巢湖藍藻藻藍蛋白穩定性的實驗研究

魯軼男,張發宇,胡淑恒,汪家權

(合肥工業大學 資源與環境工程學院,安徽 合肥 230009)

巢湖藍藻藻藍蛋白穩定性的實驗研究

魯軼男,張發宇,胡淑恒,汪家權

(合肥工業大學 資源與環境工程學院,安徽 合肥 230009)

文章以巢湖新鮮藍藻藻泥為實驗原料,凍融3次后提取獲得藻藍蛋白粗提液,經過兩步鹽析純化得到藻藍蛋白溶液。實驗重點研究了溫度、pH值、凍融次數及添加劑等因素對兩步鹽析后藻藍蛋白溶液穩定性的影響,確定了藻藍蛋白溶液保存的較優條件。結果表明:低溫、pH值為中性條件有利于藻藍蛋白溶液的保存;糖類、防腐劑、抗氧化劑、金屬離子的添加也會影響藻藍蛋白穩定性。

兩步鹽析;純化;藻藍蛋白

水體富營養化是水體中氮、磷、鉀含量過高導致藻類突然性過度增殖的一種自然現象,通常水的顏色呈現綠色或藍色,水體有機物積蓄,破壞了水體的生態平衡[1]。近年來,巢湖水體富營養化日益加重,危害性越來越大。打撈上來的藍藻處理不當會造成嚴重的環境污染。

目前國內外關于水華藍藻資源化研究主要集中在厭氧發酵、好氧堆肥,產品附加值低,經濟效益不高。近年來,從水華藍藻中提取高純度的藻藍蛋白成為巢湖藍藻高附加值資源化的重要方向。研究表明,高純度藻藍蛋白具有良好的功效,如抗炎性[2]、抗癌性[3]、抗過敏性[4]、抗氧化性[5-6]、免疫熒光性[7-8]等。并且藻藍蛋白是一種色素蛋白,具有和普通蛋白質相同的性質,溶于水,不溶于醇和油脂,對熱、光、酸不穩定,在弱酸性和中性條件下較為穩定(pH值在4.5～8.0之間),酸性條件下(pH=4.2)發生沉淀,強堿條件下則脫色。因此針對提取純化后的較高純度的藻藍蛋白,進行穩定性的相關實驗研究,掌握保存純化后的藻藍蛋白的條件就顯得尤為重要。

目前國內外有關藻藍蛋白穩定性的實驗研究開始得到重視[9-16]。本文主要通過凍融破壁方法獲取藻藍蛋白粗提液,再通過兩步鹽析法純化得到藻藍蛋白溶液。重點針對兩步鹽析后的藻藍蛋白溶液,綜合考慮溫度、酸堿度、凍融次數、添加劑等因素對藻藍蛋白穩定性的影響,得到藻藍蛋白較適宜的保存條件,為藻藍蛋白的應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗所用藍藻取自西湖區水華表層20 cm水體處,含水量約96.2%,采集日期為2014年8月4日,室外氣溫37～38 ℃,采集后置于冰箱中冷凍保存,冰箱溫度為-18 ℃。

常用試劑:(NH4)2SO4、HCl、NaOH、濃度為0.002 5 mol/L的磷酸緩沖溶液、葡萄糖、蔗糖、苯甲酸鈉、疊氮化鈉、檸檬酸、抗壞血酸、硫酸鎂、氯化鈣、氯化鉀、硫酸銅。

1.2 儀器與設備

所用儀器設備有:紫外-可見分光光度儀,UV/VIS-1950型(北京普析通用公司);低溫高速離心機,KDC-160HR型(安徽中科中佳儀器公司);冷柜,BC/BD-718DTF型(天長市天一電器有限公司);恒溫攪拌器,85-2A型(江蘇金城國勝儀器廠);數顯酸度計,PHS-25型(中國杭州雷磁分析儀器廠);水浴鍋,HH-2型(上海基瑋試劑儀器設備有限公司)。

1.3 分析方法

藻藍蛋白在620 nm處有最大特征吸收峰,并在280 nm處有吸收峰。藻藍蛋白的純度(P)參考文獻[17]推薦的公式,即

P=A620/A280,

其中,A280、A620分別為藻藍蛋白在280、620 nm處的吸光度。

1.4 制備兩步鹽析后藻藍蛋白溶液

反復凍融冷凍保存的新鮮藍藻藻泥3次,取解凍后的藍藻破壁液在4 ℃、8 000 r/min的離心機中離心20 min,上清液用4層普通紗布過濾,得到藻藍蛋白粗提液。

