基于“毒-效整合分析思路”探討有毒中藥附子的物質基礎

熊 亮 彭 成 繆璐琳 何育霖 蒙春旺 蘇海國

(成都中醫藥大學藥學院,中藥材標準化教育部重點實驗室,中藥資源系統研究與開發利用省部共建國家重點實驗室培育基地,成都,611137)

基于“毒-效整合分析思路”探討有毒中藥附子的物質基礎

熊 亮 彭 成 繆璐琳 何育霖 蒙春旺 蘇海國

(成都中醫藥大學藥學院,中藥材標準化教育部重點實驗室,中藥資源系統研究與開發利用省部共建國家重點實驗室培育基地,成都,611137)

中藥的毒與效是客觀存在的,尤其在藥效顯著的大毒中藥中,毒和效既是矛盾的,又是統一的。毒與效的物質基礎往往不是孤立的,而是相互影響和相互轉化的。附子是著名的有毒中藥,不僅藥效顯著,而且毒性明顯,一直是研究熱點。雖然目前已從附子中獲得90余個化學成分,但附子起效和致毒的根本原因仍然有待進一步揭示。其問題的復雜性在于:附子的毒與效在不同條件下可以相互轉化,例如附子既可以強心,也可以導致心臟毒性;既有鎮痛效果,又會產生神經毒性。而且同一組分、成分在不同條件下,可能發揮完全不同的生物學效應。導致這種現象的原因包括劑量因素、模型因素、炮制因素、配伍因素、使用方法因素、代謝因素等。本文將結合課題組近年來對附子的研究結果以及文獻報道,從附子化學成分、附子化學成分的藥效和毒理、附子毒-效作用的轉化方面進行毒-效整合分析,探討附子的物質基礎。

附子;物質基礎;毒效整合分析;化學成分;毒-效轉化

附子為毛茛科烏頭屬植物烏頭(AconitumcarmichaeliiDebx.)子根的加工品,辛、甘,大熱,有毒;具有回陽救逆,補火助陽,散寒止痛功效;用于亡陽虛脫,肢冷脈微,心、脾、腎陽不足,胸痹心痛,寒濕痹痛。附子作為回陽救逆第一要藥,一直都是大家研究的熱點。雖然毒性大,但療效卓著,是臨床常用的中藥,歷代本草和歷版《中華人民共和國藥典》都將其收錄。附子中既存在藥效成分,又存在毒性成分,但長期以來大家一致認可,附子的藥效成分也是其毒性成分,而且它們隨著成分轉化、炮制加工、劑量變化、配伍使用會發生多種“毒—效”轉化[1]。一般認為,附子中的雙酯型二萜生物堿是附子毒性極強的特征性物質,可引起心臟急性毒性、神經毒性、生殖毒性等[2-3],但現代研究也表明,它們在低濃度條件下又可以發揮藥效。附子的不同炮制方法和煎煮方式均可以達到減毒增效的作用,雙酯型生物堿迅速水解,單酯型和無酯型生物堿則逐漸增加。此外,劑量的變化、配伍使用均會使附子呈現出不同的生物學效應。本文將結合本課題組近年來對附子的研究結果以及文獻報道,從附子化學成分、附子化學成分的藥效和毒理、附子毒-效作用的轉化方面進行整合分析,探討附子的物質基礎。

1 附子的化學成分研究

生物堿是目前附子中研究最多的化學成分,也是附子中較為特征的成分,主要包括C19型二萜生物堿類、C20型二萜生物堿類、酰胺類、季銨鹽類、阿樸啡類等[4]。目前,以C19型二萜生物堿數量最多,也一直被認為是附子的有效成分和毒性成分?！吨腥A人民共和國藥典》2015版規定了6種C19型二萜生物堿的檢查和含量測定,分別為烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭堿和苯甲酰新烏頭堿。本文將結合本課題組研究及文獻報道對附子化學成分進行介紹。

1.1 C19型二萜生物堿 附子中的C19型二萜生物堿多以烏頭堿(aconitine)骨架為主,在C1、C6、C8、C14、C16、C18位通常有含氧基團取代,取代基以羥基和甲氧基為主,少數時候有羰基、亞甲二氧基、環氧醚基等。其中C-8和C-14的羥基多與乙酸或苯甲酸成酯,根據酯鍵的多少又可進一步將烏頭堿型生物堿為無酯型、單酯型、雙酯型3種,現代藥理研究表明,其酯鍵的數量與化合物毒性密切相關,雙酯型烏頭堿的毒性最強,而無酯型烏頭堿的毒性較弱。目前共從附子中分離得到C19型二萜生物堿50個(見表1)。

