent Kit (TaKaRa)試劑盒進行反轉，將得到的cDNA存于冰箱中-20 ℃保存備用。

1.3 中華絨螯蟹CYP2基因的cDNA片段的克隆

根據GenBank中岸蟹的CYP2基因保守區域設計上下游引物ESCYP-1/ESCYP-2，由上海生工生物工程有限公司合成引物(表1)。以上述中華絨螯蟹肝胰臟的cDNA為模板，ESCYP-1/ESCYP-2為引物進行CYP2基因cDNA的擴增。PCR擴增體系為25 μL，cDNA模板1 μL，dNTP Mixture (2.5 mmol/L) 4 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，10×Buffer 2.5 μL，LATaq酶(5 U/μL) 0.25 μL，加滅菌超純水至總體積25 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，32個循環；最后72 ℃延伸10 min。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，后送上海生物工程有限公司進行測序。

表1 中華絨螯蟹CYP2基因克隆和定量PCR所用的引物

1.4 CYP2基因全長的克隆

根據已經獲得的CYP2基因片段設計3′RACE outer Primer ESCYP-3/inner Primer ESCYP-4和5′RACE outer Primer ESCYP-5/inner Primer ESCYP-6(表1)引物，按照3′-Full RACE Core Set with PrimeScriptTMRTase (TaKaRa) 和5′-Full RACE Kit with TAP (TaKaRa)說明書的反應體系和反應條件進行CYP2基因3′和5′端序列的擴增。產物送上海生工生物工程有限公司測序。

1.5 生物學信息分析

用ORF finder 軟件(http:∥ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)確定開放閱讀框；用BLAST (http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov /Blast.cgi)、PrimerPremier 5.0生物學軟件將中華絨螯蟹CYP2的cDNA全長翻譯成氨基酸序列；用Protparam (http://web.expasy.org/protparam)程序預測氨基酸序列物理參數；用BioEdit軟件進行序列同源性比對；用SigalP 3.0 server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)預測信號肽；用Mega 5.0軟件進行鄰接系統進化樹的構建并用Phylip和MrBayes軟件采用最大似然法和貝葉斯法進行驗證。

1.6 實時熒光定量PCR

參照獲得的中華絨螯蟹CYP2基因全長cDNA序列，利用PrimerPremier 5.0和FPCR軟件設計一對定量PCR的特異性引物ESCYP-7/ESCYP-8(表1)，用于CYP2基因的熒光定量分析，并應用內參引物Actin-S/Actin-R[10]量化分析CYP2在中華絨螯蟹不同組織和不同生長周期各組織的表達差異。定量PCR反應條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s。樣本和內參分別設置3個平行。試驗使用STRATAGENE Mx3005p Real-Time PCR熒光定量PCR儀，采用2-ΔΔCt法進行數據分析，用Excel軟件進行顯著性分析，P<0.05為差異顯著。

2 結 果

2.1 CYP2基因cDNA的序列分析

以中華絨螯蟹肝胰臟總RNA為模板擴增得到的cDNA序列全長1772 bp(GenBank登錄號：KT159166)，編碼491個氨基酸序列，包括一個84 bp的5′端非編碼區、一個212 bp的3′端非編碼區、一個1475 bp的開放閱讀框 (ORF)，編碼491個氨基酸。根據ProtParam tool軟件分析預測CYP2的分子式為C2592H3954N658O709S15，分子量大小為56 158.7 u，理論等電點為6.05，亮氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸含量相對較高，分別為11.4%、8.6%、6.9%。加尾信號(AATAA)以及Poly-A見圖1。經BLASTx以及多序列比對表明，該氨基酸序列與岸蟹(Carcinusmaenas)、三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)等的CYP450氨基酸序列具有很大的相似性(圖2)，由此確定該序列為中華絨螯蟹CYP2基因的cDNA序列。

圖1 中華絨螯蟹CYP2基因的cDNA序列及預測的氨基酸序列小寫字母分別表示5′、3′非編碼區，大寫字母代表編碼區序列，上面為核苷酸序列，下面對應為編碼的氨基酸序列；橢圓形框內ATG代表起始密碼子，*表示終止密碼子，陰影部位表示信號肽序列，下劃線“aataa”為多聚腺苷氨酸加尾信號，長方形框內代表血紅素結合區保守序列(FXXGXXXCXG), 雙下劃線為K螺旋保守序列(ExxR).

