貴州省3個地理種群大鯢的遺傳多樣性及遺傳結構

吳俁學，謝巧雄，姚俊杰，崔 巍，周紅霞，李曉林

( 1.貴州大學 動物科學學院 水產科學系，高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州省水產技術推廣站，貴州 貴陽 550025 )

貴州省3個地理種群大鯢的遺傳多樣性及遺傳結構

吳俁學1，謝巧雄2，姚俊杰1，崔 巍2，周紅霞1，李曉林1

( 1.貴州大學 動物科學學院 水產科學系，高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州省水產技術推廣站，貴州 貴陽 550025 )

測定了貴州省貴定縣、松桃縣和江口縣共36尾大鯢的mtDNA D-loop區部分序列，探究貴州省內不同地理種群大鯢的遺傳多樣性及遺傳結構。結果顯示，36個序列的堿基平均組成為T(33.8%)、C(22.2%)、A(30.0%)、G(14.0%)，其中T的含量最高，C的含量最低；A+T含量(63.8%)顯著高于G+C含量(36.2%)。江口種群核苷酸多樣性指數為0.00551，貴定種群及松桃種群的核苷酸多樣性指數均為0。3個地理種群相比，江口種群大鯢遺傳多樣性水平較高。3個種群的平均遺傳距離為0.00436，其中貴定種群與江口種群達到了種群的分化水平(P<0.01)。遺傳結構分析結果表明，貴定種群先與松桃種群聚為一支，再與江口種群聚為一支。3個種群大鯢的整體遺傳多樣性水平低，遺傳分化程度也低。

貴州省；大鯢；遺傳多樣性；遺傳結構

大鯢(Andriasdauidianus)曾在中國廣泛分布，主要分布區包括長江、黃河及珠江流域的中上游地區及其支流的山溪河流，遍及華中、華北、華南和西南等17個省市地區[1]。隨著中國大鯢資源銳減，其分布區極大縮小，總體上帶狀和片狀的分布區已不復存在，轉變為不連續的點狀分布格局，大鯢生境島嶼化嚴重[2-3]。中國大鯢的瀕危處境引起了眾多學者的關注。2003年，Peng等[4]對中國大鯢線粒體的基因組進行了測序，確定其長度為16 503 bp。同年，林茂等[5]對廣東珠海某養殖場的大鯢親本及其子二代進行了RAPD分析，親本與子二代的平均遺傳距離分別為0.0497和0.0166，Shannon多樣性指數分別為0.237和0.078，表明子二代遺傳多樣性水平低于親代。2005年，陶峰勇等[6]通過對廣西、湖南、陜西、河南等地的大鯢進行遺傳學研究，測得大鯢的mtDNA D-loop基因全序列長度為771 bp。2006年，方耀林等[7]對漢水流域大鯢的研究顯示，單倍型多樣性指數和核苷酸多樣性指數分別為0.8230和0.00446，結論是該種群大鯢的遺傳多樣性水平低；之后，Murphy等[8]對安徽等地大鯢的mtDNA Cytb和ATP-6基因序列的分析也得到相同結果。2008年，方耀林等[9]對長江中上游和漢水流域野生大鯢馴養群體及其人工繁殖子代mtDNA D-loop區進行了研究，結果顯示野生親本的單倍型多樣性及核苷酸多樣性均略高于子代，子代的遺傳多樣性有所下降。孟彥等[10]發現人工養殖群體存在較大的等位基因丟失現象，且遺傳多樣性水平低于野生群體，也說明人工養殖導致大鯢群體的遺傳多樣性水平下降。2011年，楊麗萍等[11]采用AFLP技術對四川、貴州、湖北、陜西及河南5個野生大鯢種群的遺傳多樣性和遺傳分化水平進行評估，認為中國大鯢遺傳多樣性絕大部分位于種群內，種群間遺傳分化較弱。

貴州是我國大鯢的主要優生區之一，全省各市、州均有大鯢分布。黔東武陵山區曾是中國大鯢的主要產區，各處溪河中經常可見大鯢。1980年以前銅仁市的年捕獲量3000～3500 kg；1986年全區捕獲量僅有1000～1500 kg[12]。由于生態環境的破壞和人為影響，貴州大鯢資源也急劇下降。貴州省開展大鯢的人工養殖二十多年來，在人工繁殖及規模化繁育技術方面取得突破性進展，種群數量也得到一定的恢復。由于對大鯢的遺傳背景缺乏了解，本研究對貴州省江口縣、松桃縣及貴定縣3個地理種群大鯢的遺傳多樣性進行研究，測定和分析線粒體DNA控制區序列，檢測其遺傳多樣性水平，分析其遺傳結構，旨在為貴州大鯢種質資源的保護、種群復壯以及大鯢養殖業發展提供一定的基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料