目前從附子中分離得到了16個無酯型C19二萜生物堿(圖1,1-16),所有化合物的C-1均被含氧基團取代,且均為α型;C-16均被β型的甲氧基或羥基取代;C-6通常被α型含氧基團取代。化合物13-16為我國學者石建功從附子中首次發現的二萜生物堿阿拉伯糖苷類,在此之前,尚未報道附子中含有二萜生物堿苷[21]。

相對于無酯型和雙酯型,附子中單酯型生物堿的報道較多。目前,已報道的附子單酯型C19二萜生物堿約20個(圖2,17-36),此類生物堿14α-OH均被酯化,多數情況下為苯甲?；?Bz),少數為乙酰基(Ac)(17,21,36)或桂皮酰基(Cn)(20)。相反,8β-OH均未被酯化,部分化合物以8β-O-醚的形式存在,如8β-OMe(23,26,27,31,32,34,35)和8β-OEt(24)。此外,在C-1、C-3、C-6、C-10、C-13、C-15、C-16和C-18通常取代含氧基團(OH或OMe),且空間構型分別為1α,3α,6α,10β,13β,15α和16β。其中以C-1、C-16和C-18的含氧取代最常見,所有化合物均含有1α-OH(OMe)和16β-OMe。除化合物17和36以外,其他化合物均在C-18位取代OMe。

圖1 從附子中獲得的無酯型C19二萜生物堿成分

圖2 從附子中獲得的單酯型C19二萜生物堿成分

雙酯型二萜生物堿為常見有機酸與8β-OH和14α-OH同時酯化形成,毒性比非酯型和單酯型大很多。表1和圖3歸納了近些年來從附子中發現的雙酯型C19二萜生物堿。C-14位的酯鍵絕大多數為苯甲酸酯(OBz),少數為茴香酸酯(OAs),如37。

圖3 從附子中獲得的雙酯型C19二萜生物堿成分

母核中其他位置的取代與單酯型相似,也是在C-1、C-3、C-6、C-10、C-13、C-15、C-16和C-18位取代含氧基。但目前獲得的雙酯型C19二萜生物堿中,C-1和C-6均被α-OMe取代,無OH取代類型;C-16均被β-OMe取代;C-18均被OMe取代。其中,烏頭堿(aconitine,39)、次烏頭堿(hypaconitine,46)和新烏頭堿(中烏頭堿,mesaconitine,48)是附子中含量較大的代表性二萜生物堿。

表1 附子中的C19型二萜生物堿

1.2 C20型二萜生物堿 C20二萜生物堿的骨架類型復雜多樣,屬于較原始的二萜生物堿類型,主要分為八類:阿替生型(Atisines)、光翠雀堿型(Denudatines),海替定型(Hetidines)、海替生型(Hetisines)、維特欽型(Veatchines)、納哌啉型(Napellines)、阿諾特啉型(Anopterines)和Arcutine型。近年來從附子中發現的C20型二萜生物堿見表2和圖4,其中化合物51和52為阿替生型,N原子上均有乙基取代,C-15和C-17均被含氧基團取代?；衔?3為罕見的Arcutine型生物堿,由于分離純化過程中使用了氨水和三氟乙酸,故分離得到化合物53的氫氧化物和三氟乙酸鹽[18]?；衔?4-58為海替生型,在54和55結構中,N原子上無甲基或乙基取代,而在56-58結構中,N原子上取代甲基,以季銨鹽的形式存在。此外,C-2上連接丙酰氧基或異丁酰氧基,C-13上取代2-甲基丁酰氧基,這些含氧取代基在以往的烏頭屬植物中還未見報道。除以上阿替生型和海替生型以外,從附子中還發現了Napelline型、Lycoctine型和Arcutine型,其中宋果靈(59,songorine)在很多烏頭屬植物中均有報道。化合物60-62以季銨鹽的形式存在,其陰離子的引入也與實驗過程中使用鹽酸和三氟乙酸有關。