圖2 中華絨螯蟹CYP2氨基酸序列比對GenBank 登錄號：Carcinus maenas (岸蟹：ACI94903.1)，Portunus trituberculatus (三疣梭子蟹：AHZ97878.1)，Eriocheir sinensis (中華絨螯蟹：KT159166).

2.2 CYP2基因比對及系統進化樹分析

將中華絨螯蟹CYP2基因氨基酸序列與岸蟹、三疣梭子蟹等CYP2氨基酸進行比對，其相似性為66%和64%。利用Mega 5.0軟件進行鄰接法構建相關氨基酸的系統進化樹。結果顯示，甲殼動物聚為一支，昆蟲聚為一支，魚類聚為一支(圖3)。

圖3 利用 MEGA 5.0 軟件構建的基于CYP2家族的基因序列的NJ系統進化樹GenBank 登錄號 ：Carcinus maenas (岸蟹：ACI94903.1)，Portunus trituberculatus (三疣梭子蟹：AHZ97878.1)，Eriocheir sinensis (中華絨螯蟹：KT159166)，Stegodyphus mimosarum (隆頭蛛：KFM58273.1)，Fundulus heteroclitus (鳉科硬骨魚：XP_012721843.1)，Tigriopus japonicus (日本虎斑猛水溞：AIL94139.1)，Oryzias melastigma (海水青鳉：AGN04335.1) Laodelphax striatella (灰飛虱：AGI92302.1), Pseudosciaena crocea(大黃魚：KKF12365.1), Nilaparvata lugens (褐飛虱：AIW79970.1), Zootermopsis nevadensis (白蟻：KDR21921.1), Chaetodon mertensii (橙尾蝶：ABO21082.1), Pediculus humanus corporis (人體虱：XP_002427451.1)，Daphnia pulex ( 淡水枝角水溞：EFX85356.1), Danio rerio (斑馬魚： XP_001337781.3), Camponotus floridanus (弓背蟻XP_011253751.1).

2.3 CYP450在中華絨螯蟹各組織的表達

以CYP-5/CYP-6為熒光定量 PCR 引物，中華絨螯蟹心、Y器官、眼柄、肝胰臟、肌肉、胸神經節、腦神經節、腸、鰓、胃等10個組織的cDNA為模板，Actin-s/Actin-R為內參基因，利用熒光定量PCR方法研究中華絨螯蟹CYP2 mRNA的組織表達特征，設定中華絨螯蟹CYP2基因在心中的表達量為1，根據CYP2基因在各個組織中的相對表達量作柱形圖(圖4)。由圖4可知，CYP2基因在所有檢測的組織中均有表達，且在中華絨螯蟹鰓中表達量最高，其次是肝胰臟和肌肉(P<0.05)；心、Y器官、眼柄、胸神經節、腦神經節、腸和胃中有少量表達。

取蛻皮前期、蛻皮期、蛻皮后期中華絨螯蟹典型的10 個組織，心、Y器官、眼柄、肝胰臟、肌肉、胸神經節、腦神經節、腸、鰓、胃，利用熒光定量 PCR 方法檢測CYP2 mRNA 在這些組織中的表達情況。設定中華絨螯蟹CYP2基因在蛻皮前期心中的表達量為1，根據 CYP2 基因在各蛻皮階段10個組織中的相對表達量作柱形圖(圖5)。熒光定量 PCR 結果顯示，在中華絨螯蟹不同蛻皮時期中，心中CYP2基因在蛻皮前期表達量最高，顯著高于其他時期(P<0.05)；Y器官中CYP基因表達量在蛻皮期表達量最高，略高于其他時期(P<0.05)；眼柄中CYP2基因表達量從蛻皮前期到蛻皮后期呈上升趨勢(P<0.05)；肝胰臟中CYP2基因表達量在蛻皮期最高，與蛻皮后期、蛻皮前期呈顯著性差異(P<0.05)；肌肉中CYP2基因表達量在蛻皮前期最高，與其他各蛻皮時期呈顯著性差異(P<0.05)；胸神經節中CYP2基因表達量在蛻皮后期最高，顯著高于其他時期(P<0.05)；腦神經節中CYP2基因表達量在蛻皮期最高(P<0.05)；腸和胃中CYP2基因在各時期表達量無顯著性差異(P>0.05)；鰓中CYP2基因表達量在蛻皮前期最高，蛻皮后期顯著高于蛻皮期(P<0.05)。

