不同施肥條件對土池培育小球藻總脂含量及脂肪酸組成的影響

陳 煒，梁明明，白永安，李曉東，趙 文

( 1.大連海洋大學 遼寧省水生生物學重點實驗室，遼寧 大連 116023； 2.大連海洋大學 水產與生命學院, 遼寧 大連 116023； 3.盤錦光合蟹業有限公司，遼寧 盤錦 124200 )

不同施肥條件對土池培育小球藻總脂含量及脂肪酸組成的影響

陳 煒1,2，梁明明2，白永安3，李曉東3，趙 文1,2

( 1.大連海洋大學 遼寧省水生生物學重點實驗室，遼寧 大連 116023； 2.大連海洋大學 水產與生命學院, 遼寧 大連 116023； 3.盤錦光合蟹業有限公司，遼寧 盤錦 124200 )

以遼寧盤錦光合蟹業有限公司養殖基地為試驗場所，研究施以3種肥料(化肥、雞肥、化肥與雞肥的混和肥)對土池培育小球藻的主要營養指標——脂質含量和脂肪酸組成的影響。試驗結果表明，施混合肥所培養的小球藻，其藻細胞密度略高于化肥組和雞肥組；混合肥組小球藻的脂質含量(鮮質量的5.36%)也高于化肥組(鮮質量的4.02%)和雞肥組(鮮質量的2.89%)；混合肥組小球藻的多不飽和脂肪酸和高度不飽和脂肪酸的含量顯著優于單一施化肥或雞肥的小球藻。因此，在土池中施混合肥更有利于培育出高質量的小球藻。

小球藻；脂質；脂肪酸；施肥；土池

小球藻(Chlorella)是仔魚、蝦、蟹、貝類幼體重要的生物餌料，也是培養輪蟲等浮游動物的餌料[1-2]。小球藻的脂肪酸組成和含量是評價其營養價值的重要指標之一，其中的多不飽和脂肪酸，尤其是二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸，是海產動物的必需脂肪酸，對其存活和幼體生長至關重要[3-4]。大量研究表明，培養條件與小球藻的脂肪酸組成和含量密切相關[5-8]，關于營養條件和營養方式影響小球藻脂質和脂肪酸的研究多集中于室內培養[9-11]。生產上常采用室外土池培養生物餌料，與室內培養條件相比，室外土池的影響因素更復雜，積累的數據資料相對較少。在土池培養生物餌料方面，先后有學者就土池培養輪蟲、橈足類、鹵蟲(Artemia)、糠蝦的脂肪酸營養[12-14]以及施肥后土池中浮游生物種群變動狀況[15-16]等進行了研究，筆者亦先后研究了季節及生長周期對土池小球藻脂肪含量和脂肪酸組成的影響[17-18]，尚未見到有關施肥對土池培育小球藻脂肪酸營養方面的報道。

本文對比研究了施以化肥、雞肥、化肥與雞肥的混和肥(簡稱混合肥)對小球藻脂質含量和脂肪酸組成的影響，為室外土池大規模、高質量的培養小球藻提供依據。

1 材料與方法

1.1 小球藻的培養和采集

試驗在遼寧盤錦光合蟹業有限公司三角洲養殖場基地進行。試驗材料為蛋白核小球藻(C.pyrenoidesa)。試驗池為戶外土池，規格15 m×5 m，水深0.4 m。用100 mg/L的漂白粉處理土池。第2 d按1∶1比例接種，然后1號池施化肥(碳酸氫銨100 mg/L、過磷酸鈣30 mg/L)，2號池施雞糞肥(與1號池所施化肥量相當)，3號池施混合肥(雞糞肥∶化肥=1∶1)，全池均勻潑灑。

試驗期間每日測定藻細胞密度和水化指標，每隔2～3 d追加施肥并補充因蒸發而減少的水量。培養期間主要水質指標為：水溫25.7～29.1 ℃，鹽度21～23，pH 8.01～9.85，溶解氧6.5～20.0 mg/L，氨氮24.29～70.95 mg/L，活性磷0.71～2.37 mg/L。

在藻細胞密度達到穩定時取樣，連續采集2個周期。經高速離心(16 000 r/min)后，得到不同施肥條件下的小球藻藻膏，于-24 ℃下保存待測。

1.2 脂質提取、脂肪酸測定方法

脂質的提取采用改進的Folch法[19]。將所得脂質用KOH-甲醇在70 ℃水解1 h ，再用BF3催化法[20]制備脂肪酸甲酯。最后萃取到石油醚中，濃縮，待上機分析。