表2 附子中的C20型二萜生物堿

圖4 從附子中獲得的C20二萜生物堿成分

序號名稱化學式參考文獻64uracilC4H4N2O2[17]656-hydroxymethyl-3-pyridinolC7H9NO2[21]66adenosineC10H13N5O4[22]675-hydroxymethyl-pyrrole-2-carbaldehydeC6H7NO2[11]68aconicaramideC11H14N2O3[11]69oleraceinEC12H13NO3[11]70N-(2'-β-D-glucopyranosyl-5'-hydroxysali-cyl)-4-hydroxy-3-methoxyanthranilicacidmethylesterC22H25NO12[22]71N-(2'-β-D-glucopyranosyl-5'-hydroxysali-cyl)-4-hydroxyanthranilicacidmethylesterC21H23NO11[22]72aconicarmiquinamideAC21H25N3O6[23]73aconicarmiquinamideBC19H21N3O6[23]74(2S,3S,4R,8E)-2-[(2'R)-2'-hydroxy-lignoceroylamino]-8(E)-octadecene-1,3,4-triolC42H83NO5[24]

1.3 非二萜生物堿 相對于二萜生物堿而言,其他類生物堿的研究較少,目前僅從附子中報道了11個非二萜生物堿,主要包括嘧啶、吡啶、腺苷、吡咯和酰胺類(表3和圖5)。

圖5 從附子中獲得的非二萜生物堿成分

1.4 其他化合物 目前已報道的附子化學成分研究主要為生物堿類,非生物堿較少。迄今為止,從附子中獲得22個非生物堿成分(表4和圖6),主要類型為黃酮類(76-79)和芳香酸類(80-93)。

表4 附子中的非生物堿成分

圖6 從附子中獲得的其他成分

2 附子化學成分的藥效學研究

目前對于附子化學成分的藥效研究,主要集中于心血管系統和神經系統,所研究的對象多為生物堿類化合物。其中強心和鎮痛研究最多,這與附子的傳統功效密切相關,在一定程度上反映出附子的藥效物質基礎,表5列出了近年來附子化學成分藥效學研究的主要結果。

2.1 對心血管的作用 附子為“回陽救逆第一品”,有顯著強心作用,已在不同的動物模型上得到證實,如鼠、兔、蟾蜍、貓以及狗等。目前發現的附子強心成分既包括水溶性成分,也包括脂溶性成分。日本學者首次從附子中分離得到去甲烏藥堿[27],此后多位學者均發現其具有顯著的強心作用,認為去甲烏藥堿為附子中的強心成分,可濃度依賴性增強心肌收縮力(±dp/dt)和最大收縮舒張速率(ph/bl),起效濃度為0.1 μM,EC50約為0.205 μM[28]。此外,有學者研究表明:從附子水提液中分離得到的尿嘧啶同樣具有強心作用,可加強蟾蜍離體心臟的心肌收縮,且不影響心率[17,31]。水溶性成分附子苷也可使豚鼠離體心臟的LVSP、±dp/dtmax明顯增加,且不影響心率,表明附子苷可導致心肌收縮能力增加,產生正性肌力效應[31]。氯化棍掌堿可通過增加豚鼠右心房收縮振幅與速率產生強心作用[32]。去甲豬毛菜堿除強心作用以外,因其為弱β-腎上腺素興奮劑還具有一定的升壓作用[33]。除了部分水溶性成分具有強心作用以外,一些脂溶性烏頭堿類也表現出明顯的強心作用,其中研究最多的當屬烏頭堿:烏頭堿對H2O2構建的心力衰竭模型有明顯強心作用,其最佳量-時-效組合為50 μM的烏頭堿作用于心力衰竭模型0.5 h[34];烏頭堿還可增加離體蛙心平均振幅增長率表現出一定的強心作用[35]。Liu XX等[9]從附子中分離得到5個生物堿,其中新烏頭原堿、次烏頭原堿、北烏寧對離體蛙心均有明顯的強心作用。此外,異塔拉定、烏頭原堿、3-去氧烏頭原堿對離體蛙心也表現出一定的強心作用[9,35]。

除了強心作用以外,一些附子生物堿還具有保護心肌細胞的作用。本課題組從附子中分離得到的附子靈、尼奧靈對戊巴比妥造成的心肌細胞損傷具有保護作用,提高細胞生存能力[11]。具強心作用的去甲烏藥堿還可選擇性激活β2腎上腺素受體激動劑抑制心肌細胞凋亡,防止缺血再灌注損傷。其抗凋亡作用是通過PI3K介導,激活p-AKT,下調caspase3、9凋亡蛋白表達產生效應。這些發現表明去甲烏藥堿抗凋亡作用和心肌保護作用是通過β2-AR/PI3K/AKT通路介導產生效應[29]。此外,去甲烏藥堿還具有抗血小板聚集的作用[30]。