共采集到野生大鯢36尾，其中來自貴州省貴定縣(N 26°23′34.35″、E 107°18′26.33″)6尾、江口縣(N 27°46′27.51″、E 108°47′20.74″)20尾和松桃縣(N 28°08′35.75″、E 108°52′9.84″)10尾。

采集大鯢新鮮的蛻皮，置于1.5 mL離心管中-20 ℃保存備用。用康為通用型柱式基因組提取試劑盒提取DNA，得到的DNA于-20 ℃保存備用。

1.2 PCR擴增

PCR引物根據大鯢mtDNA控制區(Genbank登錄號：NC-004926)兩端的tRNA基因序列設計，DUP:5′-TTTGGTGCCCTTCTGATT-3′，DDN:5′-CGTTGGGTAGGAAGAGTTATTGT-3′。

PCR反應在PTC-200型PCR儀(TECHNE公司)上進行。反應體系為40 μL：上下游引物各2 μL；模板DNA 4 μL，MIX 20 μL，加無菌去離子水至40 μL。反應程序為：95 ℃預變性3 min；94 ℃變性45 s，56 ℃復性45 s，72 ℃延伸1 min，并進行35個循環；72 ℃延伸10 min。

1.3 目的條帶檢測及測序

PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在DYY-Ⅲ32型平板電泳槽上進行。利用未加模板DNA的反應液作為空白對照，以檢查是否有污染存在。點樣量為5 μL，電壓為100 V，時間35～40 min。PCR所得產物送上海英濰捷基公司進行正反雙向測序。

1.4 數據分析

采用ClustalX軟件將測序結果進行對位排序。用Mega 4.0軟件中的Kimura雙參數法計算各種群間的遺傳距離；并使用鄰近距離法及最大簡約法構建系統進化樹，同時應用自舉檢驗估計系統樹中節點的置信度。用DnaSP軟件計算各地理種群的核苷酸多樣性、單倍型多樣性。

2 結 果

2.1 貴州3個地理種群mtDNA D-loop的序列特征

對貴州36尾大鯢的D-loop區532 bp序列分析顯示，36個序列的堿基組成平均為T(33.8%)、C(22.2%)、A(30.0%)、G(14.0%)，其中T的含量最高，C的含量最低；A+T含量63.8%，顯著高于G+C含量(36.2%)，表現出堿基組成偏向性(表1)。保守位點519個，約占核苷酸總數的97.56%；變異位點12個；簡約信息位點5個；單態突變位點7個；其中轉換位點8個，顛換位點4個，插入或缺失位點2個。

表1 大鯢各群體線粒體D-Loop區堿基組成 %

2.2 貴州3個地理種群mtDNA D-loop的遺傳多樣性

3個種群的總體平均核苷酸多樣性指數為0.00435；單倍型多樣性指數為0.7365(表2)。36尾個體分6種單倍型，3個群體間沒有共享的單倍型，Hap 1、Hap 2、Hap 5、Hap 6為江口種群特有(表3)。其中單倍型頻率最大的是Hap 4，有10個個體，占33.33%，其次是Hap 1，有10個個體，占27.78%。貴州3個地理種群各單倍型的平均遺傳距離為0.00809。

表2 貴州3個地理種群大鯢的核苷酸多樣性、單倍型多樣性和單倍型數

2.3 貴州3個地理種群的遺傳結構

3個種群間的遺傳距離見表4，江口種群與松桃種群間的遺傳距離達到0.00473，貴定種群與江口種群間的遺傳距離達到0.00531，貴定種群與松桃種群間的遺傳距離為0.00189。以隱鰓鯢(Cryptobranchusalleganiensis)的同源序列(GenBank登錄號：AB445803.1)為外群序列，構建了鄰近距離樹(圖1)和最大簡約樹(圖2)。兩圖中各節點的布展值均在50%以上，最高98%。觀察發現，兩圖聚類趨勢一致，Hap 4、Hap 5聚為一支，Hap 1、Hap 2聚為一支，Hap 3與Hap 4、Hap 5的距離較近。對所有36個大鯢個體進行鄰近距離法聚類分析(圖3)，貴定、松桃群體能各自聚為一個群體，江口種群的個體則在各分支都有分布。

表3 各單倍型多態性位點分布及單倍型分布

表4 各種群間遺傳距離

圖1 大鯢單倍型鄰近距離樹以隱鰓鯢(GenBank登錄號：AB445803.1)作外群.

