降糖消渴顆粒對實驗性糖尿病大鼠心肌MAPK信號通路影響

趙丹丹 吳 瑞 于 娜 左加成 馬 越 田 甜 莫芳芳 張東偉 高思華

(1 北京中醫藥大學中醫學院,北京,100029; 2 中國中醫科學院廣安門醫院南區,北京,102618)

降糖消渴顆粒對實驗性糖尿病大鼠心肌MAPK信號通路影響

趙丹丹1吳 瑞2于 娜1左加成1馬 越1田 甜1莫芳芳1張東偉1高思華1

(1 北京中醫藥大學中醫學院,北京,100029; 2 中國中醫科學院廣安門醫院南區,北京,102618)

目的:觀察降糖消渴顆粒對實驗性糖尿病大鼠心肌病理形態及絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路的影響,研究其對糖尿病心肌病的作用及機制。方法:SD大鼠高脂飼料喂養4周后結合腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)30 mg/kg,建立2型糖尿病大鼠模型,將成模的大鼠按血糖隨機分為模型組、陽性對照組(吡格列酮片1.5 mg/kg BW)、降糖消渴顆粒組(9 g生藥/kg BW),并設正常對照組。干預4周后,檢測各組大鼠心臟質量指數;心肌組織切片并用HE染色,觀察藥物對糖尿病大鼠心肌組織病理形態的影響;應用western-blot法檢測心肌MEK1/2,p38 MAPK,p-p38 MAPK的蛋白表達情況。結果:降糖消渴顆粒組大鼠心臟質量指數明顯低于模型組(P<0.05),降糖消渴顆粒對實驗性糖尿病大鼠心肌組織的病理改變有改善作用,同時能下調糖尿病大鼠心肌組織MEK1/2,p38 MAPK總蛋白表達,且能減少p-p38 MAPK蛋白量(P<0.05),提示其對糖尿病大鼠心肌MAPK信號通路具有抑制作用。結論:降糖消渴顆粒能夠通過調節心肌組織MAPK信號通路,改善心肌纖維化及心肌細胞凋亡,從而實現延緩糖尿病心肌病進展的作用。

降糖消渴顆粒;糖尿病心肌病;病理;MAPK信號通路

糖尿病心肌病(Diabetic Cardiomyopathy,DCM)是糖尿病的重要并發癥之一,亦是導致糖尿病患者死亡的主要原因[1]。其主要病理改變包括微血管病變、心肌纖維化、心肌肥厚等[2],以上病理改變與糖尿病時長期高血糖、高血脂狀態導致氧化應激,線粒體功能障礙導致的炎性反應、纖維化及局灶性細胞死亡密切相關[3]。絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated Protein Kinase,MAPK)是一組能被不同的細胞外刺激,如細胞因子、神經遞質、激素、應激等激活的促分裂原活化蛋白激酶,對細應激調節、炎性反應等多種生命過程發揮著調節作用。MAPK通路參與了氧化應激和炎性反應等DCM最重要的病理過程[4],故抑制心肌組織MAPK通路對于DCM的早期防治具有非常重要的意義。

降糖消渴顆粒是在肝脾腎三臟同調法治療T2DM臟腑辨證新模式[5]的指導下創制的治療2型糖尿病最常用的方劑之一[6]。前期研究顯示該方具有較好的抗糖尿病及抗氧化作用[7],然而該復方對DCM的作用尚不清楚。本研究擬用降糖消渴顆粒干預實驗性糖尿病大鼠,通過觀察其對心肌MAPK信號通路的影響探討其治療的DCM機制,亦為尋找DCM的有效治療藥物提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 雄性SD大鼠,體重180～200 g,購自北京維通利華實驗動物中心,合格證號SCXK(京)2012-0001。飼養于北京中醫藥大學屏障環境動物實驗室,合格證號SCXK(京)2011-0024,室溫20 ℃,相對濕度45%左右,光暗周期(12 h/12 h),實驗期間,動物自由進食水。普通飼料及高脂飼料(20%蔗糖、2.5%膽固醇、10%豬油、1%膽酸鈉、66.5%基礎飼料),購于北京科澳協力飼料有限公司,合格證號SCXK(京)2009-0012。

