大黃魚腐敗菌的低溫致腐性及相互作用

張 雯， 卞 丹， 楊冬英， 方慧萍， 倪 莉

(福州大學食品科學技術研究所， 福建省食品生物技術創新工程技術研究中心， 福建 福州 350116)

大黃魚腐敗菌的低溫致腐性及相互作用

張 雯， 卞 丹， 楊冬英， 方慧萍， 倪 莉

(福州大學食品科學技術研究所， 福建省食品生物技術創新工程技術研究中心， 福建 福州 350116)

以揮發性鹽基氮、 三甲胺和氣味指紋圖譜為表征， 探討腐敗希瓦氏菌(S.putrefaciens)、 靜止嗜冷桿菌(P.immobilis)和熒光假單胞菌(P.fluorescens)在低溫下對魚肉的腐敗性以及混合菌群在致腐過程中的相互作用. 研究結果表明， 腐敗希瓦氏菌具有較強的產揮發性鹽基氮特性， 主導腐臭氣味； 熒光假單胞菌具有類似的腐敗趨勢， 但腐敗性較腐敗希瓦氏菌弱； 靜止嗜冷桿菌不具有顯著的產揮發性鹽基氮等特性， 但能產生更為復雜的氣味； 熒光假單胞菌和靜止嗜冷桿菌在腐敗初期對腐敗希瓦氏菌的腐敗趨勢有抑制作用.

腐敗菌； 腐敗希瓦氏菌； 靜止嗜冷桿菌； 熒光假單胞菌； 致腐性； 大黃魚

大黃魚(Pseudosciaenacrocea)是福建省重要的海水養殖魚類， 養殖產量占全國總產量八成以上[1]. 其中， 90%大黃魚是以冰鮮方式銷售， 因此， 保持魚的新鮮度是大黃魚銷售的重要環節. 研究結果證實大黃魚的變質與細菌菌相的變化有關， 腐敗希瓦氏菌和假單胞菌是其重要的腐敗菌[2-5]. 本研究采用氣相色譜(GC)和氣相色譜-嗅覺測量法(GC-O)結合主成分分析， 探討希瓦氏菌、 假單胞菌和冰鮮魚體常見的嗜冷桿菌對冰鮮大黃魚的致腐特性以及三者之間的相互作用關系.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

腐敗希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)A菌株， K菌株， O菌株； 熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)N菌株， 靜止嗜冷桿菌(Psychrobacterimmobilis)C菌株. 以上菌株經16S rDNA和脂肪酸鑒定后， 置于30%的滅菌甘油中于-80 ℃條件下貯藏.

1.1.2 主要培養基及制備

牛肉膏蛋白胨培養基： 蛋白胨10 g， 牛肉膏3 g， 氯化鈉5 g， 定容至1 000 mL， pH值為7.2～7.4， 121 ℃高壓滅菌20 min.

1.2 方法

1.2.1 無菌魚肉的制備

新1鮮大黃魚清洗后， 去鱗、 鰭及內臟， 無菌水洗凈后， 于超凈臺內用吸水紙將水吸干， 用解剖刀切取背脊處魚肉， 去皮， 取大小厚薄相等的魚塊， 每塊約5 g. 將魚塊表面用酒精棉擦拭， 經紫外線照射10 min.

1.2.2 接菌貯藏與鮮度動態分析

將供試菌株接菌于牛肉膏蛋白胨液體培養基擴大培養24 h后， 取適量發酵液， 加入無菌水稀釋配制成106CFU·mL-1菌懸液. 將無菌魚塊浸泡于菌懸液中約20 s后移至無菌培養皿中， 4 ℃貯藏， 以不接菌的無菌魚塊為對照， 跟蹤測定魚肉中揮發性鹽基氮和三甲胺含量， 測定其鮮度變化.

1.2.3 鮮度測定

1) 揮發性鹽基氮(TVBN)測定. 參考水產行業標準《水產品中揮發性鹽基氮的測定(SC/T 3032-2007)》[6].

