紅唇薄鰍2個野生群體的遺傳多樣性研究

劉紅艷，熊 飛，段辛斌，田輝伍，劉紹平，陳大慶

( 1.江漢大學 生命科學學院，湖北 武漢 430056； 2. 中國水產科學研究院 長江水產研究所，湖北 武漢 430223 )

紅唇薄鰍2個野生群體的遺傳多樣性研究

劉紅艷1，熊 飛1，段辛斌2，田輝伍2，劉紹平2，陳大慶2

( 1.江漢大學 生命科學學院，湖北 武漢 430056； 2. 中國水產科學研究院 長江水產研究所，湖北 武漢 430223 )

采用9 個微衛星DNA標記對長江支流岷江下游厥溪和長江上游干流朱楊溪紅唇薄鰍的2個野生群體遺傳多樣性及遺傳分化情況進行了研究。共檢測出73條等位基因，其中厥溪群體中有55條等位基因，朱楊溪群體中有69條等位基因，兩群體共有等位基因數為51條。厥溪群體和朱楊溪群體的平均等位基因數分別為6.111和7.667，平均觀測雜合度分別為0.665和0.668；平均期望雜合度分別0.684和0.712,平均多態性信息指數分別為0.621和0.656，從各參數結果來看，朱楊溪群體的遺傳多樣性水平高于厥溪。AMOVA結果顯示，大多數遺傳變異存在于紅唇薄鰍群體內(98.68%)，群體間的遺傳變異為1.32%，固定系數不顯著。基因流為9.42，表明兩群體間基因交流頻繁。UPGMA 聚類顯示，厥溪和朱楊溪群體中的個體相互混雜。這些結果表明長江上游厥溪和朱楊溪群體未出現遺傳分化。

紅唇薄鰍；微衛星；遺傳多樣性

紅唇薄鰍(Leptobotiarubrilabris)，屬鯉形目、鰍科、薄鰍屬，為長江上游特有魚類[1]。在鰍科中個體較大，僅次于長薄鰍(L.elongata)，喜流水環境。20世紀80年代在長江上游干流及支流分布較廣泛，但隨著長江三峽工程的截流及金沙江梯級水電站的開發，破壞了其棲息地和產卵場的環境，加之環境污染、過度捕撈等原因，其天然資源量銳減[2-5]。目前關于紅唇薄鰍的研究資料相當少，僅見紅唇薄鰍泌尿系統的組織學觀察[6]和種群生態與線粒體遺傳學的研究[7]。研究遺傳多樣性有助于了解物種的進化歷史和種群恢復潛力，因此，為了有效保護和恢復紅唇薄鰍種群資源，有必要對其遺傳多樣性進行研究。

微衛星DNA是由2～6個核苷酸組成的核心單元串聯重復形成，廣泛分布于真核生物的整個基因組中，同一座位上，由于核心單元的重復數不同，在群體中表現出多態性[8-9]。目前，微衛星DNA標記已廣泛應用于魚類種群遺傳學研究[10-14]。本研究利用微衛星DNA標記技術，對長江支流岷江下游厥溪和長江上游干流朱楊溪紅唇薄鰍的2個野生群體的遺傳多樣性進行研究，查明其遺傳多樣性水平，遺傳分化和基因流情況，以期為紅唇薄鰍的保護和資源恢復提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 樣本采集和DNA提取

2011年1月—2013年1月進行長江上游紅唇薄鰍資源分布調查，樣品采集。樣本采集地為長江支流岷江下游的厥溪和長江上游干流的朱楊溪，其中厥溪樣本為19尾，朱楊溪樣本為30尾。剪取部分鰭條于95%乙醇中保存帶回實驗室。取保存于乙醇中的鰭條組織，置于0.9%的生理鹽水浸泡約12 h(期間更換生理鹽水3～4次)，鰭條組織去除乙醇后，剪碎置于離心管中，然后加入DNA 提取緩沖液[0.4 mol/L NaCl，10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)，2 mmol/L EDTA (pH 8.0) ]600 μL，終含量為2%的十二烷基硫酸鈉和終質量濃度為0.2 mg/mL的蛋白酶 K，混勻后56 ℃消化5～6 h，期間取出混勻數次，DNA經酚—氯仿抽提，2倍體積無水乙醇沉淀，75%酒精洗滌,滅菌蒸餾水溶解。獲得的DNA用核酸蛋白分析儀檢測其純度和質量濃度，最終DNA模板質量濃度定量在20 ng/μL，-20 ℃保存備用。

