秦七風濕膠囊的鎮痛作用及其對免疫功能的影響

王 梅 唐志書 周 瑞 宋忠興

(1 陜西中醫藥大學附屬醫院，咸陽，712000； 2 陜西中醫藥大學/陜西省中藥資源產業化協同創新中心/陜西省中藥基礎與新藥研究重點實驗室，咸陽，712083)

秦七風濕膠囊的鎮痛作用及其對免疫功能的影響

王 梅1唐志書2周 瑞2宋忠興2

(1 陜西中醫藥大學附屬醫院，咸陽，712000； 2 陜西中醫藥大學/陜西省中藥資源產業化協同創新中心/陜西省中藥基礎與新藥研究重點實驗室，咸陽，712083)

目的：研究秦七風濕膠囊的鎮痛作用及其對免疫功能的影響。方法：鎮痛實驗采用醋酸扭體法、小鼠甩尾法、大鼠足趾壓痛實驗及小鼠尾壓痛試驗，觀察秦七風濕膠囊的鎮痛作用；免疫實驗采用小鼠免疫器官重量實驗、溶血素抗體實驗、二硝基氟苯所致小鼠遲發型超敏反應實驗模型，觀察其對免疫功能的影響。結果：研究發現秦七風濕膠囊能減少醋酸所致小鼠扭體反應的次數，提高小鼠對熱刺激痛閾值，還可減輕大、小鼠壓痛的致痛程度，說明該藥具備良好的鎮痛作用；研究還發現秦七風濕膠囊對小鼠溶血素抗體生成和由二硝基氟苯引起的遲發型超敏反應均有抑制作用，說明秦七風濕膠囊對機體非特異性免疫和細胞免疫功能具有較強的抑制作用。結論：秦七風濕膠囊具有較強的鎮痛作用，并具有抑制免疫功能的作用，為其臨床治療類風濕關節炎提供了藥理學依據。

秦七風濕膠囊；鎮痛作用；免疫功能

陜西太白“七”藥在用于治療風濕痹痛方面在民間應用廣泛、歷史悠久具有可靠的療效，應用特色鮮明，我們在整理民間驗方此基礎上，挖掘出了珠子參、秦艽、山茱萸組成的復方制劑，并由陜西中醫藥大學院楊秀清教授多年臨床應用觀察其治療風濕及類風濕關節炎等痹病，發現其療效顯著、未見明顯不良反應，已被證實具有益氣養陰，祛風止痛之功效。類風濕關節炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一種以慢性對稱性多關節炎性反應為表現的致殘率很高的全身免疫性疾病[1]，主要表現為關節腫痛、晨僵，當氣壓降低，或溫度升高時疼痛加劇，晚期關節強直畸形，活動功能嚴重受損，以致勞動力喪失或造成殘疾，有學者稱其為“不死的癌癥”。中醫藥治療類風濕關節炎具有獨特優勢[2-3]。近幾年來，隨著RA發病機制的研究進展，中醫藥研究從單純的療效到抗炎、鎮痛研究方面取得了很大進展[4]。珠子參為五加科植物珠子參或羽葉三七的干燥根莖，其主要含有皂苷類、揮發油、有機酸等，藥理研究表明珠子參具有抗腫瘤、抗炎、鎮痛鎮靜及抗脂質過氧化作用等作用[5]。珠子參又名扣子七，《中華人民共和國藥典》2015版中寫道“珠子參主治氣陰兩虛，煩熱口苦，關節疼痛”?！度珖胁菟巺R編》中指出“扣子七主治跌打損傷，風濕關節痛，胃痛，外用治外傷出血”。珠子參為本方中君藥。秦艽為龍膽科植物秦艽、麻花秦艽、粗莖秦艽或小秦艽的干燥根。秦艽根中含有秦艽堿甲(即龍膽堿)、秦艽堿乙(即龍膽次堿)、秦艽堿丙、龍膽苦苷、糖類及揮發油。藥理研究表明秦艽具有抗炎、解熱鎮痛、抗過敏、抗菌、降壓、利尿、保肝利膽等作用[6]?！侗窘洝分兄^秦艽“主寒熱邪氣、寒熱風痹，肢節痛”。《別錄》中寫道秦艽“功在舒經通絡，流利關節惟治痹痛痙攣之癥”。與方中君藥珠子參相伍，協同君藥通痹止痛，為本方中臣藥。山茱萸為山茱萸科植物山茱萸的干燥成熟果肉，含有環烯醚萜苷類、有機酸及其酯類、鞣質類、多糖類、微量元素等。藥理研究發現山茱萸具有降血糖、調節免疫、保肝、抗氧化抗衰老等作用[7]?！夺t學衷中參西錄》中指出山茱萸“大能收斂元氣，振作精神，固澀滑脫，斂正氣而不斂邪氣，與其他酸斂之藥不同，是以《本經》“逐寒濕痹也”。山茱萸為本方中佐使藥。現通過構建不同的動物模型，旨在觀察其鎮痛作用及對免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康SD大鼠，體重180～220 g，由第四軍醫大學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(軍)2012-003。昆明種小鼠，體重18～22 g，西安交通大學醫學部實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(陜)2012-003。