2) 三甲胺氣相色譜測定. 取40 g魚肉樣品均質， 用50 mL 10%三氯乙酸溶液(體積分數， 下同)， 超聲波振蕩浸提1 h后過濾， 濾渣再用50 mL 10%三氯乙酸溶液提取， 合并2次濾液， 用10%三氯乙酸溶液定容至100 mL. 取該提取液4 mL于10 mL的具塞試管中， 加入1 mL的正庚烷， 2 mL 50%的KOH ， 迅速塞住， 60 ℃下恒溫水浴6 min， 劇烈震蕩2 min后靜置10 min， 取上層清液10 μL進樣測定. 采用SE-30色譜柱； 柱溫為50 ℃； 載氣為N2(入口壓=0.3 MPa)； 檢測器為氫火焰離子化檢測器. 以標準鹽酸標定過的三甲胺水溶液制備標準曲線.

1.2.4 魚樣揮發性氣味的測定

1) 樣品前處理. 預先準備好NaCl飽和溶液， 稱取2 g 魚肉樣品(參照1.2.1， 鮮魚樣品無需酒精滅菌； 接菌樣品采用106CFU·mL-1的菌懸液進行接菌， 在低溫培養箱中4 ℃培養)， 放入規格為15 mL的萃取瓶中， 加入5 mL的NaCl飽和溶液， 密封， 置于60 ℃水浴中， 磁力攪拌， 平衡5 min后， 采用PDMS-DVB兩相萃取頭， 萃取時間為30 min， GC解析時間3 min.

2) 色譜條件. 采用石英毛細管色譜柱(Agilent HP-INNOWax， 30 mm×0.32 mm×0.25 μm)； 程序升溫條件： 初始溫度40 ℃， 保持5 min， 以5 ℃·min-1升溫至240 ℃， 保持5 min； 檢測器溫度： 300 ℃； 進樣口溫度： 250 ℃； 分流進樣： 分流比1∶1； 載氣： N2； 載氣流速： 1 mL·min-1； 部分載氣進入FID檢測器， 部分進入嗅聞裝置(ODP).

3) 氣相色譜-嗅覺測量法(GC-O). 利用氣相色譜-嗅覺測量法檢測氣味特征時， 嗅聞人員熟悉魚樣和氣味詞匯. 進行嗅聞時， 記錄嗅到香氣時的保留時間以及氣味類型. 為避免嗅聞人員產生嗅覺疲勞， 每人每次檢測不超過10 min； 為減少主觀偏差， 每個樣品需要三個嗅聞人員檢測. 不同人員對同一個樣品在相同時間出現的氣味可能出現不同的描述. 嗅聞小組通過討論， 篩選和確定最終詞匯和相應描述， 如表1所示.

表1 氣味感官詞及其描述Tab.1 Smell sensory words and the descriptions

數據分析采用Mintab 17對接菌不同菌株的魚肉GC數據和GC-O數據進行主成分(PCA)分析， 判斷不同菌株的致腐特征或魚肉樣品的鮮度.

2 結果與分析

2.1 魚肉腐敗菌的致腐性

腐敗希瓦氏菌A產揮發性鹽基氮的能力最強， 腐敗希瓦氏菌K和O及熒光假單胞桿菌N產揮發性鹽基氮的能力中等， 靜止嗜冷桿菌C表現微弱， 見圖1. 熒光假單胞桿菌N接菌魚肉后期有很強的產三甲胺能力， 腐敗希瓦氏菌A在接菌魚肉前期(3 d內)較快產生三甲胺， 而腐敗希瓦氏菌O和K在接菌魚肉后期具有較強的產三甲胺能力， 靜止嗜冷桿菌C在培養前期產少量三甲胺， 見圖2.

圖1 接菌魚肉揮發性鹽基氮的變化Fig.1 Changes in TVBN value of fish inoculated with spoilage bacteria

圖2 接菌魚肉產三甲胺測定Fig.2 Changes in TMA value of fish inoculated with spoilage bacteria

檢測結果表明, 腐敗希瓦氏菌和熒光假單胞桿菌是大黃魚的重要腐敗菌， 不同菌株對魚肉的致腐性表現出一定差異. 腐敗希瓦氏菌A的致腐性最強， 表現為產揮發性鹽基氮和三甲胺的能力強； 熒光假單胞桿菌N和腐敗希瓦氏菌O和K致腐性強， 表現為接菌魚肉后期較強的產三甲胺能力； 靜止嗜冷桿菌C致腐性弱， 產揮發性鹽基氮和三甲胺能力差.