1.2 微衛星DNA標記分析

采用本實驗室篩選的重復性穩定、多態性好的9個微衛星DNA標記進行群體遺傳研究，其中7個為紅唇薄鰍微衛星DNA標記(LR26、LR27、LR31、LR33、LR34、LR35、LR37)[15]， 2個為同屬魚類長薄鰍的微衛星DNA標記(CB12和CB18)[16]。PCR反應總體積為10 μL，包括Taq DNA 聚合酶0.5 U(Fermentas)，dNTP 0.2 mmol/L，MgCl22.0 mmol/L，1×Buffer，引物0.2 μmol/L，DNA 模板約20 ng，補充滅菌蒸餾水到10 μL。PCR 擴增程序為95 ℃預變性5 min，接著進行35個循環：94 ℃變性40 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸40 s，最后72 ℃延伸10 min。反應在PTC100型PCR儀上進行。擴增產物用非變性的8%聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，并通過銀染法進行檢測。

1.3 數據分析

根據DNA Marker標記和微衛星DNA的遷移率，讀取各等位基因條帶。利用CONVERT 1.3.1軟件[17]，將各群體等位基因條帶矩陣轉化相關分子遺傳學軟件所需的格式。用Popgene 1.2軟件[18]計算各遺傳多樣性參數，包括各位點的等位基因數目、觀測雜合度、期望雜合度。用PIC-CALC 0.6軟件計算多態性信息指數。

分子變異方差分析用AMOVA軟件[19]計算，檢測群體內和群體間的遺傳變異情況，計算中考慮微衛星等位基因的大小差異，所有多重比較中的P值均進行泊松校正。用Arlequin 3.1軟件[20]計算群體間遺傳距離。用 NTSYS[21]中的SHAN程序進行UPGMA 聚類，構建群體間的遺傳關系。

2 結 果

2.1 微衛星DNA標記的PCR 擴增

9個微衛星DNA標記在2個紅唇薄鰍群體中均表現為多態性。共檢測出73條等位基因，其中在厥溪群體中有55條等位基因，在朱楊溪群體中有69條等位基因，兩群體共有等位基因數為51條。每個位點檢測到的等位基因數分別為2～12不等,平均值為8.111。引物LR35的在朱楊溪群體中的等位基因數最多，為12條，引物CB12在厥溪群體中的等位基因數最少，為2條(表1)。

2.2 遺傳多樣性

厥溪和朱楊溪的平均等位基因數分別為6.111和7.667，平均觀測雜合度分別為0.665和0.668，平均期望雜合度分別0.684和0.712，平均多態性信息指數分別為0.621和0.656(表1)。可以看出，朱楊溪群體各遺傳多樣性參數均高于厥溪群體的，表明朱楊溪群體的遺傳多樣性水平高于厥溪。

表1 紅唇薄鰍群體微衛星多態性數據

2.3 遺傳變異與聚類分析

厥溪和朱楊溪的Nei′s遺傳距離為0.0633，遺傳相似指數為0.9367，2個群體間的遺傳距離較小，遺傳相似度較高。分子方差分析(表2)顯示，大多數遺傳變異存在于紅唇薄鰍群體內(98.68%)，群體間的遺傳變異為1.32%，固定系數遺傳分化指數不顯著，表明厥溪和朱楊溪群體未出現遺傳分化。基因流為9.42，表明2個群體間基因交流頻繁。