根據文獻[18-19]的實驗研究,向藻藍蛋白粗提液中投加1.0 mol/L的硫酸銨溶液進行一步鹽析,4 ℃離心后去除底層沉淀。繼續投加硫酸銨進行兩步鹽析,硫酸銨的濃度增加至2 mol/L,4 ℃下離心20 min后保留沉淀,用磷酸緩沖溶液(0.002 5 mol/L)溶解獲得藻藍蛋白溶液。

1.5 藻藍蛋白穩定性單因素試驗

1.5.1 溫度對藻藍蛋白穩定性的影響

取等體積的藻藍蛋白溶液,分別置于-18、4、35、50 ℃溫度下,每天測定1次藻藍蛋白純度,研究溫度對藻藍蛋白穩定性的影響。

1.5.2 pH值對藻藍蛋白穩定性的影響

調節藻藍蛋白溶液的pH值分別為2、3、4、5、6、7、8、9、10,置于冷藏條件(4 ℃)下,測定藻藍蛋白純度,研究酸堿度對藻藍蛋白穩定性的影響。

1.5.3 反復凍融對藻藍蛋白穩定性的影響

取適量藻藍蛋白溶液,置于冷凍(-18 ℃)條件下,反復凍融解凍后測定藻藍蛋白的純度,研究反復凍融對藻藍蛋白穩定性的影響。

1.5.4 糖類對藻藍蛋白穩定性的影響

稱取不同質量的蔗糖、葡萄糖,溶于水中,調節蔗糖、葡萄糖的質量分數分別為0、1%、2%、4%、8%,將等體積藻藍蛋白溶液置于上述溶液中,冷藏保存,隔天測定藻藍蛋白純度,研究糖類對藻藍蛋白穩定性的影響。

1.5.5 防腐劑對藻藍蛋白穩定性的影響

稱取不同質量的疊氮化鈉、苯甲酸鈉,溶于水中,調節疊氮化鈉、苯甲酸鈉的質量分數分別為0、2%、4%、6%、8%、10%,將等體積藻藍蛋白溶液置于上述溶液中,冷藏條件下隔天測定藻藍蛋白純度,研究防腐劑對藻藍蛋白穩定性的影響。

1.5.6 抗氧化劑對藻藍蛋白穩定性的影響

配制檸檬酸和抗壞血酸溶液,調節檸檬酸和抗壞血酸的質量分數分別為0、2%、4%、6%、8%、10%,取等體積藻藍蛋白溶液置于上述溶液中,24 h后測定藻藍蛋白的純度,研究抗氧化劑對藻藍蛋白穩定性的影響。

1.5.7 金屬離子對藻藍蛋白穩定性的影響

取不同質量氯化鈉、氯化鉀、硫酸銅、氯化鈣,溶于水中,調節氯化鈉、氯化鉀、硫酸銅、氯化鈣的質量分數分別為0、2%、4%、6%、8%、10%,取等體積藻藍蛋白溶液置于上述溶液中,冷藏保存后測定藻藍蛋白純度,研究金屬離子對藻藍蛋白穩定性的影響。

2 結果與分析

2.1 溫度對藻藍蛋白穩定性的影響

實驗結果如圖1所示。

由圖1可知,4種溫度下藻藍蛋白純度均呈下降的趨勢,溫度越高,純度下降越明顯。其中,溫度為-18 ℃時藻藍蛋白較為穩定,1周后,藻藍蛋白純度基本不變;而溫度為50 ℃時,藻藍蛋白穩定性最差,純度隨時間急劇下降,1周后,蛋白純度基本降為0。根據上述分析,藻藍蛋白應保存在較低溫度環境下,-18 ℃以下溫度最為適宜。

圖1 溫度對藻藍蛋白穩定性的影響

2.2 酸堿度對藻藍蛋白穩定性的影響

實驗結果如圖2所示。

圖2 酸堿度對藻藍蛋白穩定性的影響

由圖2可知,過酸(pH值為2和3)或過堿(pH=10)條件下,藻藍蛋白溶液瞬間變性,純度降低,溶液顏色由藍色變為灰綠色;在pH值為5～8之間,藻藍蛋白溶液有較好的穩定性,溶液仍為鮮亮的藍色。