圖2 大鯢單倍型最大簡約樹以隱鰓鯢(GenBank登錄號：AB445803.1)作外群.

圖3 所有個體鄰近距離聚類C(隱鰓鯢，GenBank登錄號：AB445803.1)作外群.

3 討 論

3.1 貴州大鯢mtDNA D-loop區的堿基組成

貴州3個種群共36尾大鯢的線粒體DNA D-loop區的平均堿基組成為T(33.8%)、C(22.2%)、A(30.0%)、G(14.0%)，與脊椎動物mtDNA堿基組成相似[13-14]，體現在(A+T)>(G+C)；其中G含量顯著低于其他堿基含量，表現出明顯的反G偏倚，體現了線粒體DNA的堿基組成特點[15]。兩棲類線粒體DNA D-loop區已有的研究結果顯示，掛榜山小鯢(Hynobiusguabangshanensis)G+C(33.4%)[16]、新疆北鯢(Ranodonsibiricus)G+C(33.4%)[17]、尾斑瘰螈(Paramesotritoncaudopunclatus)G+C(36.4%)[18]、貴州疣螈(Tylototritonkweichowensis)G+C(37.9%)[19]，本試驗所測的貴州大鯢線粒體DNA D-loop區G+C含量是36.2%，高于小鯢科的小鯢和新疆北鯢，略低于蠑螈科的尾斑瘰螈和疣螈，但大致符合兩棲類線粒體DNA D-loop序列的堿基組成特點。

貴州大鯢的堿基組成中，G+C(36.2%)含量比漢水流域大鯢(35.2%)高[7]，這可能與所分析的D-loop區的片段長度有關，本研究分析了大鯢D-loop區的532 bp序列，另一研究中則分析了漢水流域大鯢D-loop區的757 bp序列。除此之外，堿基的替換和變異速率也會影響堿基組成的分析。

3.2 貴州3個種群大鯢的遺傳多樣性

已有對長江流域、黃河流域、珠江流域和漢水流域大鯢種群的研究表明，遺傳多樣性均處于較低水平[6-7]。本研究中貴州省3個地理種群大鯢整體遺傳多樣性(核昔酸多樣性=0.00435，具6種單倍型)也處于較低水平相比，只是相對來說江口種群大鯢的遺傳多樣性較豐富(核昔酸多樣性=0.00551，具6種單倍型)，貴定和松桃種群大鯢的遺傳多樣性則極度貧乏(核昔酸多樣性=0，只1種單倍型)。而楊麗萍等[10]采用AFLP標記對四川、貴州、湖北、陜西及河南5個野生大鯢種群的遺傳多樣性和遺傳分化水平進行的評估顯示大鯢的遺傳多樣性高，孟彥等[10,21]采用微衛星技術對不同群體大鯢的分析顯示其遺傳多樣性比較豐富。這與所用的遺傳多樣性分析方法及分析的DNA片段有一定關系，AFLP標記可獲得豐富的多態位點[21]，微衛星標記同樣具有較豐富的多態性[20]，且其研究分析的是大鯢整個基因組，本研究則只對mtDNA D-loop區進行分析，所獲的多樣性信息含量相對少很多。大鯢是兩棲類動物，其線粒體DNA為母性遺傳。相對來說，線粒體DNA呈母系遺傳，幾乎無重組，比核基因有更高的變異[22]，較二者更適合作為大鯢遺傳多樣性分析的標記。而D-loop區為非編碼區，保留突變的可能性大，且是mtDNA中進化速率最快的區域[23]，適合種以下遺傳多樣性的研究。mtDNA D-loop區作為遺傳學分子標記已廣泛應用于研究許多物種的遺傳管理、瀕危物種的保護、種群結構和進化史等方面。

另一方面，研究的樣品數量也可能影響分析的結果，本研究中貴定種群與松桃種群的樣本量不到江口種群的一半。目前貴州境內能找到純種野生大鯢的地方少之又少，有條件應增加研究對象，更進一步地探究貴州大鯢的遺傳多樣性。