表2 紅唇薄鰍群體分子變異方差分析

UPGMA 聚類圖顯示(圖1)，厥溪和朱楊溪群體中的個體相互混雜，并未按相應的地理位置進行聚類，表明這2個長江上游群體沒有出現明顯的遺傳分化。

圖1 基于Nei′s遺傳距離的UPGMA聚類圖

3 討 論

3.1 紅唇薄鰍群體的遺傳多樣性

厥溪和朱楊溪的平均等位基因數分別為6.111和7.667個，這與DeWoody等[22]得出的淡水魚類微衛星等位基因數目約為7.5個的結論接近。同時，多態信息指數也是衡量基因片段多態性的理想指標，當多態信息指數>0.5 時，該座位為高度多態性；當0.25<多態信息指數<0.5 時, 該座位為中度多態性；當多態信息指數<0.25 時，該座位為低度多態性[23]。在厥溪群體和朱楊溪群體微衛星位點中有3個中度多態性位點(LR31、CB12和CB18)，其余6個位點為高度多態性位點。從本研究選用的9 個微衛星DNA標記的多態性來看，紅唇薄鰍2個野生群體的多態信息含量較高，屬于中度及高度多態性，這說明紅唇薄鰍的等位基因多樣性較為豐富。

雜合度是指群體在多個基因座上遺傳變異的表現，被認為是評價群體的遺傳多樣性的一個最適參數，按照Hardy-Weinberg定理，雜合度在隨機交配群體中≤0.5[24]。本研究中，2個紅唇薄鰍群體的觀測雜合度和期望雜合度均大于0.5，表明紅唇薄鰍發生近交的可能性不大。紅唇薄鰍2個群體的平均觀測雜合度和平均期望雜合度分別為0.667及0.698，低于同喜流水生活的長江宜賓圓口銅魚(Coreiusguichenoti)(觀測雜合度0.753, 期望雜合度0.728)[25]、鰱魚(Hypophthalmichthysmolitrix)(觀測雜合度0.805)[26]的雜合度，高于長江水系的草魚(Ctenopharyngodonidellus)(觀測雜合度0.4000～0.5741，期望雜合度0.4773～0.6489)[26]、鯉魚(Cyprinuscarpio)(期望雜合度0.267～0.419)、銅魚(C.heterokon)(觀測雜合度0.4251～0.5158)等魚類的雜合度[28]，表明紅唇薄鰍的群體遺傳多樣性比較豐富，有著較大的進化適應的潛力，這與田輝伍利用線粒體Cyt b和控制區DNA研究結果一致[7]。

3.2 紅唇薄鰍基因流和遺傳分化

紅唇薄鰍2個群體間的遺傳距離較小，這說明2個群體間的遺傳相似程度較高。分子方差分析也顯示，2個群體間遺傳變異只占總遺傳變異的較小的比例(1.32%)，并且遺傳分化指數值不顯著，也說明紅唇薄鰍群體間差異較小，遺傳變異主要發生在群體內。UPGMA也支持厥溪和朱楊溪群體沒有出現遺傳分化，這2個群體均屬于同一種群。這可能與紅唇薄鰍的生活習性和產卵習性有關，紅唇薄鰍屬于喜流水環境的魚類，在繁殖季節，親魚有上溯到相應的產卵場習性，產漂流性卵，卵隨著河水向下漂流孵化，而后其幼魚和成魚則溯流回到上游，因而在這個過程中，各分布區群體之間有更多的遺傳交流機會。本研究中基因流較大，也證明了群體間的基因交流頻繁。這與線粒體Cyt b和控制區DNA的研究結果一致[7]。與紅唇薄鰍有著相似生活習性和同為產漂流性卵的中華沙鰍(Botiasuperciliaris)在長江上游也未出現群體的遺傳分化[29]。另外，產漂流性卵的銅魚、圓口銅魚和草魚也未發生顯著的遺傳分化[27-28,30-31]。

3.3 種質保護

本研究中，雖然2個紅唇薄鰍群體都保持了較高的遺傳多樣性, 但朱楊溪群體的遺傳多樣性水平要顯著高于厥溪群體，說明岷江厥溪群體遺傳資源已遭到了一定程度的破壞，需要加強保護。目前紅唇薄鰍資源量正在不斷地減少，長江上游梯級大壩的開發仍在持續的進行，大壩的建立將限制紅唇薄鰍上下游群體之間的遺傳交流，極大的改變水文條件，破壞其棲息地和產卵場，紅唇薄鰍生存前景不容樂觀，亟需進行長江特有物種的保護。物種的保護必須充分考慮到物種的遺傳特征，本研究結果顯示紅唇薄鰍群體間沒有顯著遺傳分化，可作為1個遺傳單元來進行保護和管理。大壩截流后水庫的形成，使原來的流水環境變成靜水環境，鑒于紅唇薄鰍獨特的喜流水生活習性，有必要擴大采樣范圍和樣本量進一步全面深入的研究紅唇薄鰍遺傳結構及多樣性，以便為其種質資源的保護、管理以及種群恢復提供更加可靠的科學依據。

[1] 丁瑞華. 四川魚類志[M]. 成都:四川科學技術出版社, 1994.