圖4 中華絨螯蟹CYP2基因在各組織中的相對表達情況

圖5 中華絨螯蟹CYP2基因在不同蛻皮時期各組織中的相對表達情況

3 討 論

細胞色素P450酶系參與多種外源物質(親脂藥物、有機污染物、環境致癌物質等)和內源物質(蛻皮激素、保幼激素、類固醇及類固醇衍生物、脂肪酸等) 在生物體內的轉化、合成與代謝過程[5-7,11-12]。相關研究表明，細胞色素P450廣泛存在于同一生物體中的各個組織部位并且表達量均有不同。當外源物質進入哺乳動物時，其主要通道是肝胰臟、肺、消化道及皮膚等；而在魚類等動物體中，則主要入口為鰓、腎及肝胰臟等。馮艷艷等[13]的相關研究表明CYP450在三疣梭子蟹的肝胰腺中表達最多，其他研究者在岸蟹[14]的研究中也有類似結果。

據Nebert等[15]命名法則：依據氨基酸序列的相似程度來確定不同基因所屬的家族與亞家族規定，同一家族的基因成員氨基酸序列相似性達到40%以上；同一亞家族成員，氨基酸序列相似性達到55%以上。Nelson等[16]提出了依據氨基酸序列的同源性和系統發育學來劃分CYP450超家族的系統命名法：CytochromoP450用英文縮寫CYP表示。同一家族的氨基酸序列相似性應該高于40%，用CYP后面跟一具體數字表示，如CYP1、CYP2、CYP3和CYP4等；同一亞家族的氨基酸序列相似性高于55%，用大寫英文字母表示，如CYP1A、CYP2L等；同一亞家族中不同亞型的功能具有相似性，按照這些亞型被鑒定的先后順序，用阿拉伯數字進行編號，如CYP1A1和CYP4C2等。通過BLASTX比對，中華絨螯蟹序列與岸蟹CYP379A1相似性達到66%，與三疣梭子蟹的CYP2相似性達到64%。Dam等[14]研究表明，CYP2與CYP379A1同屬于一個功能家族，其組織表達部位相同，在肝胰臟表達量最多。通過該序列的功能作用及命名法則，我們將獲得的中華絨螯蟹序列命名為CYP2。

雖然CYP450包括很多家族，而且各家族參與催化的底物種類和反應類型之間具有差異性，但是在結構上仍然保留著一些共同的保守區域，即CYP基因家族所特有的K螺旋保守序列(ExxR)和血紅素結合區(FxxGxxxCxG)[17]。在GenBank中進行BLASTX同源性比對，中華絨螯蟹CYP2基因與甲殼類動物及昆蟲的細胞色素P450基因家族的氨基酸序列有很高的相似性。從系統進化樹分析發現。甲殼類動物的CYP2家族基因聚為一支，符合物種的分子進化關系。

柳志業等[2]在三疣梭子蟹中克隆了CYP302A1；Kim等[18]在岸蟹中克隆出CYP330A1[3]；艾均文等[6]研究發現CYP家族的第一個基因(CYP337A1)并進行基因克隆與序列分析。張曉燕等[7]在三疣梭子蟹中克隆出CYP4C基因，婁繪芳等[19]在大黃魚中克隆出CYP4F7基因；Akira 等[12]在斑馬魚中克隆出CYP2AA2基因；馮艷艷等[13]在三疣梭子蟹中克隆出CYP2基因；Boyle等[20]在佛羅里達龍蝦(Procambarusalleni)肝胰腺中又克隆出多條CYP2L基因，CYP家族基因在各個物種中都陸續被發現。