用GC-2010型氣相色譜儀(日本島津公司)進行脂肪酸測定。色譜條件：分析柱為FFAP抗氧化交聯石英毛細管柱(購自中國科學院大連化學物理研究所，規格為30 m×0.25 mm×0.3 μm)；載氣為高純N2，柱流量1 mL/min，分流比100∶1；柱溫由160 ℃以2 ℃/min的速度升至230 ℃，并保持至出峰完畢；進樣口溫度250 ℃；FID檢測器溫度230 ℃。色譜峰的鑒定采用脂肪酸甲酯標準樣品(SIGMA公司)與ECL文獻值相結合的方法[21-23]，定量采用面積歸一化法。

1.3 數據處理方法

平行測定3個樣品。試驗數據用平均值±標準差表示。采用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析和多重比較，P<0.05為差異顯著。

2 結 果

2.1 不同施肥條件下小球藻的生長情況

不同施肥條件下連續2個周期的藻細胞密度變化曲線見圖1。由圖1可見，接種后1～2 d藻細胞數緩緩增加，接種后2～4 d細胞數明顯增加，隨后的2～3 d藻細胞密度穩定在1.0×107個/mL。此時，抽出部分藻液收獲加工，然后補水追肥，藻細胞數迅速減少，在原池中繼續培養小球藻，藻細胞密度進入第2個變化周期。結果顯示，不同施肥組藻細胞密度變化曲線具有一致性，混合肥組平穩期的藻細胞數量略高于化肥組和雞肥組。

圖1 不同施肥條件下小球藻的藻細胞密度變化曲線

2.2 不同施肥條件下小球藻脂質含量

不同施肥條件下小球藻脂質含量見表1。由表1可知，施加混合肥培育的小球藻脂質含量最高，化肥組次之，雞肥組最低。混合肥組小球藻的脂質含量顯著高于雞肥組。

表1 不同施肥條件下小球藻脂質含量(鮮質量) %

注：同一行標有不同字母的組間差異顯著(P<0.05).下同.

2.3 不同施肥條件下小球藻脂肪酸的組成和含量

不同施肥條件下小球藻主要脂肪酸組成和含量見表2。

表2 不同施肥條件下的小球藻主要脂肪酸含量 %

由表2可知，不同施肥組的主要脂肪酸種類相同，均為11種；含量最高的飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸、多不飽和脂肪酸分別為16:0、16:1和20:5n-3。但不同施肥組之間部分脂肪酸含量存在一定差別。混合肥組的多不飽和脂肪酸含量和高度不飽和脂肪酸含量(24.39%、22.67%)顯著高于化肥組(22.72%、21.17%)和雞肥組(21.28%、19.13%)，而單不飽和脂肪酸含量(25.76%)明顯低于化肥組(26.17%)和雞肥組(26.64%)，各試驗組之間的飽和脂肪酸含量差異不顯著。

3 討 論

利用土池培養的生物餌料脂類營養方面研究已有一些進展。吳旭干等[12]的研究表明，土池培育的褶皺臂尾輪蟲(Brachionusplicatilis)的二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸、花生四烯酸、高度不飽和脂肪酸含量均顯著高于酵母和微綠球藻(Nannochloropsis)培育的輪蟲，具有明顯的營養優勢；朱迪琴[13]等利用土池培育了鹵蟲、輪蟲、橈足類、糠蝦等生物餌料，并分析了其脂類營養特點；陳煒等[14]比較了潑灑雞糞漿培育的褶皺臂尾輪蟲與5種單一微藻培育的輪蟲的脂肪酸營養，結果表明雞糞漿輪蟲的高度不飽和脂肪酸含量高于微綠球藻輪蟲和衣藻(Chlamydomonas)輪蟲，與球等鞭金藻(Isochrysisgalbana)輪蟲和新月菱形藻(Nitzschiaclosterium)輪蟲接近，但明顯低于小球藻輪蟲。