[2] 王文君, 謝山, 張曉敏, 等. 岷江下游產漂流性卵魚類的繁殖活動與生態水文因子的關系[J]. 水生態學雜志, 2012, 33(6):29-34.

[3] 高天珩, 田輝伍, 葉超, 等. 長江上游珍稀特有魚類國家級自然保護區干流段魚類組成及其多樣性[J]. 淡水漁業, 2013, 43(2):36-42.

[4] 熊飛, 劉紅艷, 段辛斌, 等. 長江上游江津江段魚類群落結構及資源利用[J]. 安徽大學學報, 2014, 38(4):95-102.

[5] 段辛斌, 田輝伍, 高天珩, 等.金沙江一期工程蓄水前長江上游產漂流性卵魚類產卵場現狀[J]. 長江流域資源與環境, 2015, 24(8):1358-1365.

[6] 史晉絨, 王永明, 謝碧文, 等. 紅唇薄鰍泌尿系統的組織學觀察[J]. 淡水漁業, 2014, 44(3):23-29.

[7] 田輝伍. 長江上游保護區長薄鰍和紅唇薄鰍種群生態及遺傳結構比較研究[D]. 重慶:西南大學, 2013.

[8] Li Y, Korol A B, Fahima T, et al.Microsatellites within genes: structure, function, and evolution [J]. Mol Biol Evol, 2004, 21(6):991-1007.

[9] Lawson M J, Zhang L. Distinct patterns of SSR distribution in theArabidopsisthalianaand rice genomes [J]. Genome Biol, 2006(7):14.

[10] 王長忠, 梁宏偉, 鄒桂偉, 等. 長江中上游兩個鰱群體遺傳變異的微衛星分析[J]. 遺傳, 2008, 30(10): 1341-1348.

[11] 吳勤超, 梁宏偉, 李忠, 等.黃顙魚微衛星標記的篩選及三個野生群體的遺傳結構分析[J]. 生物技術通報, 2010(3):154-163.

[12] Chen L, Michael W B, Xu S, et al.Microsatellite variation and significant population genetic structure of endangered finless porpoises (Neophocaenaphocaenoides) in Chinese coastal waters and the Yangtze River [J]. Mar Biol, 2010, 157(7):1453-1462.

[13] Ma H, Chen S, Yang J, et al. Genetic linkage maps of barfin flounder (Veraspermoseri) and spotted halibut (Veraspervariegatus) based on AFLP and microsatellite markers [J]. Mol Biol Rep, 2011, 38(7): 4749-4764.

[14] 劉云國，劉凌霄，王詠星. 茴魚微衛星標記開發及保護遺傳學研究進展[J]. 水產科學, 2016, 35(1):87-92.

[15] Duan X B, Liu H Y, Xiong F, et al.Development of microsatellite markers forLeptobotiarubrilaris, a threatened fish species in the Yangtze River [J].Conservation Genet Resour, 2013, 5(2):425-427.

[16] Liu H Y, Xiong F, Duan X B, et al.Isolation and characterization of polymorphic microsatellite loci from elongate loach (Leptobotiaelongata), a threatened fish species endemic to the Yangtze River[J]. Conservation Genet Resour, 2012, 4(1):129-131.

[17] Glaubitz J. CONVERT: A user-friendly program to reformat diploid genotypic data for commonly used population genetic software packages [J]. Molecular Ecology Notes, 2004, 4(2): 309-310.

[18] Raymond M,Rousset F. POPGENE (version 1.2), population genetics software for exact test and ecumenicism [J]. Journal of Heredity, 1995, 86(3):248-249.

[19] Excoffier L, Smouse P E, Quattro J M. Analysis of molecular variance inferred from metric distances among DNA haplotypes: application to human mitochondria DNA restriction sites [J]. Genetics, 1992, 131(2):479-491.