1.1.2 藥物 降糖消渴顆粒及制備方法同前期文獻報道[7]。吡格列酮片由北京太洋藥業有限公司生產。

1.1.3 試劑與儀器 鏈脲佐菌素(STZ,SIGMA公司,美國,以0.1 mol/L,pH4.5檸檬酸緩沖液溶解,新鮮配制而成),MEK1/2(MAPK激酶)、p38MAPK、phospho-p38MAPK、GAPDH一抗(均購自于CST公司,美國);辣根過氧化物酶標記二抗(GBI公司,美國)。光學顯微鏡為日本奧林帕斯產品。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 雄性SD大鼠45只,適應性飼養1周,隨機抽取10只作為正常組,普通飼料喂養;其余35只大鼠采用高脂飼料喂養4周后,高脂飼料喂養組禁食12 h,鏈脲佐菌素(STZ)按30 mg/kg腹腔注射大鼠。普通飼料喂養組同期注射同體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。3 d后檢測禁食16 h后血糖,以空腹血糖>16.7 mmol/L為糖尿病造模成功標準[8]。將符合要求的大鼠30只,按血糖、性別隨機分組,糖尿病模型組10只,吡格列酮組10只,降糖消渴顆粒組10只。

1.2.2 給藥方法 降糖消渴顆粒以生藥量計為9 g/kg(為人用日劑量的10倍),陽性藥物組予吡格列酮片,給藥量為5 mg/kg(相當于臨床人用量10倍),模型組及正常組等量純凈水灌胃。實驗期間繼續原喂養方式,共給藥4周。該實驗方案經北京中醫藥大學動物倫理委員會審核通過。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 心臟重量指數檢測 末次給藥后,大鼠禁食12 h,稱量大鼠體重。戊巴比妥鈉(40 mg/kg體重)麻醉,下腔靜脈取血處死,冰上分離整個心臟,稱重,計算心臟重量指數=心臟重量/體重。

1.2.3.2 病理學觀察 剪取心臟左心室的小塊組織,10%中性甲醛固定,石蠟包埋,切片厚度4 μm,進行蘇木素-伊紅(HE)染色,光鏡觀察其病理學改變,攝片并進行圖像分析。

1.2.3.3 Western-Blot方法檢測MEK1/2、p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白的表達 剪取心肌組織塊,加入預冷的含1%PMSF的RIPA裂解液低溫裂解心肌組織,離心,提取總蛋白,按BCA試劑盒說明操作,進行蛋白含量測定,配制SDS-PAGE分離膠、濃縮膠,進行電泳、轉膜、封閉,分別將PVDF膜用稀釋好的MEK1/2、p38 MAPK、p-p38 MAPK(1∶1 000,5%脫脂奶粉稀釋)進行孵育,4 ℃搖蕩過夜,再用熒光二抗(1∶5 000稀釋)室溫孵育1.5 h。ECL發光顯色,凝膠成像儀曝光成像。Image J軟件分析條帶灰度,并進行半定量分析處理。

2 結果

2.1 各組大鼠心臟質量指數的比較 與正常大鼠比較,糖尿病大鼠心臟質量指數顯著升高(P<0.05),提示該實驗性糖尿病大鼠存在糖尿病導致的心肌病變。與模型組大鼠比較,降糖消渴顆粒組與吡格列酮組大鼠心臟質量指數明顯下降,差異有統計學意義(P<0.05),說明降糖消渴顆粒可能具有改善DCM的作用。見圖1。

圖1 各組大鼠心臟質量指數的比較

注：與正常組比較,**P<0.01,與模型組比較,#P<0.05

2.2 各組大鼠心肌病理形態學的比較 正常組心肌細胞排列有序,血管周圍無炎性細胞浸潤。模型組心肌細胞體積增大,心肌間隙增寬,并可見部分心肌輕度變性并斷裂及少量壞死的心肌細胞;心肌細胞動脈血管周圍少量慢炎性細胞浸潤,并可見散在少量纖維結締組織。與模型組比較降糖消渴顆粒組與吡格列酮組的心肌組織病理改變有所改善,具體表現為脂肪變性減少,心肌間隙變窄,炎性細胞浸潤減輕,心肌輕度變性緩解。見圖2。

圖2 各組大鼠左室心肌組織HE染色

2.3 各組大鼠心肌MEK1/2的比較 與正常組比較,模型組大鼠心肌組織MEK1/2蛋白表達量明顯升高,差異有統計學意義(P<0.05),吡格列酮與降糖消渴顆粒給藥4周后能夠降低MEK1/2蛋白表達量,但與模型組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3。

圖3 各組大鼠心肌MEK2/MEK1蛋白的表達情況

注：與正常組比較,*P<0.05

2.4 各組大鼠心肌p38 MAPK,p-p38 MAPK蛋白的比較 與正常組比較,模型組大鼠心肌p38 MAPK,p-p38 MAPK蛋白表達量明顯升高,組間差異有統計學意義(P<0.01);與模型組比較,吡格列酮組與降糖消渴顆粒組大鼠心肌p38 MAPK,p-p38 MAPK蛋白表達量均顯著降低,差異有統計學意義(P<0.05)。p-p38 MAPK/p38 MAPK結果顯示,糖尿病大鼠心肌組織內p38 MAPK磷酸化程度明顯升高,說明糖尿病心肌組織p38 MAPK激活,誘導心肌細胞凋亡,降糖消渴顆粒能夠減少p38 MAPK的磷酸化水平,抑制p38 MAPK活性,從而對糖尿病心肌損傷起到保護作用。見圖4。

