桑/柞蠶絲不同溶解體系再生絲素蛋白性能研究

肖 露，楊旭超，余衛華，王佳麗，唐仕成

(四川省絲綢工程技術研究中心，四川 成都 610031)

桑/柞蠶絲不同溶解體系再生絲素蛋白性能研究

肖 露，楊旭超，余衛華，王佳麗，唐仕成

(四川省絲綢工程技術研究中心，四川 成都 610031)

通過對凝膠時間、蛋白質分子質量測試、氨基酸分析、FT-IR等方法的分析，研究了不同溶解體系下制備的再生桑蠶絲素、柞蠶絲素蛋白溶液穩定性差異和再生絲素膜組分、結構的變化。結果表明：桑蠶絲素的溶解以CaCl2-H2O-C2H5OH體系為佳，Ca(NO3)2-4H2O體系則更有利于對柞蠶絲素的溶解；絲素蛋白不同溶解體系下制備的絲素溶液分子量大小與穩定性成反比關系；在制備的再生絲素中桑蠶蛋白膜以非極性小側基氨基酸為主；柞蠶蛋白膜以極性和非極性混合側基氨基酸為主；再生桑蠶絲素蛋白分子構象為無規卷曲和β-折疊，并有由前向后的結構轉化，再生柞蠶絲素蛋白以無規卷曲、α-螺旋和β-折疊的共存結構為主，并有按前序的結構轉化。

溶解體系；再生絲素蛋白；穩定性；分子構象

蠶絲作為傳統天然紡織原料由于其優良的柔韌性、吸濕性、透氣性和優雅的光澤一直被人們所熟知，隨著紡織科學、材料科學和生命科學的交叉滲透，對蠶絲素蛋白的研究擴展到分子水平。在生物醫用材料領域，再生桑蠶絲素蛋白(SF)以其良好的透氧性[1]、生物相容性，濕態抵抗酶解能力，附著率和增殖率[2]等優異性能和巨大潛力得到國內外生物材料界的廣泛認可，且從生物整體、細胞、分子生物學三個方面證明了桑蠶絲素蛋白是性能優良的生物材料；而柞蠶絲素蛋白(TSF)因其氨基酸序列中含有較多能與細胞發生特異性相互作用的精氨酸(Arg)-甘氨酸(Gly)-天門冬氨酸(Asp)三肽序列(RGD)結構[3]，表現出更強的細胞粘附性[4]也備受業界關注。為了給再生絲素蛋白生物醫用材料的制備提供實驗依據和進一步應用桑蠶絲素與柞蠶絲素，本文從不同溶解體系下制備的桑、柞蠶再生絲素蛋白分子量、氨基酸組成和超分子結構等方面進行探討。

蠶絲素溶解溶劑主要包括酸、堿、鹽或者酶溶液等，其中酸、堿、酶能將蠶絲素降解為小分子肽鏈，不利于成膜等大分子狀態，蛋白質結構也會發生較大變化[5]。因此選用中性溶劑高濃度鹽、鹽與有機液體的多元溶劑，分別對桑蠶絲及柞蠶絲進行溶解，并通過凝膠時間、再生蛋白質分子量測定，分析在不同體系下制備的再生絲素蛋白溶液的溶解性、穩定性差異，再通過氨基酸的測定及傅里葉紅外光譜法(FT-IR)分析，研究其組分及超分子結構的變化。

1 試驗部分

1.1 材料與儀器

主要試驗材料：桑蠶絲，柞蠶絲，透析袋，Ca(NO3)2，LiSCN，CaCl2，C2H5OH，LiBr，丙烯酰胺，甲叉雙丙烯酰胺，十二烷基硫酸鈉，三羥甲基氨基甲烷，過硫酸銨，四甲基乙二胺，溴酚藍，甘油，冰乙酸，甲醇，考馬斯亮藍等。

主要試驗儀器：恒溫水浴鍋，恒溫生化培養箱，DYY-6C電泳儀，HITACHI-835-50氨基酸分析儀，Nicolet470傅里葉紅外光譜儀。

1.2 再生絲素蛋白制備

1.2.1 再生桑蠶絲素蛋白的制備

將桑蠶絲按1∶50的浴比在0.5% Na2CO3溶液中煮沸脫膠2次，每次30 min。用去離子水清洗凈后，在烘箱中(60 ℃)干燥制備完全脫膠桑蠶絲。將完全脫膠桑蠶絲按1∶10的浴比分別在CaCl2-H2O-C2H5OH(摩爾比為1∶8∶2)的溫度(80±2) ℃三元混合溶液和溫度(60±2) ℃ LiBr：C2H5OH(質量比40∶60)體系中充分溶解。將所得溶液分裝于透析袋(截留分子量12 kD)在蒸餾水中充分透析(時間3天，蒸餾水6 h更換一次)制得再生桑蠶絲素蛋白溶液。