[20] Excoffier L, Laval G, Schneider S. Arlequin (version 3.0): an integrated software package for population genetics data analysis [J]. Evol Bioinform Online, 2005(1):47-50.

[21] Rohlf F J. NTSYS-pc numerical taxonomy and multivariate analysis system version 2.1[M]. New York:Department of Ecology and Evolution State University of New York, 2000.

[22] DeWoody J A, Avise J C. Microsatellite variation in marine, freshwater and anadromous fishes compared with other animals [J]. J Fish Biol, 2000, 56(3): 461-473.

[23] Botstein D, White R L, Skolnick M, et al. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms [J]. Am J Human Genet,1980, 32(3):314-331.

[24] 趙程, 梁旭方, 田昌緒, 等. 鱖屬5 種魚類微衛星遺傳多樣性分析[J]. 華中農業大學學報, 2015, 34(5): 76-80.

[25] 徐樹英,張燕, 汪登強, 等. 長江宜賓江段圓口銅魚遺傳多樣性的微衛星分析[J]. 淡水漁業, 2007, 37(3): 76-79.

[26] Wang C Z, Liang H W, Zou G W, et al.Genetic variation analysis of two silver carp populations in the middle and upper Yangtze River by microsatellite [J]. Heredity, 2008, 30(10):1341-1348.

[27] 廖小林.長江流域幾種重要魚類的分子標記篩選開發及群體遺傳分析[D]. 武漢：中國科學院研究生院水生生物研究所, 2006.

[28] 廖小林, 俞小牧, 譚德清, 等. 長江水系草魚遺傳多樣性的微衛星DNA 分析[J]. 水生生物學報, 2005, 29(2):113-119.

[29] 劉紅艷, 陳大慶, 劉紹平, 等. 長江上游中華沙鰍遺傳多樣性研究[J]. 淡水漁業, 2009, 29(3):8-13.

[30] 袁希平, 嚴莉, 徐樹英, 等.長江流域銅魚和圓口銅魚的遺傳多樣性[J]. 中國水產科學, 2008, 15(3): 377-384.

[31] Yan L, Wang D Q, Fang Y L, et al.Genetic diversity in the bronze gudgeon,Coreiusheterodonfrom the Yangtze River system based on mtDNA sequences of the control region [J]. Environ Biol Fish, 2008, 82(1):35-40.

GeneticDiversityinTwoWildPopulationsofRedlipLoachLeptobotiarubrilabris

LIU Hongyan1, XIONG Fei1, DUAN Xinbin2, TIAN Huiwu2, LIU Shaoping2, CHEN Daqing2

( 1. School of Life Sciences, Jianghan University, Wuhan 430056, China; 2.Yangtze River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Wuhan 430223,China )

Genetic diversity and genetic differentiation were investigated by 9 microsatellite loci in two wild populations (Juexi population and Zhuyangxi population) of redlip loachLeptobotiarubrilabrisin the upper reaches of the Yangtze River. A total of 73 alleles was detected, with 55 alleles in Juexi population and 69 alleles in Zhuyangxi population, in which 51 alleles were shared. The average number of alleles in Juexi and Zhuyang were 6.111 and 7.667, average observed heterozygosity 0.665 and 0.668, average expected heterozygosity 0.684 and 0.712, and the average polymorphism information index 0.621 and 0.656. These genetic parameters indicated that there was higher level of genetic diversity in Zhuyangxi than that in Juexi. AMOVA analysis revealed that most of the total variation occurred within populations (98.68%)，a small amount of differentiation among populations (1.32%), without significance in Fst value (0.0132). The Nm value of 9.42 indicated that gene flow between the two sites was frequently. UPGMA clustering revealed that the individuals mixed together. The findings reflected that there was no significant differentiation in populations of redlip loach in the upper reaches of the Yangtze River.

Leptobotiarubrilabris; microsatellite; genetic diversity

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.02.013

2016-04-16；

2016-06-29.

國家自然科學基金資助項目(51109091)；江漢大學出國留學基金資助項目.

劉紅艷(1978-)，女，副教授；研究方向：魚類分子遺傳. E-mail:lhy9603@126.com. 通訊作者： 段辛斌(1972-)，男，副研究員；研究方向：魚類資源學. E-mail: duan@yfi.ac.cn.

S965.199

A

1003-1111(2017)02-0192-05