2.2 對神經系統的作用 附子化學成分對神經系統的作用主要表現為神經細胞保護和鎮痛。從附子水提取物分離得到的3個新C19烏頭堿型二萜生物堿(-)-(A-b)-14α-benzoyloxy-N-ethyl-3α,8β,13β,15α-tetrahydroxy-1α,6α,16β,18-tetramethoxyaconitane、(-)-(A-b)-8β,14α-dibenzoyloxy-N-ethyl-3α,13β,15α-trihydroxy-1α,6α,16β,18-tetramethoxyaconitane、(-)-(A-b)-14α-benzoyloxy-N-ethyl-6α,15α-dihydroxy-1α,8β,16β,18-tetramethoxyaconitane對無血清培養誘導的PC12損傷均具有保護作用,10 μM藥物作用于細胞時可將細胞活力分別從(55.1±4.2)%提升至(79.8±5.7)%、(74.7±4.6)%和(75.8±7.6)%[12]。Dimethyl(-)-(R)-eucomate對氧糖剝奪復糖誘導SK-N-SH神經母細胞瘤細胞損傷具有保護作用,與空白組比較,可使細胞活力提升(39.96±4.63)%。阿魏酸甲酯對左旋谷氨酸誘導SK-N-SH神經母細胞瘤細胞損傷具有保護作用,與空白組比較,可使細胞活力提升(14.03±4.50)%。linocinnamarin對左旋谷氨酸誘導SK-N-SH神經母細胞瘤細胞損傷具有保護作用,與空白組比較,可使細胞活力提升(11.17±3.48)%[25]。

在鎮痛方面,附子中多個烏頭堿型生物堿具有明顯的作用,這可能與附子治療風濕痹痛有關。現代藥理實驗證明烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿、去氧烏頭堿、guiwuline等均具有較強的鎮痛活性,但因其毒性大、安全性小,臨床應用受到限制。其中,烏頭堿經皮給藥時,單次給藥出現一定的皮膚急性毒性,但隨著用藥次數增加,毒性反應出現“反轉現象”,作用強度隨著用藥量的增加而加強,累計外用出現良好的鎮痛作用[36]。次烏頭堿和新烏頭堿可減少老鼠抽搐次數,增加疼痛反應潛伏時間[37]。去氧烏頭堿可介導κ阿片受體增強利多卡因對家兔硬膜外的鎮痛效果[39]。Guiwuline在小鼠模型上具有明顯鎮痛作用,其ED50值為15 mg/kg[40]。

表5 附子化學成分的藥效作用

表6 附子化學成分的毒性

2.3 對免疫系統和新陳代謝的影響 附子對心血管系統和神經系統的藥效是目前附子研究的主要方向,但除此之外,也有大量報道表明附子還具有其他多種作用,如對免疫系統的影響、調節新陳代謝等作用。

1997年,馬建等[41]研究烏頭堿對正常小鼠和皮質酮所致的陽虛模型小鼠腹腔巨噬細胞在干擾素誘導情況下表面Ia抗原表達的改變,結果發現:烏頭堿能提高正常小鼠和皮質酮免疫抑制陽虛模型小鼠M Ia抗原的表達,從而增強M遞呈抗原能力,促進免疫應答反應。此外,從附子中分離得到的水溶性附子多糖FPS-1,可明顯刺激伴刀豆球蛋白A和脂多糖造模后小鼠的淋巴細胞增殖,并促進脾細胞產生抗體,具有免疫促進作用[42]。

早期日本學者Hikino H[43]等發現生附子和炮附子的甲醇提取物可刺激小鼠肺對氨基酸的攝入,活性追蹤實驗發現:從中分離得到的新烏頭堿具有最強的活性,這種作用可被放線菌素D拮抗,并且新烏頭堿可以增加肺部蛋白質合成同時降低腎部蛋白質合成。Konno C[44]等從附子中分離出的附子多糖aconitans A、B、C、D能明顯降低正常小鼠和高血糖模型小鼠的血糖水平,其中aconitan A不影響血液和細胞胰島素水平以及己糖激酶、葡糖激酶、葡萄糖-6-磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的活性,而是刺激磷酸果糖激酶的活性[11]。