1.1.2 藥物 秦七風濕膠囊藥粉由陜西中醫學院藥物研究所提供。批號：150616。褐色粉粒，不溶于水。秦七風濕每1 g相當于原生藥4.5 g，用蒸餾水配制成混懸液，供灌胃給藥用。準確稱取秦七風濕膠囊藥粉20 g，邊加水邊攪拌，使成混懸液，最終加水至100 mL，即為大劑量組給藥濃度20%，冷藏儲存，備用。

1.1.3 試劑與儀器 鹽酸嗎啡注射液(沈陽第一制藥廠，10 mg/mL，批號：001501)；美洛西康(海南澳美華制藥有限公司，國藥準字h20150398)；醋酸潑尼松(浙江仙郡制藥有限公司，批號：15020；規格：每片5 mg)；印度墨汁(北京篤信精制劑廠，批號：00504262)，4二硝基氯苯(DNFB)，用丙酮，麻油按1∶1混合配成1%濃度；丙酮(開封試劑廠，批號：G8686-78YLS-3E)電子壓痛儀(安徽省淮水正華生物儀器設備有限公司)。梅特勒電子天平(GB204，瑞士制造)；UV1102紫外分光光度計(上海天美科學儀器有限公司)。

1.2 分組與模型制備

1.2.1 小鼠醋酸扭體鎮痛試驗 取小鼠50只，雌雄各半，隨機分成5組，分別為空白對照組(灌胃蒸餾水20 mL/kg)、秦七風濕大、中、小劑量組(分別灌胃秦七風濕2.0，1.0，0.5 g/kg)，陽性藥物組(腹腔注射嗎啡0.01 g/kg)，除陽性藥物組外，各組連續灌胃給藥3 d，1次/d，灌胃體積均為20 mL/kg，陽性藥物組在最后一天腹腔注射嗎啡1次，體積為10 mL/kg。在末次給藥30 min后各鼠腹腔注射0.6%冰醋酸溶液0.1 mL/10 g，觀察并記錄注射冰醋酸溶液后30 min內各鼠出現扭體反應的次數，并計算鎮痛百分率。以扭體次數為指標進行組間比較。

1.2.2 小鼠熱痛反應潛伏期試驗 取小鼠50只，隨機分成5組，分別為模型組(灌胃蒸餾水10 mL/kg)，嗎啡組(腹腔注射嗎啡0.01 g/kg)、秦七風濕大、中、小劑量組(分別灌胃秦七風濕2.0，1.0，0.5 g/kg)。除陽性藥物組外，各組連續灌胃給藥6 d，1次/d，陽性藥物組在最后一天腹腔注射嗎啡1次，體積均為10 mL/kg。分別在給藥前和末次給藥30 min后，將小鼠尾下部垂直浸入45 ℃恒溫水浴中，浸入長度約為3 cm，以尾部明顯回縮出水面的潛伏期為測定痛指標。