2.2 魚體腐變的氣味分析

新鮮魚肉分為6個處理組， 單獨接菌3組： 腐敗希瓦氏K、 熒光假單胞菌N、 靜止嗜冷桿菌C； 混菌兩兩接菌3組： 希瓦氏菌K和假單胞菌N、 希瓦氏菌K和嗜冷桿菌C、 假單胞菌N和嗜冷桿菌C； 并以不接菌細菌的魚肉為對照. 將各處理組樣品放置4 ℃貯藏， 于0、 3、 6、 9 d取樣進行氣相色譜-嗅覺測量法(GC-O)檢測和氣相色譜(GC)檢測分析， 查明大黃魚魚肉腐變過程產生的氣味類型和不同細菌引起魚肉腐敗過程產生的氣味特征.

2.2.1 氣相色譜-嗅覺測量法(GC-O)檢測結果

GC-O檢測和PCA法分析結果見圖3～5. 不同處理組的魚肉樣品在腐變過程中產生的特征氣味有明顯差異.

新鮮魚肉自然特征氣味是咸味和腥味(海水魚特有風味)； 未接菌魚肉在貯藏3 d后， 特征氣味為酒味、 米味和腐爛味， 貯藏6 d和9 d特征氣味是牛肉膏培養基味和尿騷味， 見圖3(a). 與接菌樣品相比較， 未接菌貯藏3、 6、 9 d的樣品所產生的氣味類別較為集中， 氣味變化較小， 見圖4.

接菌腐敗希瓦氏菌K菌株后第3天和第6天的樣品產生的特征氣味為酸臭、 悶臭； 第9天樣品特征氣味為臭雞蛋氣味和腐爛味， 見圖3(b). PCA分析顯示接菌腐敗希瓦氏菌K菌株的魚肉在第3天與第6天氣味類型接近， 說明希瓦氏菌致腐性強， 加速了魚肉腐敗進程.

接菌熒光假單胞菌N菌株的魚肉貯藏3 d的特征氣味為牛肉膏培養基氣味， 貯藏6 d產生酸臭和草本味， 第9天的特征氣味為臭雞蛋氣味、 腐爛味， 見圖3(c). PCA分析顯示接菌熒光假單胞菌N菌株的魚肉貯藏3、 6和9 d產生的氣味被分在了兩個不同象限， 說明與無接菌魚肉相比， 熒光假單胞菌加速了魚肉腐敗的進程.

接菌嗜冷桿菌C后0和3 d的樣品特征氣味與新鮮魚肉相同， 具有咸味和腥味； 6 d樣品特征氣味為悶臭、 米味和生青； 第9天樣品產生復雜氣味， 有牛肉膏培養基氣味、 菠蘿氣味、 腐爛氣味、 酒味和臭雞蛋氣味， 以酒味和腐爛味最為突出， 見圖3(d). PCA分析顯示接菌嗜冷桿菌C 菌株的魚肉貯藏期產生的氣味分布在3個不同象限， 氣味種類復雜而特征性氣味不明顯， 表明該菌株的致腐性弱， 魚肉腐變進程緩慢.

將各菌產生的特征氣味綜合比較， 具體見圖4～5， 分析氣味特征變化的規律與致腐差異. 氣味的變化趨勢如箭號所示： 盡管未接菌魚肉在貯藏過程中發生氣味變化， 但相對而言， 氣味變化較小， 始終趨于同一個象限； 由腐敗希瓦氏菌(6 d和9 d)和熒光假單胞菌(9 d)在腐敗的后期將主導氣味特征， 且雖二者都能加速魚肉腐敗的進程， 但與希瓦氏菌相比較, 熒光假單胞菌致腐性較弱； 嗜冷桿菌致腐性弱， 貯藏后期產生的特征氣味與另外二菌差異顯著.