將pH值為5～8的藻藍蛋白溶液置于冷藏條件(4 ℃)下,待到1周后,pH值為6或7時,藻藍蛋白穩定性較高,其純度下降率分別為5%和6%,純度隨時間變化不明顯,藻藍蛋白;pH值為5或8時,藻藍蛋白純度較低,隨時間下降明顯。根據上述分析可知,中性偏酸性條件有利于藻藍蛋白保存。

2.3 反復凍融對藻藍蛋白穩定性的影響

實驗結果如圖3所示。

圖3 反復凍融次數對藻藍蛋白穩定性的影響

由圖3可知,凍融次數越多,藻藍蛋白純度越小。凍融10次后,藻藍蛋白純度下降率為65%。因此,應避免反復凍融藻藍蛋白。

2.4 糖類對藻藍蛋白穩定性的影響

不同質量分數葡萄糖、蔗糖溶液對藻藍蛋白穩定性的影響分別如圖4、圖5所示。

圖4 不同質量分數葡萄糖溶液的影響

圖5 不同質量分數蔗糖溶液的影響

由圖4和圖5可知,藻藍蛋白溶液在葡萄糖和蔗糖這2種糖類的4個不同質量分數下,4 ℃放置1周,較之對照組,都能保持良好的穩定性。糖類質量分數為4%時,對蛋白的保護效果最好,溶液仍然呈鮮亮的藍色,而對照組,純度降低明顯,藻藍蛋白的顏色逐漸變淡。不同質量分數的葡萄糖和蔗糖溶液對藻藍蛋白的保護性不同,按保護程度從大到小對其質量分數排序依次為4%、2%、1%、8%,說明質量分數過高或過低都會降低糖類對蛋白的保護性。

2.5 防腐劑對藻藍蛋白穩定性的影響

不同質量分數疊氮化鈉、苯甲酸鈉溶液對藻藍蛋白穩定性的影響分別如圖6、圖7所示。

圖6 不同質量分數疊氮化鈉溶液的影響

圖7 不同質量分數苯甲酸鈉溶液的影響

由圖6可知,藻藍蛋白溶液在疊氮化鈉的4個質量分數下,4 ℃放置1周,較之對照組,均能保持良好的穩定性。其中,質量分數為1%的疊氮化鈉溶液對藻藍蛋白的保護性最好;質量分數為8%的疊氮化鈉溶液對藻藍蛋白的保護性最差。不同質量分數的疊氮化鈉溶液對藻藍蛋白的保護性不同,按保護程度從大到小對其質量分數排序依次為1%、2%、4%、8%,說明其質量分數越低,對藻藍蛋白溶液保護性越好。目測顏色變化,對照組溶液顏色逐漸變淺,但在其他各種質量分數的疊氮化鈉溶液中藻藍蛋白顏色也較淺。由此可得到,低質量分數的疊氮化鈉溶液對藻藍蛋白溶液都有保護作用,但護色效果不佳。

由圖7可知,不同質量分數苯甲酸鈉的添加均嚴重破壞藻藍蛋白的穩定性,導致藻藍蛋白變性,蛋白質沉淀現象明顯。1 h后,藻藍蛋白的純度下降率為95%,由此可得,苯甲酸鈉不可作為藻藍蛋白溶液的防腐劑。

2.6 抗氧化劑對藻藍蛋白穩定性的影響

實驗結果如圖8所示。

圖8 不同質量分數檸檬酸、抗壞血酸的影響

從圖8可知,不同質量分數的檸檬酸和抗壞血酸的添加均導致藻藍蛋白嚴重變性,蛋白質沉淀現象明顯。1 h后,藻藍蛋白純度下降率分別為80%和95%。因此,藻藍蛋白的保存應避免與檸檬酸或抗壞血酸接觸。

2.7 金屬離子對藻藍蛋白穩定性的影響

不同質量分數Na+、K+、Cu2+、Ca2+對藻藍蛋白穩定性的影響分別如圖9～圖11所示。

圖9 不同質量分數Na+對藻藍蛋白穩定性的影響

圖10 不同質量分數K+對藻藍蛋白穩定性的影響

圖11 不同質量分數Cu2+、Ca2+對藻藍蛋白穩定性的影響

由圖9可知,藻藍蛋白溶液在質量分數為4%～10%的Na+溶液中,4 ℃放置1周,較之對照組,均能保持良好的穩定性;而質量分數為2 %的Na+溶液不利于藻藍蛋白溶液的保存,純度明顯低于對照組。其中質量分數為4%～10%的Na+溶液對藻藍蛋白溶液的保護性不同,按保護程度從大到小對質量分數排序依次為8%、10%、6%、4%,即離子質量分數越大,溶液穩定性越高。由此可得到,Na+溶液有利于藻藍蛋白溶液的保存,溶液質量分數為8%時最為適宜。