1.2.3 大鼠足尖壓痛閾值和小鼠尾壓痛試驗 取SD大鼠45只，雌雄各半，隨機分成5組，分別為模型對照組(灌胃蒸餾水10 mL/kg)，陽性藥物組(灌胃美洛昔康0.03 g/kg)、秦七風濕大、中、小劑量組(分別灌胃秦七風濕1.0，0.5，0.25 g/kg)。各組連續灌胃給藥7 d，1次/d，分別在給藥前和末次給藥30 min后，用YLS-3E電子壓痛儀測定每只大鼠的足尖痛閾值并計算痛閾增長值。以給藥后各組的痛閾值及痛閾增長值為指標，進行組間比較。取昆明種小鼠50只，隨機分成5組，分別為模型對照組(灌胃蒸餾水10 mL/kg)，嗎啡組(腹腔注射嗎啡10 mg/kg)、秦七風濕大、中、小劑量組(分別灌胃秦七風濕膠囊2.0，1.0，0.5 g/kg)。除陽性藥物組外，各組連續灌胃給藥7 d，1次/d，陽性藥物組在最后1 d腹腔注射嗎啡1次，體積均為10 mL/kg。分別在給藥前和末次給藥30 min后，用YLS-3E電子壓痛儀測定每只小鼠的尾壓痛閾值并計算痛閾增長值。

1.2.4 小鼠免疫器官重量檢測 取小鼠50只，雌雄各半，隨機分成5組，分別為空白對照組(灌胃蒸餾水10 mL/kg)、陽性對照組(灌胃潑尼松片0.03 g/kg)、秦七風濕膠囊大、中、小劑量組(分別灌胃秦七風濕膠囊2.0，1.0，0.5 g/kg)，各組灌胃體積均為10 mL/kg。每天給藥1次，共灌胃7 d。于末次給藥后將各組小鼠全部脫頸椎處死，剖取胸腺、脾臟，把其他組織剝離干凈，用濾紙吸干水分后，用電子天平稱重。按以下公式計算胸腺、脾臟指數:脾臟指數=脾臟重量(mg)/體重(g)；胸腺指數=胸腺重量(mg)/體重(g)。

1.2.5 小鼠溶血素抗體實驗 取小鼠50只，雌雄各半，隨機分成5組，分別為空白對照組(灌胃蒸餾水20 mL/kg)、潑尼松組(灌胃潑尼松片0.03 g/kg)、秦七風濕大、中、小劑量組(分別灌胃秦七風濕2.0，1.0，0.5 g/kg)。灌胃給藥7 d，灌胃體積均為20 mL/kg，當天每鼠腹腔注射5%生理鹽水雞紅細胞懸液0.2 mL，免疫7 d后，摘小鼠眼球取血，取稀釋100倍血清1 mL，與5%雞紅細胞懸液0.5 mL，10%補體(豚鼠血清)0.5 mL混勻，37 ℃水浴保溫30 min，0 ℃冰箱中止反應，取上清液用紫外分光光度計于540 nm處測定吸光度(A)值，以A值表示溶血素抗體生成量，以腹腔上清液的A值為指標，進行組間比較。

1.2.6 小鼠遲發型超敏反應(DTH)實驗 取小鼠50只，雌雄各半，隨機分成5組，分別為模型對照組(灌胃蒸餾水20 mL/kg)、潑尼松組(灌胃潑尼松片0.03 g/kg)、秦七風濕大、中、小劑量組(分別灌胃秦七風濕2.0，1.0，0.5 g/kg)。各組小鼠10% Na2S腹部剃毛(3 cm×3 cm)，均勻涂抹1%DNFB 10 μL致敏；當日灌胃給藥，灌胃體積均為20 mL/kg，1次/d，連續給藥8 d，然后以1%DNFB 10 μL均勻涂于小鼠右耳兩面進行抗原攻擊，24 h脫頸椎處死小鼠，沿耳郭基線減下左右耳片，稱重，計算腫脹度，以耳郭腫脹度為指標進行組間比較。