圖3 接菌不同菌株的魚肉樣品4 ℃貯藏氣味變化PCA分析圖Fig.3 PCA of smell changes about fish inoculated with different strains

圖4 腐敗菌引起大黃魚肉腐變氣味變化趨勢PCA分析Fig.4 Smell changes trends about fish inoculated with spoilage bacteria analyzed by PCA

圖5 各腐敗菌引起大黃魚腐變氣味載荷圖Fig.5 PCA loading plot of smell changes about fish inoculated with spoilage bacteria

2.2.2 氣相色譜檢測分析

大黃魚魚體的自然菌群是由多種細菌組成的混合菌群. 為明確各種細菌在致腐過程中的相互影響， 利用氣相色譜(GC)分析混合菌株和單菌株接菌魚肉樣本不同時期產生的氣味特征. 采用PCA法對GC數據進行分析， 判別樣品鮮度和菌株的致腐能力， 見圖6.

1) 希瓦氏菌K和假單胞菌N混合接菌魚肉貯藏3 d時， 以希瓦氏菌K為主導腐敗能力增強； 貯藏6 d時， 假單胞菌N占優勢， 混合菌株樣品與假單胞菌N樣品接近； 貯藏9 d時， 混合菌株樣品氣味特征進入希瓦氏菌K所在象限， 致腐性以希瓦氏菌K為主導， 見圖6(a).

2) 希瓦氏菌K和嗜冷桿菌C混合接菌魚肉貯藏3 d時， 以希瓦氏菌K為主導其致腐能力稍有增強； 貯藏6 d時， 混合菌株樣品與嗜冷桿菌C樣品接近、 分布于同一象限， 希瓦氏菌K菌株的致腐性受嗜冷桿菌C菌株的抑制； 貯藏9 d時， 混合菌株樣品氣味特征進入希瓦氏菌K所在象限， 致腐性以希瓦氏菌K為主， 見圖6(b).

3) 當假單胞菌N和嗜冷桿菌C混合接菌魚肉貯藏3 d時， 致腐性強于單菌株接菌樣本； 貯藏6 d和9 d時假單胞菌N菌株的致腐性受嗜冷桿菌C的抑制， 這2個時期混合菌株樣品產生的氣味特征接近嗜冷桿菌C貯藏第6天時氣味特征， 腐變進程變緩慢， 見圖6(c).

4) 3株菌混合接菌魚肉加速魚肉腐敗進程， 貯藏3 d的魚肉腐變水平已接近希瓦氏菌K第6天， 混合接菌魚肉樣品貯藏9 d時的氣味特征進入希瓦氏菌K所在象限， 見圖6(d).

綜上所述， 希瓦氏菌K的致腐性最強、 并主導最終特征氣味， 假單胞菌N菌株致腐性中等， 嗜冷桿菌C菌株致腐性弱. 混合菌株接菌魚肉時， 前期有增強致腐性的趨勢， 中期弱致腐菌對強致腐菌有一定的制約作用， 后期魚肉腐敗菌以強致腐菌占優勢.

圖6 希瓦氏菌K、 假單胞菌N與嗜冷桿菌C混合接菌時致腐互作關系GC數據主成分分析Fig.6 PCA of interaction of S. putrefaciens, P. fluorescens and P. immobilis about spoilage ability by GC analysis

3 總結與討論

3.1 大黃魚腐敗細菌的致腐性分析

以產揮發性鹽基氮和三甲胺的能力為指標， 分析比較各種腐敗菌的致腐性. 檢測結果表明, 腐敗希瓦氏菌(S.putrefaciens)菌株A致腐性強， 表現在產揮發性鹽基氮和三甲胺的能力強； 熒光假單胞菌(P.fluorescens)菌株N和腐敗希瓦氏菌O和K菌株致腐性中等， 在接菌魚肉中后期有較強的產三甲胺能力； 靜止嗜冷桿菌(P.immobilis)菌株C的致腐性弱， 產揮發性鹽基氮和三甲胺能力差.