本試驗結果表明，施混合肥的土池小球藻不僅在平穩期藻細胞數略高于雞肥組和化肥組，而且脂質和多不飽和脂肪酸、高度不飽和脂肪酸含量也顯著高于其他兩組。混合肥組、化肥組和雞肥組的多不飽和脂肪酸分別占小球藻鮮質量的1.30%、0.9%、0.6%(其中二十碳五烯酸分別占小球藻鮮質量的1.0%、0.7%、0.5%)。說明施混合肥有利于土池培育高營養價值的小球藻。筆者曾多次測定該地區土池培育小球藻的脂肪酸組成和含量，此次測定結果中多不飽和脂肪酸、高度多不飽和脂肪酸、二十碳五烯酸的含量相對較低，主要原因是本次取樣時間為夏季，而季節對土池小球藻脂肪酸含量的影響非常明顯[17]。

氮、磷、碳等主要營養元素及其比例均與微藻的生長和營養富集相關[5-7，9]。根據中國有機肥料養分志的數據，雞糞烘干基含有機碳30.146%，全氮2.338%，全磷0.929%，全鉀1.606%；雞糞鮮基含有機碳16.511%，全氮1.032%，全磷0.413%，全鉀0.717%[24]。雞糞中碳、氮、磷含量不是很充足，不能完全滿足小球藻對營養鹽的需求。本試驗所用的化肥是碳酸氫銨和過磷酸鈣，化肥中氮、磷、碳含量雖然充足，但是化肥遇水易分解，營養鹽補充迅速，但損耗相對也快，營養鹽不能被小球藻充分利用，最佳繁殖條件難以維持。雞糞和化肥混合使用，恰好互補了兩者的不足。相比室內可控條件，土池培養小球藻雖然條件粗放，影響因素較多，但更接近于自然，收獲量大，成本低，更適合于大規模生產。

水體富營養化問題是整個水產養殖業面臨的共性問題。在生產過程中，土池水體實際上一直處于富營養化狀態，以保證小球藻的持續穩定高產。盤錦地區的生產季節通常自3月初到10月末，建議在停止生產前期，抽取藻液后，只補水不再追加施肥，讓小球藻自然消耗掉土池中的營養鹽，并隨著藻液的抽出而帶出水體。采取這一措施雖然生產末期小球藻的收獲周期增長，收獲量降低，但有利于保護水體生態環境，也有益于當地生產的可持續發展。

致謝

試驗期間得到大連海洋大學雷衍之教授和李永函教授的指導和幫助，在此表示衷心感謝！

[1] 王金秋,李德尚,曹吉祥.5種藻和2種酵母對萼花臂尾輪蟲餌料效果的比較研究[J].水生生物學報,2003,27(5):476-486.

[2] 黃顯清,王武,成永旭.不同喂養條件和營養強化對大型溞總脂及脂肪酸組成的影響[J].上海水產大學學報,2001,10(1):49-54.

[3] 荻野珍吉著. 陳國銘，黃小秋譯. 魚類的營養和飼料[M].北京：海洋出版社，1987：126-148.

[4] 陳立僑,江洪波,周忠良,等.ω-3HUFA對中華絨螯蟹幼體存活率及體脂肪酸組成的影響[J].水產學報,2000,24(5):448-452.

[5] 石娟,潘克厚.不同培養條件對微藻總脂含量和脂肪酸組成的影響[J].海洋水產研究,2004,25(6):79-85.

[6] 楊秀霞,于浩,曾曉起.影響微藻脂肪酸組成因素概述[J].海洋湖沼通報,2001(1):76-82.

[7] 丁彥聰,高群,劉家堯,等.環境因子對小球藻生長的影響及高產油培養條件的優化[J].生態學報,2011,31(18):5307-5315.

[8] Teoh M L, Chu W L, Marchant H, et al. Influence of culture temperature on the growth, biochemical composition and fatty acid profiles of six Antarctic microalgae [J]. Journal of Applied Phycology,2004(16):421-430.

[9] 曹春暉,孫世春,麥康森,等.氮濃度對四株海洋綠藻總脂含量和脂肪酸組成的影響[J].海洋湖沼通報,2006(3):79-84.

[10] 嚴佳琦,黃旭雄,黃征征,等.營養方式對小球藻生長性能及營養價值的影響[J].漁業科學進展,2011,32(4):77-84.

[11] 胡慧慧,徐年軍.不同培養基及組成對2種小球藻生長和油脂的影響[J].生物學雜志,2012,29(4):12-16.