腫脹度=右耳片重量-左耳片重量。

2 結果

2.1 對小鼠醋酸扭體鎮痛的影響 與空白對照組比較，陽性藥嗎咖組和秦七風濕膠囊大劑量組可明顯改善0.6%冰醋酸溶液所致小鼠扭體次數，差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)(表1)，秦七風濕膠囊中劑量和小劑量組對小鼠扭體次數的影響與對照比較，差異無統計學意義(P>0.05)，陽性對照嗎咖組的鎮痛率為96.56%，秦七風濕膠囊大、中、小劑量的鎮痛率在21.03%～64.80%。

2.2 對小鼠熱痛反應潛伏期的影響 如表2所示，與對照組比較，陽性藥嗎啡組和秦七風濕大、中、小劑量組均可明顯提高痛閾值，差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01，P<0.001)。

2.3 對大鼠足尖壓痛閾值的影響 從表3結果可見，與空白對照組比較，陽性藥美洛西康組和秦七風濕大劑量組均可提高大鼠足尖壓痛的痛閾值，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.4 對小鼠尾壓痛的影響 由表4結果可以看出，與空白對照組比較，秦七風濕大、中、小劑量組均可明顯提高小鼠尾壓痛的痛閾值，差異有統計學意義(P<0.001，P<0.01)。

表1 秦七風濕膠囊對小鼠醋酸致痛的影晌

注：與空白對照組比較，*P<0.01，**P<0.01

表2 秦七風濕膠囊對小鼠熱痛反應潛伏期的影響

注：與空白對照組比較，*P<0.01，**P<0.01，***P<0.001

表3 秦七風濕膠囊對大鼠足尖壓痛的影響

注：與空白組比較，*P<0.05**P<0.01***P<0.001

表4 秦七風濕膠囊對小鼠尾壓痛的影響

注：與空白組比較，*P<0.05**P<0.01***P<0.001

2.5 秦七風濕膠囊對小鼠免疫器官重量的影響 結果如表5所示，與空白對照組比較，秦七風濕膠囊組的脾臟指數與胸腺指數差異均無統計學意義，陽性對照藥潑尼松組的差異有統計學意義(P<0.001)。

表5 秦七風濕膠囊對小鼠免疫器官重量的影響

注：與空白對照組比較，*P<0.05**P<0.01***P<0.001

2.6 秦七風濕膠囊對小鼠溶血素抗體的影響 結果見表6，陽性對照藥潑尼松組和秦七風濕大、中劑量組動物其上清液在540 nm處的A降低，與對照組比較差異均有統計學意義(P<0.001，P<0.01)。

表6 秦七風濕膠囊對小鼠溶血素抗體生成的影晌

注：與對照組比較，***P<0.001**P<0.01

2.7 秦七風濕膠囊對二硝基氟苯(DNFB)所致小鼠遲發型超敏反應(DTH)的影響 如表7所示，陽性對照藥潑尼松組和秦七風濕大、中劑量組可明顯降低DNFB所致小鼠耳郭腫脹度，與模型組比較，差異有統計學意義(P<0.001，P<0.01)。陽性對照藥潑尼松組和秦七風濕大、中劑量組可明顯降低DNFB所致小鼠耳郭腫脹度，與潑尼松組比較，差異有統計學意義(P<0.001，P<0.01)，說明秦七風濕膠囊對由DNFB引起的遲發型超敏反應具有抑制作用。