由圖10可知,藻藍蛋白溶液在K+的5個質量分數下,1～5 d內,藻藍蛋白純度均低于對照組,第6天后,純度有所上升,高于對照組。其中質量分數2%的K+使蛋白質純度下降趨勢最為明顯,K+質量分數在4%～10%間,雖然質量分數有差別,但對藻藍蛋白穩定性影響不明顯。綜合考慮可得到,K+溶液不適用于藻藍蛋白溶液的保存。

由圖11可知,不同質量分數的Cu2+和Ca2+的添加均嚴重破壞了藻藍蛋白的穩定性,藻藍蛋白的純度隨時間下降明顯,24 h后,蛋白質有明顯的沉淀現象,藻藍蛋白純度下降率分別為66%和94%。根據上述分析可得到,藻藍蛋白溶液的保存應避免接觸Cu2+和Ca2+。

3 結 論

在巢湖藍藻藻藍蛋白穩定性的實驗研究中,本文研究了溫度、凍融次數、酸堿度及糖類、氧化劑、防腐劑、金屬離子的添加對其穩定性的影響。主要結論有:

(1) 藻藍蛋白不耐高溫,4 ℃以下有利于藻藍蛋白的保存;中性條件下有利于藻藍蛋白的保存;反復凍融會降低藻藍蛋白的純度。

(2) 抗氧化劑會迅速與蛋白質發生化學反應,不利于藻藍蛋白溶液的保存。

(3) 不同質量分數的蔗糖與葡萄糖均能有效提高蛋白質的穩定性,糖的保護作用可能是因為糖的羥基與蛋白質形成氫鍵取代水,保證蛋白質的穩定性,溶液中它們易結合水分子發生水合作用,增加溶液黏性,減緩晶核生長,從而保護藻藍蛋白[20]。

(4) 疊氮化鈉在一定程度上能有效維持藻藍蛋白的穩定性,而苯甲酸鈉不適合作為藻藍蛋白的防腐劑。

(5) 金屬離子會影響藻藍蛋白的穩定性,不同質量分數的Na+溶液對藻藍蛋白溶液穩定性影響不同,較高質量分數的Na+溶液有利于藻藍蛋白溶液的保存,其中質量分數8%最為適宜;K+離子對藻藍蛋白穩定性的影響不大;Cu2+和Ca2+會導致藻藍蛋白變性,出現蛋白質沉淀現象,造成這種現象的發生是由于金屬離子與蛋白質發生發應,破壞蛋白質的結構,使蛋白質交聯、聚集,從而形成沉淀[21]。

(6) 實驗過程中不同批次的藻類,不同純度的藻藍蛋白之間穩定性存在差異,需要進一步研究。藻藍蛋白溶液穩定性研究操作簡單、可行性強,符合經濟環保的科學理念,為藻藍蛋白的保存及后期的實驗研究提供了科學依據。

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ExperimentalstudyofthestabilityofphycocyaninfrombluealgaeinChaohuLake

LU Yinan,ZHANG Fayu,HU Shuheng,WANG Jiaquan

(School of Resources and Environmental Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

The crude extracts of phycocyanin were obtained by three times freeze-thaw for fresh blue algae from Chaohu Lake. Extraction and purification of phycocyanin were performed by two-step salting-out. The effect of the temperature, pH value, number of freeze-thaw and additive on the stability of phycocyanin solution after two-step salting-out was studied, and the best condition to preserve the phycocyanin solution was determined. The results show that low temperature and neutral conditions are conducive to the preservation of the phycocyanin solution, and the addition of sugar, preservatives, antioxidants and metal ions affects the stability of phycocyanin.

two-step salting-out; purification; phycocyanin

2016-04-18；

2016-05-16

國家“十二五”科技重大專項資助項目(2012ZX07103-004)

魯軼男(1991-),女,安徽桐城人,合肥工業大學碩士生;

張發宇(1983-),男,安徽安慶人,博士，合肥工業大學講師,通訊作者,E-mail:13655551436@139.com;

汪家權(1957-),男,安徽太湖人,博士，合肥工業大學教授,博士生導師.

10.3969/j.issn.1003-5060.2017.11.024

TQ464.7

A

1003-5060(2017)11-1557-06

(責任編輯 張淑艷)