利用氣相色譜GC和PCA分析， 探討混合菌群中各種細菌在致腐過程中的相互影響. 混合菌株接菌魚肉時， 菌株間的相互作用表現為： 前期有增強致腐性的趨勢， 中期弱致腐菌對強致腐菌有一定的制約作用， 后期以強致腐菌占優勢. 本研究的混合菌接菌魚肉時， 魚肉腐變中期假單胞菌和嗜冷桿菌對腐敗希瓦氏菌的致腐性有一定的制約作用， 這種制約作用可能是由于菌株間空間競爭和營養競爭造成. 據報道在假單胞菌與希瓦氏菌的混合菌群中， 當具產鐵載體的假單胞菌達到108CFU·mL-1時， 腐敗希瓦氏菌受抑制[7]， 在假單胞菌占優勢的菌相中， 腐敗希瓦氏菌被檢出量少[8].

3.2 GC-O用于大黃魚鮮度評價及腐敗菌種類辨別

利用氣相色譜-嗅覺測量法(GC-O)檢測結合PCA分析區分大黃魚鮮度. 大黃魚魚肉在貯藏過程中產生的特征性氣味分為三類： 第一類是鮮魚階段， 其氣味為新鮮魚肉的自然本體味， 咸味和腥味； 第二類是魚肉腐敗始期和擴展階段， 產生非刺激性的氣味特征， 如香甜味、 米味、 酸臭、 悶臭、 酒味、 腐爛味、 牛肉膏培養基味； 第三類是腐敗終結階段， 產生刺激性的氣味特征， 如臭雞蛋氣味、 腐爛味， 另外還包含了菠蘿、 草本等氣味.

分析各菌氣味特征變化的規律與致腐差異. 無接菌魚肉在貯藏過程中發生氣味變化較小； 腐敗希瓦氏菌和熒光假單胞菌在腐敗后期將主導氣味特征， 二者都能加速魚肉腐敗的進程， 但與希瓦氏菌相比較熒光假單胞菌致腐性較弱； 嗜冷桿菌產生腐敗性氣味弱， 但能產生更為復雜的氣味.

利用GC-O分析得到不同菌株對風味產生不同的貢獻. 對風味的研究采用質譜或電子鼻分析， 無法得到氣味的信息， 此研究體現出GC-O的特色. 采用GC-O和主成分分析， 對數據挖掘能起到很好的作用.

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Spoilageabilityandinteractionsbetweenspoilagebacteriaisolatedfromlargeyellowcroakerinlowtemperature

ZHANG Wen， BIAN Dan， YANG Dongying， FANG Huiping， NI Li

(Institute of Food Science and Technology， Fujian Center of Excellence for Food Biotechnology，Fuzhou University， Fuzhou， Fujian 350116, China)

Total volatile basic nitrogen (TVBN), trimethylamine (TMA) and GC-O fingerprint were used for characterization the spoilage ability aboutS.putrefaciens,P.immobilisandP.fluorescensin low temperature and reveal the interaction between mixed bacteria. The research results showed thatS.putrefacienswas with strong volatile nitrogen production ability and dominate the putrid odor.P.fluorescenshad a similar trend of spoilage with weaker spoilage ability thanS.putrefaciens.P.immobiliswas with the weakest volatile nitrogen production ability, but it could produce more complex smell.P.fluorescensandP.immobilisinhibited the spoilage in the early storage time.

spoilage bacteria；S.putrefaciens；P.immobilis；P.fluorescens； spoilage ability；Pseudosciaenacrocea

10.7631/issn.1000-2243.2017.05.0748

1000-2243(2017)05-0748-06

S983

A

2016-04-19

張雯(1980-)， 女， 博士， 副教授， 從事食品微生物方面的研究， zhangwen@fzu.edu.cn

福建省自然科學基金資助項目(2016J01156)； 國家自然科學基金青年科學基金資助項目(31601532)； 福州市科技局院校合作資助項目(2016-G-75)

(責任編輯： 蔣培玉)