由CYP2基因在中華絨螯蟹蛻皮周期心、Y器官、眼柄、肝胰臟、肌肉、胸神經節、腦神經節、腸、鰓、胃中的表達情況可知，鰓中的表達量較高，肝胰臟和肌肉其次，其他各組織也都有表達。CYP2基因在各組織中均有表達，這與其他學者的研究相同；但馮艷艷等[13]發現，CYP2基因在甲殼動物肝胰臟中表達量最高，鰓、肌肉等相對表達量為其次，與本試驗結果存在差異。但CYP2基因在蛻皮后期、蛻皮期等各組織部位相對表達量分析表明，蛻皮期時肝胰臟相對表達量最高，明顯高于鰓等組織的相對表達量，說明CYP2基因在肝胰臟中的相對表達量影響著甲殼動物的蛻皮。在蛻皮期，甲殼動物蛻皮所需蛻皮激素增加，CYP2的相對含量積累的最多；在蛻皮后期，甲殼動物蛻皮接近尾聲時CYP2基因的相對表達量最低，說明在甲殼動物蛻皮的這個周期中，CYP2 大量消耗，以至于在蛻皮周期即將結束時候CYP2含量降低。許多研究者發現，CYP450 在各組織中的分布具有明顯的選擇性，例如研究發現藥物代謝的主要場所為肝胰臟[21]，CYP450家族的含量在這個器官也最多。而作為外源物質進入體內第一道防線的鰓和皮膚等組織，其含量也相對較高。對于CYP450 的這種選擇性分布，研究者懷疑其在生物體內發揮著重要的作用[13]。

本試驗首次克隆得到了中華絨螯蟹CYP2基因的cDNA全長，其蛻皮周期各組織器官表達分析進一步說明，CYP2基因在中華絨螯蟹蛻皮周期中可能具有重要的調節作用，本試驗為深入研究CYP2基因在甲殼動物蛻皮調控中的作用奠定了良好的基礎。

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cDNACloningandExpressionAnalysisofCYP2GeneinChineseMittenCrabEriocheirsinensis

PU Hongshuang1,2, HOU Hongman1, GAO Xianggang2, HE Chongbo2, ZHANG Gongliang1, XU Yidi2, BAO Xiangbo2, LIU Weidong2

( 1. College of Food Science Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China; 2. Key Lab of Marine Fishery Molecular Biology of Liaoning Province, Liaoning Ocean and Fisheries Science Research Institute, Dalian 116023, China )

The full-length cDNA of CYP2 gene was cloned using reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) and rapid-amplification of cDNA ends (RACE) to study the regulation of CYP2 gene in molting in Chinese mitten crabEriocheirsinensis. Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) was used to quantify the relative expression level of CYP2 in different tissues and molting process in Chinese mitten crab. The results showed that the full-length cDNA sequence of CYP2 was 1772 bp, a 5′-untranslated region (UTR) of 84 bp, and a 3′-UTR of 212 bp and included a 1475 bp ORF encoding 491 amino acid residues. The alignment of CYP2 amino acid sequence of in Chinese mitten crab showed that it shared 66% identity with crabCarcinusmaenasand shared 64% identity with swimming crabPortunustrituberculatus. The CYP2 mRNA was expressed in all tissues examined and highly in gills. CYP2 expression was slightly lower in hepatopancreas and muscle than in the gills, with small amount in Y organs, eye stalk, horaci ganglion, cerebral ganglion, and intestines and trace in heart and stomach. During the molting process, the expression levels of CYP2 mRNA of hepatopancreas was the maximum in D and E period. The amount of CYP2 expression in eye stalk was rising from E period to AB period, and CYP2 expression in gills was the maximum in D and AB period. CYP2 expression in Y organs, cerebral ganglion and intestines was the maximum in E period. CYP2 expression in muscle was the maximum in D period. CYP2 expression in thoracic ganglion and stomach was the maximum in AB period, and in Y organs higher in D period than in AB and E periods. The findings indicate that CYP2 might play an important role in regulation of the molting process.

Eriocheirsinensis; CYP2; molting; gene cloning

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.02.006

2015-09-11；

2016-07-28.

國家自然科學基金資助項目(31302178)；遼寧省科學事業公益研究基金資助項目(2016004005).

蒲紅雙(1990-)，女，碩士研究生；研究方向: 食品科學. E-mail: phsdlgy@163.com.通訊作者： 高祥剛(1980-)，男，副研究員；研究方向: 動物分子遺傳學. E-mail: xiangganggao@163.com.

Q786

A

1003-1111(2017)02-0153-07