1.2.2 再生柞蠶絲素蛋白的制備

將柞蠶繭按照1∶20的浴比在0.5% Na2CO3溶液中煮沸脫膠3次，每次30 min。用去離子水清洗凈后，在烘箱中(60 ℃)干燥制備完全脫膠柞蠶絲。將完全脫膠柞蠶絲分別按照1∶20的浴比在Ca(NO3)2-4H2O的溶液中(溫度100 ℃)和浴比1∶35，9 mol/L的LiSCN溶液中(溫度60 ℃、超聲震蕩)充分溶解。最后，將所得溶液分裝于透析袋(截留分子量12 kD)在蒸餾水中充分透析(時間3天，蒸餾水6 h更換一次)制得再生柞蠶絲素蛋白溶液。

1.3 表征方法

1.3.1 再生絲素溶液凝膠化時間的測定

將不同溶解體系制備的再生絲素溶液濃度調整到10%。分別精確量取各種不同溶液5 ml置于燒杯中，保鮮膜封口，放置于37 ℃的恒溫生化培養箱內，觀察并記錄凝膠化時間。

1.3.2 再生絲素蛋白分子質量測定

采用SDS-PAGE凝膠電泳方法檢測[6]。次高分子質量蛋白質配置7%分離膠，低分子質量標準蛋白配置14%分離膠，另分別配置5%濃縮膠。取10 μL標準蛋白溶解液并加入緩沖液10 μL，采用DYY-6C電泳儀，用10 mA電流完成濃縮膠電泳過程，在20 mA下完成分離膠電泳過程。電泳結束后用考馬斯亮藍染色，再用脫色液(冰乙酸75 ml，甲醇50 ml，加蒸餾水定容至1 000 ml)進行脫色。

1.3.3氨基酸檢測

將不同溶解體系的再生絲素蛋白在37 ℃的生化培養箱中干燥成膜。用6 mol/dm3HCl于110 ℃水解再生蠶絲素蛋白膜18 h，水解產物用水稀釋到25 mg/100 ml，用HITACHI-835-50氨基酸分析儀測定氨基酸組成。

1.3.4 遠紅外光譜(FT-IR)測定

將不同溶解體系的再生絲素蛋白在37 ℃的生化培養箱中干燥成膜，直接用Nicolet470傅里葉紅外光譜儀對制成的膜進行測試。

2 結果與討論

2.1 絲素蛋白不同溶解體系溶解能力比較

桑、柞蠶絲素纖維在不同體系中溶解，溶解時間和透析液物理現象如表1所示。在桑蠶絲素的溶解過程中，LiBr-C2H5OH溶解溫度更低、溶解時間更短，其溶解能力強于CaCl2-H2O-C2H5OH，對柞蠶絲素的溶解，LiSCN溶解能力比Ca(NO3)2-4H2O更強且后者尚未完全溶解。Ca2+與蠶絲素中的酪氨酸、絲氨酸基配位并形成配合物，使得絲素膨潤并逐漸溶解；LiBr、LiSCN溶液則通過離子較強的極性破壞絲素蛋白分子間作用力，從而促使絲素的溶解。透析后，再生桑蠶絲素溶液為淺黃色而再生柞蠶絲素為乳黃色。

表1 不同溶解體系絲素纖維溶解時間及透析液物理現象

2.2 不同溶解體系對再生絲素蛋白溶液穩定性分析

再生絲素蛋白溶液的穩定性對溶液濃度、環境溫度、鹽離子及pH值表現出較強的敏感性。在特定的試驗條件下控制這些因素，通過凝膠化時間的測定來表征不同溶解體系絲素溶液的穩定性，測試結果如表2所示。通過比較不同溶解體系的絲素溶液凝膠化時間，LiBr-C2H5OH桑蠶絲素凝膠化時間最短為23 h，其他3種溶液凝膠化時間相差不大分別為29、30、32 h。