表7 秦七風濕膠囊對小鼠DNFB所致DTH的影響

注：與模型組比較，***P<0.001**P<0.01

3 討論

類風濕關節炎是一種累及周圍關節為主的多系統性炎性反應性自身免疫疾病。臨床可用的西藥和中藥能緩解類風濕關節炎性反應狀，但是大多因耗費太大或者不良反應而無法被普遍接受。因此，目前針對類風濕關節炎治療的藥物開發仍是國內外研究的熱點。秦七風濕方是由珠子參，秦艽和山茱萸組成的臨床經驗方，以湯劑在臨床應用多年，發現其對類風濕性關節炎療效顯著，且未發現明顯毒性。秦七風濕膠囊是臨床擬用于治療類風濕關節炎的中藥制劑。本研究通過構建醋酸扭體、小鼠甩尾、大鼠足趾壓痛及小鼠尾壓痛試驗動物模型，發現秦七風濕膠囊能顯著減少醋酸引起的扭體次數，提高小鼠對熱刺激的痛閾值，同時能夠減輕大鼠和小鼠壓痛的致痛程度，以上結果均表明秦七風濕膠囊具有良好的鎮痛作用。此外，本文還通過研究了秦七風濕膠囊給藥對小鼠免疫器官重量，溶血素抗體生成及二硝基氟苯所致小鼠遲發型超敏反應的影響，結果發現該藥對小鼠溶血素抗體生成和由二硝基氟苯引起的遲發型超敏反應均顯示出抑制作用，說明該藥對機體免疫功能具有一定的抑制作用。本研究初步揭示了秦七風濕膠囊的鎮痛作用及對免疫功能的影響，這些研究結果為將秦七風濕膠囊發展為用于治療類風濕關節炎的臨床新藥提供理論依據。

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AnalgesicEffectofQinqiRheumatismCapsuleandItsInfluenceonImmuneFunction

Wang Mei1,Tang Zhishu2,Zhou Rui2,Song Zhongxing2

(1TheAffiliatedHospitalofShaanxiUniversityofChineseMedicine，Xianyang712000,China; 2ShaanxiUniversityofChineseMedicine/ShaanxiCollaborativeInnovationCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrialization/ShaanxiProvinceKeyLaboratoryofNewDrugsandChineseMedicineFoundationResearch,Xianyang712083,China)

Objective:To study the analgesic effect of Qinqi Rheumatism Capsule and its effect on immune function through various animal models.MethodsThe analgesic effects of Qinqi Rheumatism Capsule were investigated on animal models by acetic acid twisting method,the method of flicking tail,toes pain tenderness and tail pain tenderness test; The influence of Qinqi Rheumatism Capsule on the immune function in mice was investigated by mouse immune organ′ weight test,serum hemolysin antibody test and dinitrofluorobenzene (DNFB)-induced delayed-type hypersensitivity (DTH) model.ResultsQinqi Rheumatism Capsule significantly reduced the number of acetic acid-induced writhing,improved the thermal pain threshold in mice,and alleviated the pain degree in toes and tail pain tenderness,indicating that the analgesic effect of Qinqi Rheumatism Capsule; In addition,it could also inhibit the production of hemolysin antibody and delayed-type hypersensitivity induced by DNFB,suggesting the inhibitory effect of Qinqi Rheumatism Capsule on innate immune and cellular immune function.ConclusionQinqi Rheumatism Capsule has obvious analgesic and inhibitory effect on immune function.This study provides a pharmacological basis for Qinqi Rheumatism Capsule′s clinical treatment of rheumatoid arthritis.

Qinqi Rheumatism Capsule; Analgesic effect; Immune function

國家“十二五”重大新藥創制科技重大專項(2011ZX09401-308-036)；陜西省重點科技創新團隊(2012KTC-20)；陜西省科技資源開放共享平臺項目(2015FWPT-01)

王梅(1971.05—)，女，碩士，主任藥師，藥劑科主任，研究方向:中藥藥效物質基礎及質量控制，E-mail：wangm1379@163.com

唐志書(1972.09—)，男，博士，教授，副校長，研究方向:中藥新產品研發與中藥制備新技術的應用研究，E-mail：tzs6565@163.com

R392

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.11.044

(2016-12-30收稿 責任編輯：楊覺雄)