2.4 其他作用 從附子乙醇提取物中分離得到的oleracein E表現出一定的抗菌作用[11]。附子多糖FPS-1可增加小鼠齒狀回區的新生細胞、提高海馬區的BDNF水平,具抗抑郁作用,且這種抗抑郁和細胞增生作用可被K252a阻斷[46]。去甲烏藥堿和氯化棍掌堿還可影響乙酰膽堿的釋放[47]。

3 附子化學成分的毒性研究

附子中的雙酯型生物堿一直被認為是附子中的毒性物質,而單酯型和無酯型生物堿的毒性較弱,因此,附子的毒性物質基礎研究多集中于雙酯型生物堿成分,主要包括烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿(見表6)。

目前毒性報道最多的為烏頭堿,其毒性主要作用于中樞神經系統、心臟和肌肉組織[61]。其中研究較為深入的為心臟毒性,3%烏頭堿作用于心肌細胞30 s至30 min,隨著時間增長,細胞收縮,胞體變小,細胞質間隙增大,細胞膜破裂,細胞內Na+和Ca2+含量顯著升高,而K+和Mg2+含量顯著降低,Na+-K+-ATP酶活力有明顯的抑制,同時興奮心肌α1受體,使其發生自發性收縮導致心律失常。因此,烏頭堿引起心肌細胞損傷的機制為:烏頭堿抑制心肌細胞膜上Na+-K+-ATP酶活性,導致細胞內Na+濃度增高和K+濃度降低,細胞Na+-Ca2+交換增加導致細胞內Ca2+增高,Ca2+增高可導致呼吸鏈中斷、能量消耗增加,導致無氧代謝的增加,氧自由基增加,使生物膜上的不飽和脂肪酸發生脂質過氧化,膜脂質過氧化MDA的增加和生物膜穩定性遭到破壞,導致細胞器的變性,細胞核的損傷,細胞形態和功能損傷[49-50]。與其類似地,次烏頭堿、新烏頭堿、去甲烏藥堿均報道有心臟毒性。李志勇等[59]發現30～120 mmol/L次烏頭堿溶液能引起顯著的心臟毒性,表現為LDH(乳酸脫氫酶)漏出率上升、心肌細胞搏動頻率驟降及細胞膜受損甚至死亡等。韓旭等[50]對新烏頭堿研究發現,其在3×10-8mol/L濃度下即可使離體豚鼠乳頭肌的動作電位的形狀發生“三角形”畸變兼伴有自發性動作電位,縮短動作電位時程,使其發生自發性收縮,出現心律失常。去甲烏藥堿高于1 μmol/L時,對心肌細胞即產生毒性,表現為心肌細胞不節律收縮[28]。

除心臟毒性外,烏頭堿還對神經系統和消化系統等產生毒性。大鼠大腦皮質神經元細胞在2%烏頭堿濃度下,作用30 s細胞活力即明顯降低,20 min細胞基本死亡,神經細胞內出現大量空洞和溶酶體,染色質被破壞,線粒體腫脹擴張,細胞內糖原含量下降,乙酰膽堿、兒茶酚胺、阿片肽、P物質顯著增加。烏頭堿對神經細胞造成毒性的機制可能與心臟毒性機制相似,通過抑制Na+-K+-ATP酶活性,引起細胞的離子通道門控系統、生物電位的改變和細胞內Ca2+超載,最終導致細胞形態和功能的損傷以及相關神經遞質釋放的改變,從而在動物體內表現為各種神經系統癥狀[51]。

小鼠結腸Cajal細胞實驗發現,0.1%烏頭堿作用細胞30 min,細胞間連接完全斷裂,180 min時已觀察不到完整細胞,細胞內MDA含量顯著升高,Na+、K+、Ca2+、糖原含量降低,Na+-K+-ATP酶活性受到抑制,顯示出明顯毒性作用[51]。另有研究表明,高濃度烏頭堿還具有明顯的生殖毒性,可抑制大鼠睪丸支持細胞增殖,降低其對乳酸分泌的刺激作用[52],濃度5×102ng/mL以上的烏頭堿溶液可抑制黃體細胞的增殖及激素的分泌[54]。劉強強[53]等在此基礎上進一步研究發現烏頭堿對雌性大鼠卵巢顆粒細胞也有抑制增殖及氧化損傷的毒性作用,其生殖毒性可能與大鼠體內孕酮、黃體生成素、卵泡刺激素、雌二醇等性激素含量降低有關。