3.3 貴州3個種群大鯢的遺傳分化及遺傳結構

根據Shaklee等[24]提出的屬、種和種群三級水平上的遺傳距離分別為0.90、0.30及0.05的分類依據，本研究中3個大鯢種群間均未達到種群分化的水平。貴州3個種群的6種單倍型間的平均遺傳距離為0.00809(P<0.01)，也說明3個種群間的遺傳分化程度低。貴州省這3個種群的親緣關系表現為貴定種群先與松桃種群聚為一支，然后再與江口種群聚為一支。對所有個體的鄰近距離聚類結果同樣顯示貴定種群與松桃種群親緣關系較近，與江口種群的親緣關系較遠。對3個種群間遺傳距離的分析也得出相同結論。

貴州3個種群的地理分布中，江口種群與松桃種群較近，與貴定種群較遠。分析結果卻出現了地理位置近，遺傳距離相對卻遠的情況，且地理位置較遠的松桃種群和貴定種群親緣關系卻較近。大鯢對水的依賴性強，而2006年貴州省貴定縣巖下大鯢資源的調查顯示，巖下野生大鯢種群棲息地已經由地下(洞穴)與地面水域廣布縮小到以地下水域為主[25]。貴州獨特的喀斯特地形對省內不同地域的大鯢種群形成了小范圍的地理隔離，使江口種群與松桃種群形成實際上的空間隔離，而貴定種群與松桃種群可能通過地下暗河還有一定基因交流。另一方面，在長期的進化過程中，3個種群的大鯢種群分化受遺傳多樣性影響，江口種群因遺傳多樣性較豐富，使其積累了一定的分化水平，而貴定種群和松桃種群低水平的遺傳多樣性也限制了2個種群分化可能，親緣關系也就相對較近。

[1] 葉昌媛. 中國珍稀及經濟兩棲動物[M]. 成都：四川科學技術出版社, 1993.

[2] 章克家, 王小明, 吳巍,等. 大鯢保護生物學及其研究進展[J]. 生物多樣性, 2002(3):291-297.

[3] 羅慶華, 劉英, 張立云,等. 湖南張家界市大鯢資源調查[J]. 四川動物, 2009, 28(3):422-426.

[4] Peng Z, Chen Y Q, Liu Y F, et al. The complete mitochondrial genome of the Chinese giant salamander,Andriasdavidianus(Amphibia: Caudata)[J]. Gene,2003,311(1):93-98.

[5] 林茂, 黃景, 李正,等. 大鯢野生親代與人工繁育子二代的隨機擴增多態DNA分析[J]. 上海水產大學學報, 2003，12(增刊):20-23.

[6] 陶峰勇, 王小明, 鄭合勛,等. 中國大鯢四種群的遺傳結構和地理分化[J]. 動物學研究, 2005, 26(2):162-167.

[7] 方耀林, 張燕, 楊焱清,等. 大鯢遺傳多樣性分析[J]. 淡水漁業, 2006, 36(6):8-11.

[8] Murphy R W, Fu J Z, Upton D E. Genetic variability among endangered Chinese giant salamander，Andriasdavidianus[J].Mol Ecol, 2000, 9(10):1539-1547.

[9] 方耀林, 張燕, 肖漢兵,等. 野生大鯢及其人工繁殖后代的遺傳多樣性分析[J]. 水生生物學報, 2008, 32(5):783-786.

[10] 孟彥, 楊焱清, 張燕,等. 野生和養殖大鯢群體遺傳多樣性的微衛星分析[J]. 生物多樣性, 2008, 16(6):533-538.

[11] 楊麗萍, 蒙子寧, 劉曉春,等. 中國大鯢5個野生種群的AFLP分析[J]. 中山大學學報：自然科學版, 2011, 50(2):99-104.

[12] 陳廣城. 黔東武陵山區大鯢的資源現狀[J]. 淡水漁業, 1988(1):33-33.

[13] Broughton R E, Milam J E, Roe B A. The complete sequence of the zebrafish (Daniorerio) mitochondrial genome and evolutionary patterns in vertebrate mitochondrial DNA[J]. Genome Research, 2001, 11(11):1958- 1967.

[14] 馮慧, 黃原, 任軼,等. 陜西省林麝mtDNA D-loop區序列結構和種群遺傳多樣性[J]. 生態學報, 2014, 34(20):5887-5895.