圖4 各組大鼠心肌p38 MAPK,p-p38 MAPK蛋白的表達情況

注：與正常組比較,*P<0.05,**P<0.01,與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01

3 討論

DCM是作為獨立于冠心病、高血壓等的一類特異性心肌病,與糖尿病時高血糖及胰島素抵抗狀態密切相關[9],其發病機制復雜,包括氧化應激和炎性反應的異常造成的心肌細胞凋亡或心肌間質纖維化等心臟結構的損傷;微血管病變等心肌組織微循環的改變;心肌細胞物質和能量代謝障礙等[10]。臨床上早期以左心室舒張功能障礙,晚期以收縮功能障礙為主,可誘發心力衰竭、心源性休克和猝死[11]。DCM病理改變及臨床特點的特異性決定了能夠降血糖,改善胰島素抵抗的藥物具有潛在的治療DCM的作用。我們前期研究發現,基于肝脾腎同調治療糖尿病的復方降糖消渴顆粒顯示了良好的抗糖尿病的作用,為其在干預和治療DCM方面奠定了良好的基礎。本研究應用高脂飲食聯合STZ誘導實驗性糖尿病大鼠模型,結果證實降糖消渴顆粒具有減輕大鼠心臟重量指數,改善局灶性心肌細胞凋亡壞死,并減輕慢性炎細胞浸潤,減輕心肌間質纖維化的的作用,與文獻報道類似[12]。

MAPK是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,其激活途徑為三級酶促級聯反應。其中p38MAPK是MAPK通路中重要的信號轉導分子,廣泛參與多種細胞功能的調控,是細胞信號傳遞的交匯點。與上述DCM的主要病理機制中的氧化應激、炎性反應及心肌細胞凋亡有著密不可分的關系[13-14]。有文獻報道糖尿病時諸多因素如高血糖、胰島素抵抗、高胰島素血癥、氧化應激、炎性反應和細胞因子等都可以誘導p38MAPK的活化,激活的p38MAPK通路啟動線粒體凋亡途徑造成糖尿病心肌損傷[15]。有研究顯示在千金藤素導致的凋亡的心肌細胞中,p38 MAPK磷酸化水平增強。此外,p38MAPK亦可通過影響單核-巨噬細胞、血管內皮細胞和血管平滑肌細胞等參與DCM微血管病變[10],從而導致心肌纖維化、左心室肥大、左心室收縮及舒張功能減退。

許多藥物可通過下調p38MAPK抑制心肌細胞凋亡及心室重塑[16-17]。本研究顯示高血糖狀態下,p38MAPK總蛋白表達升高,磷酸化p38MAPK蛋白增加,提示糖尿病時p38MAPK信號通路激活,p38MAPK上游蛋白MEK1/2亦有增加的趨勢,降糖消渴顆粒能夠減少p38MAPK總蛋白的表達,同時降低了p38MAPK磷酸化程度,抑制p38MAPK的激活,阻斷了p38MAPK信號途徑,從而發揮了對心肌細胞的保護作用。總之,降糖消渴顆粒對糖尿病大鼠的心臟具有一定的保護作用,這可能與抑制心肌組織p38MAPK信號通路有關,該實驗結果為研發早期防治DCM的藥物提供了實驗依據。

[1]Chavali V,Tyagi SC,Mishra PK.Predictors and prevention of diabetic cardiomyopathy[J].Diabetes Metab Syndr Obes,2013,6:151-160.

[2]Varga ZV,Giricz Z,Liaudet L,et al.Interplay of oxidative,nitrosative/nitrative stress,inflammation,cell death and autophagy in diabetic cardiomyopathy[J].Biochim Biophys Acta,2015,1852(2):232-242.

[3]Westermeier F,Riquelme JA,Pavez M,et al.New Molecular Insights of Insulin in Diabetic Cardiomyopathy[J].Front Physiol,2016,7:125.

[4]Wang S,Ding L,Ji H,et al.The Role of p38 MAPK in the Development of Diabetic Cardiomyopathy[J].Int J Mol Sci,2016,17(7):1037.

[5]趙丹丹,高思華,穆倩倩,等.肝脾腎同調辨治2型糖尿病的理論依據與特色[J].中醫雜志,2014,55(3):205-208.

[6]高思華,龔燕冰,倪青,等.肝脾腎同治法辨證治療2型糖尿病的臨床研究[J].中華中醫藥雜志,2009,24(8):1007-1010.