表3為不同溶解體系制取的再生絲素蛋白SDS-PAGE電泳測試蛋白分子量分布。對桑蠶絲素的溶解，CaCl2-H2O-C2H5OH體系分子質量分布在30.96～86.7 kD，高分子質量的長肽鏈溶解徹底，溶液中以小分子肽鏈為主，絲素蛋白分子質量較低；LiBr-C2H5OH體系分子質量則在33.5～136.8 kD，說明對絲素蛋白的溶解程度相對較低，溶液中多為較高分子質量的絲素肽鏈，絲素蛋白分子質量較高。對柞蠶絲素的溶解，兩種體系降解能力相當，分子質量分別為25.6～50.2 kD、27.6～75.8 kD，Ca(NO3)2-4H2O溶解體系對絲素的溶解最徹底，溶液中基本為小分子肽鏈，絲素蛋白分子質量最低。

結合表2、表3分析結果，不同溶解體系再生絲素蛋白溶液穩定性與分子量分布呈反比關系，絲素蛋白分子量越大分布越廣，溶液凝膠化時間越短，溶液越不穩定。用LiBr-C2H5OH溶解的桑蠶絲素溶液穩定性最差，其他3種體系絲素溶液穩定性相當。

2.3蠶絲素不同溶解體系對氨基酸組成及結構的影響

由表4可見，桑、柞蠶絲素蛋白及其絲素膜氨基酸含量均以脂肪族非極基和極性混合側基氨基酸Gly(甘氨酸)、Ala(丙氨酸)為主，含量在60%以上。桑蠶絲素蛋白組成與柞蠶絲素蛋白相比較，桑蠶絲素氨基酸組成種類更多，而柞蠶絲素Arg(精氨酸)、Ala(丙氨酸)和Asp(天門冬氨酸)的含量相對更高。再生絲素膜與絲素纖維相比氨基酸組成有所下降。根據氨基酸含量的變化比較，對桑蠶絲素的溶解CaCl2-H2O-C2H5OH體系更好，Ca(NO3)2-4H2O體系對柞蠶絲素溶解程度更高。

表2 再生絲素不同溶解體系溶液凝膠化時間

注：pH值7，溫度(37±0.1) ℃，濃度10%。

表3 再生絲素蛋白SDS-PAGE電泳測試蛋白分子量分布

表4 不同溶解體系蠶絲素纖維及再生蠶絲素膜的氨基酸含量 單位：%

桑蠶絲素蛋白結晶構象主要是α-螺旋結構的silkⅠ和β-折疊的silkⅡ。2種溶解體系制備的再生絲素膜紅外光譜圖相似(如圖1所示)，酰胺Ⅰ吸收峰在1 640 cm-1左右，酰胺Ⅱ吸收峰在1 520 cm-1左右，酰胺Ⅲ在1 233 cm-1左右，酰胺Ⅴ在669 cm-1左右。在1 629～1 651 cm-1和1 514～1 531 cm-1之間出現了不同程度的吸收峰。對比絲素蛋白紅外吸收光譜峰[6]，說明2種不同溶解體系的再生桑蠶絲素蛋白膜以無規卷曲和β-折疊結構存在，而且存在著無規卷曲結構到β-折疊結構的轉變。LiBr-C2H5OH溶解體系制備再生絲素膜(樣品A)酰胺Ⅰ特征峰1 641 cm-1，酰胺Ⅱ特征峰1 531 cm-1，酰胺Ⅲ特征峰1 233 cm-1，酰胺Ⅴ在669 cm-1。CaCl2-H2O-C2H5OH溶解體系制備再生絲素膜(樣品B)酰胺Ⅰ特征峰1 632 cm-1，酰胺Ⅱ特征峰1 515 cm-1，酰胺Ⅲ特征峰1 230 cm-1，酰胺Ⅴ在640 cm-1。

A：LiBr-C2H5OH，B：CaCl2-H2O-C2H5OH圖1 不同溶解體系再生桑蠶絲素膜紅外光譜圖

A：Ca(NO3)2-4H2O，B：LiSCN圖2 不同溶解體系再生柞蠶絲素膜紅外光譜圖

相對于桑蠶絲素，柞蠶絲素蛋白分子構象比較復雜，α-螺旋和β-折疊結構和無規卷曲結構共存。2種溶解體系制備的再生絲素膜紅外光譜圖相似(如圖2所示)，酰胺Ⅰ吸收峰在1 629 cm-1左右，酰胺Ⅱ吸收峰在1 545和1 516 cm-1左右，酰胺Ⅲ在1 236 cm-1左右，酰胺Ⅳ吸收峰在966 cm-1，在1 510～1 530 cm-1出現了不同程度的吸收峰。說明2種不同溶解體系的再生柞蠶絲素蛋白以無規卷曲、α-螺旋和β-折疊結構共存為主，而且存在著無規卷曲結構到α-螺旋和β-折疊結構的轉變。Ca(NO3)2-4H2O溶解體系制備再生絲素膜(樣品A)酰胺Ⅰ特征峰1 629 cm-1，酰胺Ⅱ特征峰1 545 cm-1和1 516 cm-1，酰胺Ⅲ特征峰1 236 cm-1，酰胺Ⅳ特征峰966 cm-1。LiSCN溶解體系制備再生絲素膜(樣品B)酰胺Ⅰ特征峰1 629 cm-1，酰胺Ⅱ特征峰1 543 cm-1和1 530cm-1，酰胺Ⅲ特征峰1 233 cm-1，酰胺Ⅳ特征峰965 cm-1。

