用HPLC—熒光檢測同時測定阿莫西林和克拉維酸鉀濃度

王立東+聶彥彥

摘 要：目的：本文主要使用了隨機交叉給藥方法針對12名男性進行調查。方法：實驗人員選擇試驗藥阿莫西林及其克拉維酸鉀干混懸劑的比例為4：1，以及對照藥阿莫西林和相關克拉維酸鉀干混懸劑比例也同樣為4：1，精準量取50Omg的阿莫西林，125mg的克拉維酸鉀，這個時候實驗人員通過人體生物利用度及其藥代動力學進行了詳細的比較。實驗人員使用了HPLC熒光對這兩種藥品存在的含量進行了檢測。結果：無論是試驗藥還是對照藥里面阿莫西林的Tmax1.58±0.36和1.56±0.34h；而Cmax13.94±2.20和13.38±2.67mg·L-1；T121.57±0.19和1.53±0.23h；AUC52.28±8.22和50.24±9.44mg·L-1，對于生物利用度來說，為104.89%±7.73%。克拉維酸鉀的Tmax0.96±0.37和1.06±0.50h；Cmax2.13±0.44和2.69±0.99mg·L-1，T121.27±0.19和1.28±0.32h；AUC5.38±0.83和5.66±1.04·h·L-1；相對生物利用度95.91%±11.21%。結論：實驗人員通過對AUC及其Cmax通過方差的形式進行分析，就Tmax而言，實驗人員主要使用非參數法進行統計的，在這兩種制劑里面，無論是阿莫西林還是克拉維酸鉀這兩個小組呈現出的都是生物等效。

關鍵詞：阿莫西林；克拉維酸；生物等效性

阿莫西林以及相關的克拉維酸鉀干混懸劑是在比例為4：1的成分下得到的復方制劑，并且每一包都含有125mg的阿莫西林，31.25mg的克拉維酸鉀。本實驗的主要目標是實驗人員將試驗藥阿莫西林及其相關的克拉維酸鉀干混懸劑在4：1的比例下能夠和對照藥阿莫西林及其相關的克拉維酸鉀干混懸劑在4：1的比例存在的生物利用度進行詳細的對比。在以往發展的過程中，實驗人員大部分是對阿莫西林及其相關的克拉維酸鉀存在的血藥進行檢測的，并利用生物法來對阿莫西林及其相關的克拉維酸鉀分別檢測的，這樣做會致使檢測流程較為復雜，并且有著較多的工作量，尤其是對克拉維酸鉀檢測增加了一定的難度。而依據國內國外文獻可以得知，采取HPLC-熒光檢測法來對這兩種物質進行檢測，然而由于克拉維酸鉀僅僅是在末端紫外吸收，這個時候實驗人員需要通過咪唑生化以后哦再進行檢測，該方法往往會受到相關因素帶來的影響。在本文中第一次嘗試使用HPLC-熒光法對這兩種藥品的濃度進行檢測，有著顯著的效果，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

試驗藥品：阿莫西林一克拉維酸鉀（：41）干混懸劑（每包125：31.251119/包），批號981130。

對照藥品：阿莫西林一克拉維酸鉀（：41）干混懸劑（每包阿莫西林125mg-克拉維酸31.25mg），批號981111，（95）衛藥準字X-318號。

標準品：阿莫西林含量86.2%，批號0409-9706，由中央衛生部藥品檢定所生產。克拉維酸鉀含量82.7%。

試劑：甲醇（HPLC純），KH2PO4，K2HPO4，苯甲醛，無水乙醇均為分析純試劑。苯甲醛用無水乙醇配制成2%濃度，混勻后避光保存。

1.2 色譜條件

島津LC-10AHPLC儀，RF-10AxL熒光檢測器（ex386nm，em460nm），C-R6A積分儀和95色譜工作站。分析柱HypersilBDSC18200×4.6mm，5um，流動相為甲醇：水（580：520v/v），流速1ml·min-1。