[15] Wolstenholme D R. Animal mitochondrial DNA: structure and evolution[J]. International Review of Cytology, 1992, 141(6):173-216.

[16] 任巍, 牛艷東, 周毅,等. 掛榜山小鯢線粒體DNA COⅠ基因及D-loop區序列研究[J]. 生命科學研究, 2010(4):327-330.

[17] 袁亮, 李偉業, 葉小芳,等. 基于線粒體DNA控制區的新疆北鯢種群遺傳多樣性分析[J]. 廈門大學學報：自然科學版, 2015, 54(2):194-198.

[18] 陳光照, 肖羽, 陳學平,等. 尾斑瘰螈種群的D-loop區遺傳多樣性分析[J]. 動物學雜志, 2011, 46(3):55-63.

[19] 肖羽, 陳光照, 谷曉明. 貴州疣螈D-loop區和tRNAPhe序列變異及群體遺傳多樣性[J]. 動物學雜志, 2010, 45(3):21-29.

[20] 郭文韜. 大鯢遺傳多樣性及皮膚附屬物特性研究[D]. 武漢：華中科技大學, 2013.

[21] Prior K A, Gibbs H L, Weatherhead P J. Population genetic structure in the black rat snake: implications for management[J]. Conservation Biology, 1997, 11(5):1147-1158.

[22] Cann R L, Brown W M, Wilson A C. Polymorphic sites and the mechanism of evolution in human mitochondrial DNA[J]. Genetics, 1984, 106(3):479-499.

[23] Sbisà E, Tanzariello F, Reyes A, et al. Mammalian mitochondrial D-loop region structural analysis: identification of new conserved sequences and their functional and evolutionary implications[J]. Gene, 1997, 205(1/2):209.

[24] Shaklee J B, Tamaru C S, Waples R S. Speciation and evolution of marine fishes studied by the electrophoretic analysis of proteins[J]. Pacificence, 1982, 36(2):141-157.

[25] 粟海軍, 喻理飛, 馬建章. 貴州巖下自然保護區的野生大鯢資源現狀及歷史動態[J]. 長江流域資源與環境, 2009, 18(7):652-657.

GeneticDiversityandGeneticStructureofGiantSalamanderfromThreeGeographicalPopulationsinGuizhouProvince

WU Yuxue1, XIE Qiaoxiong2, YAO Junjie1, CUI Wei2, ZHOU Hongxia1, LI Xiaolin1

( 1.Breeding and Reproduction in the Plateau Mountainous Region, Ministry of Education, Key Laboratory of Animal Genetics, Department of Aquatic Science, Guizhou University,Guiyang 550025,China；2.Aquaculture Technology Extending Stations in Guizhou Province,Guiyang 550025,China )

A research on mtDNA D-loop region partial sequence was studied in 36 giant salamandersAndriasdaudianussamples collected from Guiding county, Songtao county and Jiangkou county in Guizhou province. The results showed that the average contents of the four bases were 33.8% in T，22.2% in C，30.0% in A and G in 14.0%， with the maximal T content, and the minimal C content; A+T content was 63.8%, significantly higher than that in G+C content (36.2%). The nucleotide diversity(π) of the Jiangkou populations were 0.00551, and the nucleotide diversity(π) of the Guiding and Songtao population was 0. Compared with the three geographical populations, the genetic diversity level of giant salamander in Jiangkou county population was higher. The average genetic distance of three populations was 0.00436, and the Guiding and the Jiangkou population reached the population differentiation level(P<0.01). Analysis of the genetic structure indicated that Guiding and Songtao populations were clustered for first, and then clustered with Jiangkou popultion. The overall genetic diversity of these populations of giant salamander was low, and the genetic differentiation of these populations was low.

Guizhou province;Andriasdaudianus; genetic diversity; genetic structure

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.02.016

2016-03-31；

2016-06-29.

貴州省農委資助項目(黔財農【2014】233)；貴州省水產養殖特色專業項目(80113610201)；貴州大學創新基金資助項目(研農2016023).

吳俁學(1992-)，男，碩士研究生；研究方向：水生動物繁殖與發育生物學. E-mail：745893505@qq.com. 通訊作者： 姚俊杰(1968-)，男，教授，博士，碩士生導師；研究方向：水生動物繁殖與發育生物學. E-mail：junjieyao@163.com.

S917.4

A

1003-1111(2017)02-0207-05