此外,烏頭堿對胚胎也有一定毒性。大鼠全胚胎培養技術研究表明,烏頭堿對器官發生期胚胎有直接的胚胎毒性,延緩胚胎分化和導致神經、心臟等發育畸形,最低毒性濃度為11 μg/mL[55]。烏頭堿在1.46 mg/kg濃度下還表現出肝臟及腎臟毒性[56-57]。Sun Bo運用代謝組學的方法,給予大鼠單劑量烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿后,分析體內代謝變化,結果顯示腎小管功能在給藥24 h內收到較大干擾,體內激素水平明顯變化。烏頭堿的影響比新烏頭堿和次烏頭堿組影響大,GC/TOF-MS分析顯示前兩者的毒性機制可能不同[58]。

4 附子毒-效成分的轉化和整合分析

從以上總結和分析可知,目前對附子研究最多的為生物堿類,其中雙酯型生物堿多報道為毒性,單酯型和無酯型生物堿、水溶性成分多報道為生物活性。但不難發現,即使是以烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿為代表的毒性成分,在一定條件下也表現出良好的活性,且這些成分之間,還會隨著藥材炮制、煎煮方式、配伍使用而發生轉化。

4.1 劑量引起的毒-效轉化 以往大量研究表明附子水提物具有明顯的強心作用,可增強大鼠離體心臟的心輸出量和心肌收縮力且表現出量-效關系,但加大用量便會出現心肌收縮力量不足,心輸出量減少的不良反應,表現出量-毒關系[62]。比較分析附子單體化合物的作用,可以發現烏頭堿既有明顯的強心活性,又可產生顯著的心臟毒性。溫善姍等[34]發現烏頭堿對心力衰竭細胞起強心作用的最佳量-效組合為50 μmol/L,而3%的烏頭堿溶液對大鼠心肌細胞內線粒體、膜、溶酶體、肌纖維膜等均有毒性[51]。此外,烏頭堿經皮給藥時,單次給藥出現一定的皮膚急性毒性,但隨著用藥次數增加,毒性反應出現“反轉現象”,作用強度隨著用藥量的增加而加強,累計外用出現良好的鎮痛作用[36]。

同樣,次烏頭堿及新烏頭堿在小鼠口服給藥5.8、1.8 mg/kg時出現半數死亡[48],但劑量降低至0.0063 mg/kg可減少老鼠抽搐次數,增加疼痛反應潛伏時間,表現出顯著的鎮痛作用[37],新烏頭堿在0.16 mg/kg劑量下還可抑制角叉菜誘導的大鼠足腫模型腫脹,表現出明顯抗炎作用[38]。以上說明,用藥劑量是附子毒與效轉化的關鍵點之一。

4.2 炮制引起的毒-效轉化 附子是傳統大毒中藥,歷代均很重視其炮制方法。在傳統炮制的基礎上,有關附子的炮制方法得到了很大發展,使得其炮制品達十種以上。附子在現代臨床多用其炮制品而不用生品,亦是從用藥安全性考慮。本課題組研究發現:相對于生附子而言,各種炮制品(黑順片、白附片、鹽附子、卦附片、熟附片、淡附片、黃附子、刨附片)的酯型生物堿和雙酯型生物堿(新烏頭堿、烏頭堿和次烏頭堿)含量均有不同程度的降低(見表7),提示炮制可以促進附子毒性物質烏頭堿等酯型生物堿的轉化[63]。

4.3 配伍引起的毒-效轉化 本課題組從飲片配伍、組分配伍、成分配伍3個層次,以化學物質和生物學評價共同探討附子配伍減毒增效的科學內涵,并篩選出附子配伍干姜治療陽虛心力衰竭[64]、附子大黃配伍治療陽虛便秘[65]、附子甘草配伍治療抗心律失常[66]的最佳配伍和組分,揭示其配伍增效和減毒的作用機制。附子配伍干姜[67]、附子配伍大黃[65]、附子配伍甘草[68]、附子配伍人參[69]、附子配伍白芍[70]后,均能使其毒性成分雙酯型生物堿的含量降低,促進毒性物質的轉化,生物活性增強,起到增效解毒的作用。具體情況表現如下:

表7 不同炮制品中總生物堿、酯型生物堿以及雙酯型生物堿的含量

附子配伍干姜后,總生物堿和酯型生物堿的溶出度增加,而雙酯型生物堿即有毒組分的溶出度降低,對于心力衰竭動物模型,附子干姜配伍后能明顯增強其治療作用而降低毒性。大黃配伍附子后,酯型生物堿含量呈現不同的變化,其中有毒成分3種雙酯型生物堿溶出度2～6 h較配伍前明顯減少。生附子、白附片、黑順片配伍甘草共煎后,總生物堿含量明顯升高,而酯型生物堿、雙酯型生物堿含量下降明顯。人參附子藥對配伍應用時雙酯型二萜生物堿的含量明顯降低,而單酯型二萜生物堿的含量明顯升高。因此,可以看出,通過配伍可以使毒性成分降低,而其他有效成分增加,起到毒-效轉化的作用。

4.4 使用方法引起的毒-效轉化 附子在傳統應用中,要求“久煎”以控制毒性。本項目組研究發現,生附子、黑順片和白附子的總生物堿、酯型生物堿和雙酯型生物堿含量均在煎煮0～6 h內呈先升高后降低的趨勢:生附子總生物堿在煎煮2 h時溶出量最大,黑順片和白附片總生物堿在1 h達到最高峰;且3種飲片的酯型生物堿含量均在煎煮2 h時達到最大,而烏頭堿、次烏頭堿溶出率均在煎煮2 h、1 h時達到最高,隨后呈下降趨勢[71]。因此,煎煮時間對附子毒-效轉化有重要的影響。

項目組進一步研究表明:附子在煎煮時間、給藥劑量和毒效變化的三因素之間存在密切的關系,是聯合控毒的重要手段,并首次將均勻設計理論用于中藥安全性評價研究中。項目組觀察了不同附子煎煮時間水煎液(15 min、30 min、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h)對疼痛、炎性反應、脾陽虛證和腎陽虛證動物模型的急性毒性和藥理作用。結果顯示附子15 min～4 h水煎液對各種模型均有明顯的急性毒性作用。在煎煮6 h時,毒性較低的情況下,仍保留了較好的藥理作用,能延長熱板法小鼠痛閾值,延長冰醋酸致痛小鼠扭體反應出現的時間和減少扭體次數,降低二甲苯所致小鼠耳郭腫脹程度,降低巴豆油致肉芽腫,增加脾陽虛證和腎陽虛證小鼠的體重和升高體溫,延長腎陽虛小鼠游泳時間等。在抗炎鎮痛作用中,發現15 min和30 min水煎液作用最強,但同時毒性也太大[72-73]。此外,秦永剛等[74]采用離體蛙心實驗,對不同蒸煮時間的附子進行了強心作用及心臟毒性的觀察,發現附子蒸煮8 h、10 h、12 h具有強的正性肌力作用,且心臟毒性顯著減低。以上表明:不同的煎煮方法是促進附子毒-效轉化的重要手段。

4.5 代謝引起的毒-效轉化 藥物代謝可影響藥物作用的強弱和持續時間的長短,還會影響藥物治療的安全性。研究發現,大鼠尾靜脈給藥0.6 μg/kg烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿后,大鼠體內不僅檢測到了烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿,在水解酶的作用下,還檢測到了苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、烏頭原堿、新烏頭原堿,表明毒性很大的雙酯型生物堿在體內可被代謝為毒性較低的單酯型生物堿和無酯型生物堿,并且雙酯型生物堿在體內的消除比其代謝產物苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、烏頭原堿、新烏頭原堿快2.6-7.5倍,即毒性越大的烏頭堿類生物堿被機體消除的速率越快[75]。另有研究表明,在大鼠肝微粒體的作用下,烏頭堿比苯甲酰烏頭原堿、烏頭原堿更易代謝。通過組織分布實驗發現這3種生物堿在所有器官中均有分布,但烏頭堿的分布區域最小[76]。此外,與其他藥物配伍使用也可影響附子生物堿的代謝過程。例如,在中國以及其他亞洲國家,綠豆是一種傳統的解毒藥,烏頭堿與500 μg/kg的綠豆提取物合用后,可將烏頭堿Cmax、AUC0→t和AUC0→∞減少1.5倍。通過機制研究發現,綠豆降低烏頭堿急性毒性的機制是阻止烏頭堿在腸的吸收[77]。