1.3 受試者給藥方法

12名受試者隨機分為兩組，每組6人，首次每組隨機服用試驗藥品或對照藥品，單劑量一次口服阿莫西林500mg，克拉維酸鉀125mg，一周后各組自身交叉服用。受試者在試驗前一周及試驗期間禁忌用其它任何藥物。在試驗前一天晚飯后禁食至第二天早上8：00服藥。用250mg溫開水沖服干混懸劑，服藥后4h允許進統一中餐。取血時間為服藥0.17、0.33、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8h，取靜脈血3ml，肝素抗凝，立即分離血漿后放置-70℃冰箱待測定。

1.4 血漿樣品處理

取血漿0.2ml，加入0.2ml1ol·L-1磷酸緩沖溶液（pH=7.02），用密理博微孔膜在10000轉離心15min，取濾液100μl，加入150μlpH3.80lmol·L-1磷酸緩沖溶液，再加人20μl2%苯甲醛乙醇溶液，混勻，密封于安靚放入100土0.3℃烘箱20min。取出后立即在-18℃冰箱10min冷卻至室溫進樣50ul。以外標法峰高定量。阿莫西林和克拉維酸鉀在本色譜條件下的出峰時間為11.3min和8.7min，空白血漿中無雜質峰干擾。見圖1。

2 結果

2.1 血藥濃度測定方法的評價

2.1.1 方法的專屬性

實驗人員主要通過熒光檢測的方式，對這兩種制劑進行了詳細的檢測，血漿里面沒有含有加多的雜志峰，這樣也較好的說明不會對這兩種制劑的檢測帶來干擾，而且這兩種制劑呈現出來的峰已經處于完全分離的狀態，具體內容請看圖1。本法的專屬性從某種意義上來說要比HPLC-UV法要好一些，沒有較多的雜峰。

2.1.2 回收率和精密度試驗結果

阿莫西林0.20，1.64，1，3.15m.gL-1三個濃度的絕對回收率為80%，克拉維酸鉀的回收率為84%，結果見表1。日內、日間精密度試驗結果見表2。

2.2 藥代動力學參數和相對生物利用度結果

依據相關統計分析結果：對照藥和試驗藥中AUC、Cmax用對數轉換后作多因素方差分析和雙單側t檢驗，凡Tmax用非參數法統計。結果：兩種制劑中阿莫西林經統計，t1，t2均大于t（0.05）=1.812；Cmaxt1=0.580.05，無顯著性差異。阿莫西林和克拉維酸鉀的AUC經（1-2α）90%置信區間計算，結果分別為41.86～62.69和4.70～6.39，試驗藥阿莫西林和克拉維酸鉀分別為52.28和5.38，均落在上述區間。

3 討論

通過以上內容的論述，可以得知：實驗人員通過利用克拉維酸鉀能夠在酸性環境下和適量的苯甲醛乙醇溶液進行充分的反應，進而得到相應的熒光產物，并且能夠在以下兩個波長中進行檢測：一種是ex386nm；另一種是em460nm有著顯著的效果。例如，較好的特異性能、較高的靈敏度等。不僅僅如此，阿莫西林能夠在色譜條件下可以和克拉維酸鉀處于分離的狀態并且一起被檢測。

顯而易見的是，實驗人員在對血漿樣品進行處理的過程中，一般是提前使用濾膜將其完全過濾以后，然后進行衍生化反應，這樣做的目的是有著較高的回收率。在進行試驗的過程中，主要使用了甲醇、乙睛等相關物質，但是得到的回收率不大于50%。出現這種情況的重要因素可能會和蛋白沉淀劑會隨著相關被測物的變化而將蛋白一起帶走，從而出現流失的情況。

依據相關實驗結果可以得知：無論是對照藥還是試驗要中，實驗人員都會阿莫西林的AUC、Cmax、Tmax及其克拉維酸鉀的AUC和Tmax采取恰當的方式進行了分析，得到的結果可以看出兩種制劑沒有明顯的區別。對于Cmax實測值來說，可能會受到采樣的時間、吸收水平等因素的影響存在一定的區別。然而這兩種制劑中，不管是對于吸收量（AUC）來說，還是就吸收速度（Tmax）而言都會當作相應的指標，并且認為這兩種制劑都可以當作生物等效制劑。

參考文獻

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