3 結論

(1)桑蠶絲素的溶解以CaCl2-H2O-C2H5OH體系為佳，Ca(NO3)2-4H2O體系則更有利于對柞蠶絲素的溶解。

(2)不同溶解體系下制備的絲素溶液分子量分布與穩定性不同，且分子量與穩定性成反比關系。LiBr-C2H5OH制備的桑蠶絲素溶液分子量分布最大，穩定性也最差；其他3種溶解體系穩定性、分子量分布相當，CaCl2-H2O-C2H5OH體系制備的桑蠶絲素溶液與LiSCN體系制備的柞蠶絲素溶液，分子量分布、穩定性最為相近。

(3)不同溶解體系下制備的再生絲素蛋白氨基酸含量有所差異，且對比纖維絲素蛋白，氨基酸含量均有所下降；在制備的再生絲素中桑蠶蛋白膜以非極性小側基氨基酸—乙氨酸、丙氨酸和絲氨酸為主，柞蠶蛋白膜則以極性和非極性混合側基氨基酸—精氨酸、天門冬氨酸和丙氨酸為主。

(4)再生桑蠶絲素蛋白分子構象以無規卷曲和β-折疊結構存在，并由無規卷曲結構到β-折疊結構的轉變；再生柞蠶絲素蛋白以無規卷曲、α-螺旋和β-折疊結構共存為主，而且由無規卷曲結構到α-螺旋和β-折疊的結構轉變。

[1] MINOURA N, TSUKADA M, NAGURA M. Fine structure and oxygen permeability of silk fibroin membrane treated with methanol[J]. Polymer,1990,31:265.

[2] CHARU V, DAVID L K. Silk as a biomaterial[J]. Progress in Polymer Science, 2007,32(8/9):991-1 007.

[3] MINOURA N, AIBA S I, HIGUCHI M,etal. Attachment and growth of fiberblast cells on silk fibroin[J]. Biochemical & Biophysical Research Communications,1995,208:511.

[4] SOFIA S, MCCARTHY M B, GRONOWIC G,etal. Functionalized silk-based biomaterials for bone formation[J]. Journal of Bionedical Materials Research, 2001,54:139-148.

[5] 劉 明.FTIR對絲素蛋白構象的研究[D].杭州:浙江大學,2006.

[6] 夏其昌,張祥明,周仲駒,等.蛋白質電泳技術指南[M].北京:化學工業出版社,2007.

PropertiesofRegeneratedSilkFibroinfromMulberry/TussahSilkinDifferentSolventSystems

XIAO Lu, YANG Xu-chao, YU Wei-hua, WANG Jia-li, TANG Shi-cheng

(Silk Engineering Research Center of Sichuan, Chengdu 610031, China)

Several different solvent systems were used to dissolve Bombyx mori silk and Antherara pernyi silk to prepare SF/TSF solutions and membranes. The stability of SF/TSF solutions under different dissolution systems were studied, amino acid compositions and molecular structure changes of the SF/TSF membranes were discussed through the gel time, SDS-PAGE, amino acid analysis and FT-IR testing. The results showed that CaCl2-H2O-C2H5OH was suitable for preparing the SF and Ca(NO3)2-4H2O was suitable for preparing the TSF. It was inversely proportional between the stability and molecular mass of the SF/TSF solutions. SF membrane was mainly composed of non polar small amino acids while TSF was mainly composed of polar and nonpolar mixed amino acids. The molecular structures of SF membranes were random coil and β-sheet. Meanwhile, the random coil could be changed into β-sheet. The TSF membranes were co-existence of random coil, α-helix and β-sheet structures, and random coil could be changed into the other two structures.

solvent systems； regenerated silk fibroin； stability； molecular structure

TS143.2

B

1673-0356(2017)11-0013-04

2017-09-13

四川省應用基礎計劃項目(2016JY0227)

肖 露(1986-)，男，四川西昌人，工程師，碩士研究生，主要研究方向為紡織材料、產業用紡織品，E-mail：xiaolu0932@126.com。