5 結語

附子作為療效顯著的大毒中藥,歷來是人們關注和研究的熱點,在過去的100年間,人們對附子開展了大量的研究,以期揭開其神秘的面紗,明晰其治病和致毒的根本原因,但現在看來,仍然任重而道遠。在化學成分研究方面,近年來取得了很大的進展,共從附子(the lateral roots ofAconitumcarmichaelii)中獲得90余個化合物(不含川烏),但大部分化學成分研究集中于附子脂溶性成分,對傳統應用的附子水煎液研究較少;大部分研究集中于生物堿類,對其他成分的深入研究較少;大部分針對附子生物堿的研究多集中于二萜生物堿類,對其他生物堿的研究較少;后續的活性篩選、藥效研究和毒理研究不足。因此,附子毒-效作用的本質仍然迷霧重重,這可能需要我們換一種方式去理解有毒中藥的整體情況,在現有條件和背景下,采用整合分析的方式去探討毒-效相互轉化和辨證統一的關系。

中藥的毒與效是客觀存在的,尤其在療效顯著的大毒中藥中,毒和效既是矛盾的,又是統一的。同一組分、成分在不同條件下,可能發揮完全不同的生物學效應,也可能向不同的成分轉變,實現毒與效的轉化。這種不同條件可以是最常見的化學因素、也可以是劑量因素、模型因素、炮制因素、配伍因素、使用方法因素、代謝因素等,這與中醫藥的傳統思想是完全吻合的。附子既可以強心,也可以導致心臟毒性;既有鎮痛效果,又會產生神經毒性。因此,毒效整合分析思路打開了了解附子物質基礎的另一扇窗戶,也為認識其他有毒中藥提供了一種方式,但是仍然有大量的基礎工作亟待開展,以形成一個相對完整的毒-效轉化網絡。

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DiscussiononMaterialBasisofToxicHerbRadixAconitiLateralisPraeparataBasedonthe“IntegratedAnalyticalMethodofToxicityandEfficacy”

Xiong Liang, Peng Cheng, Miao Lulin, He Yulin, Meng Chunwang, Su Haiguo

(CollegeofPharmacy,ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine;KeyLaboratoryofChineseHerbsStandardizationofMinistryofEducation;Co-constructKeyLaboratoryofSystematicResearch,DevelopmentandUtilizationofChineseMedicinalResources,Chengdu611137,China)

Chinese medicinal has both toxicity and efficacy, especially in extremely toxic drugs with potent efficacy. The toxicity and efficacy of Chinese medicinal are both contradictory and unified. The toxic and effective material basis often affect and transform to each other. Radix Aconiti Lateralis Praeparata, a famous Chinese medicinal, not only has significant efficacy, but also extremely toxic. Thus, it has been a hotspot for research. Although more than 90 compounds have been isolated from Radix Aconiti Lateralis Praeparata, the basic reason for its efficacy and toxicity still remains to be revealed. The complexity of the problem is that the toxicity and efficacy of Radix Aconiti Lateralis Praeparata can transform to each other under different conditions. For example, it has significant cardiotonic effect, while it can also cause cardiotoxicity. Similarly, it can release pain, but has neurotoxicity. Moreover, the same component may exert completely different biological effect due to the different dosage, model, processing method, compatibility of Chinese medicinals, and drug metabolism. Based on our research results and literatures of Radix Aconiti Lateralis Praeparata, this paper will discuss on the material basis of Radix Aconiti Lateralis Praeparata by “integrated analytical method of toxicity and efficacy”.

Radix Aconiti Lateralis Praeparata; Material basis; Integrated analysis of toxicity and efficacy; Chemical components; Transformation between toxicity and efficacy

國家自然科學基金重點項目(81630101);國家發改委標準化項目(ZYBZH-C-SC-51);國家自然科學基金國家基礎科學人才培養基金(J1310034);四川省中醫藥管理局“川產道地藥材綜合開發與區域發展”項目(2016ZY008)

熊亮(1983.06—),男,博士,教授,研究方向：中藥藥效物質及天然產物研究與開發,E-mail:xiling0505@126.com

彭成(1964.03—),男,博士,教授,博士研究生導師,研究方向：中藥毒效的系統評價與整合研究,E-mail:pengchengchengdu@126.com

R284.1

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.11.005

(2017-10-09收稿 責任編輯：王明)