[7]Zhao DD,Yu N,Li XK,et al.Antidiabetic and antioxidative effect of jiang tang xiao ke granule in high-fat diet and low-dose streptozotocin induced diabetic rats[J].Evid Based Complement Alternat Med,2014,2014:475192.

[8]李儀奎.中藥藥理實驗方法學[M].上海:上海科學技術出版,2006:605.

[9]Felício JS,Koury CC,Carvalho CT,et al.Present Insights on Cardiomyopathy in Diabetic Patients[J].Curr Diabetes Rev,2016,12(4):384-395.

[10]Bugger H,Abel ED.Molecular mechanisms of diabetic cardiomyopathy[J].Diabetologia,2014,57(4):660-671.

[11]Dhalla NS,Takeda N,Rodriguez-Leyva D,et al.Mechanisms of subcellular remodeling in heart failure due to diabetes[J].Heart Fail Rev,2014,19(1):87-99.

[12]王小梅,穆長征,趙田田,等.通心絡對糖尿病大鼠心臟功能及心肌超微結構的影響[J].中成藥,2010,32(12):2167-2170.

[13]Oh CC,Nguy MQ,Schwenke DC,et al.p38α mitogen-activated kinase mediates cardiomyocyte apoptosis induced by palmitate[J].Biochem Biophys Res Commun,2014,450(1):628-33.

[14]Ruiz M,Coderre L,Lachance D,et al.MK2 Deletion in Mice Prevents Diabetes-Induced Perturbations in Lipid Metabolism and Cardiac Dysfunction[J].Diabetes,2016,65(2):381-92.

[15]徐天嬌,劉勇,鄧雅婷,等.胰島素聯合硒抑制糖尿病心肌病大鼠p38MAPK/CBP通路減少心肌細胞凋亡[J].細胞與分子免疫學雜志,2016,32(7):926-930,935.

[16]Li J,Peng L,Du H,et al.The Protective Effect of Beraprost Sodium on Diabetic Cardiomyopathy through the Inhibition of the p38 MAPK Signaling Pathway in High-Fat-Induced SD Rats[J].Int J Endocrinol,2014,2014:901437.

[17]楊翼鷹,陳偉燕,孫秀亭,等.麝香保心丸通過抑制p38MAPK和NF-κB信號傳導通路表達對抗高糖誘導的心肌細胞損傷[J].中國臨床解剖學雜志,2016,34(5):517-522.

EffectofJiangtangXiaokeGranuleonMAPKSignalPathwayinMyocardialTissuesofExperimentalDiabeticRats

Zhao Dandan1, Wu Rui2, Yu Na1, Zuo Jiacheng1, Ma Yue1, Tian Tian1, Mo Fangfang1, Zhang Dongwei1, Gao Sihua1

(1SchoolofChineseMedicine,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China; 2DepartmentofEndocrinology,SouthAreaofGuang′anmenHospital,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing102618,China)

Objective:To explore the effect of Jiangtang Xiaoke granule (JTXKG) on pathological changes and MAPK signal pathway in myocardial tissues of experimental diabetic rats.MethodsDiabetic rats were induced by high-fat diet and low dose streptozotocin (30 mg.kg-1). JTXK granule 9 g/kg (based on crude herb equivalent) and pioglitazone 5 mg/kg (as a positive control for comparison) were orally administrated to diabetic rats for 4 weeks. The ratio of heart weight to body weight and the pathological changes of myocardial tissues were measured. In addition, the protein expression levels of MEK1/2, p38 MAPK, phosphate-p38 MAPK in myocardial tissues were detected.ResultsJTXKG reduced the ratio of heart weight to body weight. Results of HE-staining showed that JTXKG improved pathological changes of myocardial tissues. Moreover, JTXKG significantly down-regulated protein levels of MEK1/2, p38 MAPK, phosphate-p38 MAPK in myocardial tissues of the diabetic rats.ConclusionJTXKG could protect the rats from diabetic cardiomyopathy by inhibiting the MAPK signal pathway in the myocardial tissues of diabetic rats.

Jiangtang Xiaoke Granule; Diabetic cardiomyopathy; Pathology; MAPK signal pathway

國家重大新藥創制子課題(2012ZX09103201-005)；國家自然科學基金項目(NSFC81503540 & NSFC 81274041)；北京市共建項目(0101216-14 & 0101216-2013)

趙丹丹(1985.07—),女,博士,助理研究員,研究方向:中醫藥防治糖尿病的基礎與臨床研究,E-mail:bucmzhaodandan@163.com

高思華(1957.07—),男,博士,教授,中心主任,研究方向:臟腑相關理論與中醫藥防治糖尿病的基礎與臨床研究,Tel:(010)64286929,E-mail:gaosihua1216@163.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.11.043

(2017-01-07收稿 責任編輯：王明)