[12] 吳旭干,成永旭,賀詩水,等.褶皺臂尾輪蟲土池低鹽度培育及其脂肪酸營養評價[J].海洋水產研究,2007,28(4):59-65.

[13] 朱地琴,吳旭干,潘迎捷,等.土池肥水培育的生物餌料與鹵蟲無節幼體的脂類及脂肪酸組成的比較研究[J].上海水產大學學報,2007,16(5):448-453.

[14] 陳煒,李曉東,王增立,等.雞糞漿及5種微藻對輪蟲脂肪酸組成的影響[J].水產科學,2006,25(3):113-116.

[15] 王海雷,趙文,李曉東,等.施肥對多鹽水池塘浮游植物演替的影響[J].中國水產科學,2005,12(5):608-613.

[16] 白國福,張廣英,竇亞秋,等.施肥后河蟹育苗試驗圍隔浮游生物狀況及其變動[J].水產科學,2006,25(12):644-648.

[17] 陳煒,白永安,李曉東,等.春夏季遼寧盤錦地區土池培養的小球藻總脂含量和脂肪酸組成的分析[J].大連海洋大學學報,2013,28(6):585-588.

[18] 陳煒,梁明明,白永安,等.小球藻不同生長時期總脂含量和脂肪酸組成的變化[J].水產科學,2013,32(9):545-548.

[19] Christie W W. Lipid Analysis[M]. Oxford:Pergamon Press, 1982:22.

[20] Metcalfe L D, Schmitz A A, Peaka J R, et al. Rapid preparation of fatty acids esters from lipids for gas chromatographic analysis[J]. Analyt Chem,1966,38(3):514-515.

[21] Ackman R G. Analysis of oils and fats[M]. London: Elsevies Appl Sci Pub,1986:137-206.

[22] Ackman R G. Simplification of analyses of fatty acids in fish lipids and related lipid samples[J]. Acta Med Scand,1987,222(2):99-103.

[23] Christie W W. Equivalent chain-lengths of methyl ester derivatives of fatty acids on gas chromatography:a reappraisal[J]. J Chromat,1988(447):305-314.

[24] 全國農業技術推廣服務中心.中國有機肥料養分志[M].北京:中國農業出版社,1999:19-21.

EffectsofDifferentFertilizedConditiononLipidContentandFattyacidCompositioninGreenAlgaChlorellainanEarthenPond

CHEN Wei1,2, LIANG Mingming2,BAI Yongan3, LI Xiaodong3,ZHAO Wen1,2

( 1. Key Laboratory of Hydrobiology in Liaoning Province，Dalian Ocean University, Dalian 116023, China; 2. College of Fisheries and Life Science, Dalian Ocean University, Dalian 116023, China;3. Panjin Guanghe Crab Industry Co. Ltd., Panjin 124200, China )

The total lipid content and the fatty acid composition were determined in green algaChlorellapyrenoidesacultured in the outdoor ponds with different manure conditions (fertilizer, chicken dung, mixed-use of chicken dung and fertilizer) in Panjin Guanghe Crab Industry Co. Ltd. The results showed that there was slightly higher density of alga sampled from the mixed-use of chicken dung and fertilizer ponds than that sampled from the chicken dung pond or fertilizer ponds. The total lipid content ofC.pyrenoidesacultivated by the mixed-use of chicken dung and fertilizer (5.36% of fresh weight) was significantly higher than that inC.pyrenoidesacultivated by a single kind of fertilizer (4.02% of fresh weight)or chicken dung(2.89% of fresh weight).The percentage of polyunsaturated fatty acid (PUFA), highly unsaturated fatty acid (HUFA) ofC.pyrenoidesagathered from the mixed-use of chicken dung and fertilizer pond were significantly higher than that inC.pyrenoidesagathered from the other two kinds of ponds. Therefore, mixed-use of chicken dung and fertilizer was the most conducive to produce high quality in outdoor ponds.

Chlorellapyrenoidesa; lipid;fatty acid; applied fertilizer; pond

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.02.012

2016-05-11；

2016-07-28.

國家海洋局海洋公益項目(201305005-02)；盤錦光合蟹業有限公司委托大連海洋大學科研項目(2012023).

陳煒(1968-)，女，高級實驗師；研究方向：水產營養與飼料分析.E-mail:chenwei@dlou.edu.cn.

S963.16

A

1003-1111(2017)02-0188-04