酶法制備莜麥多肽

高鴻蒙

摘要：本研究采用堿性蛋白酶水解莜麥蛋白，制備分子量在5000D以下的莜麥多肽。通過正交實驗得出堿性蛋白酶在溫度55℃，pH9，酶用量5‰，底物濃度為3%的條件下，酶解2h，其水解度（DH）可達71.96%。

關鍵詞：莜麥；酶解；多肽

1.實驗方法

將莜麥種子用粉碎機粉碎，過篩，60℃電熱恒溫鼓風干燥箱干燥2-4h。取干燥過的莜麥細粉50g，加100ml正己烷于50℃水浴鍋中抽提6-8h，離心，沉淀，60℃干燥，得脫脂莜麥粉。取50g脫脂莜麥粉，加100ml的70%乙醇密閉抽提1h，離心，沉淀經60℃干燥脫乙醇得莜麥粗蛋白。用凱氏定氮法測定莜麥粗蛋白粉中蛋白的含量。

將準備酶解的樣品100℃煮沸10min。用堿性蛋白酶水解莜麥蛋白制備莜麥多肽。酶解反應到預定時間時，立即放入100℃沸水中滅活10min。滅酶后取1ml酶解液測定酶解反應的水解度。用檸檬酸調節酶解液的pH值到 4.3-4.5，冷藏室靜置20min，8000rpm離心15分鐘，去除非水解蛋白，得到的上清液即為莜麥多肽液。

用SDS-PAGE法，檢測分子量5000D以下的多肽，以胰島素為分子量參照物（5700D）。

用中空纖維超濾柱分離分子量小于5000D的多肽，將多肽液在旋轉蒸發儀（70℃—80℃，0.07Mpa）中濃縮，在60℃烘箱烘干得到莜麥多肽粉。

1.1 測定指標和方法

1.1.1莜麥中脂肪含量的測定：脫脂粉常壓烘干法。取一定量的莜麥粉用正己烷脫脂，將脫脂粉干燥，計算差值，可算出脂肪含量。

1.1.2莜麥蛋白含量測定：凱氏定氮法和雙縮脲法。

1.1.3水解度的測定：

1.1.3.1標準曲線繪制：取12 支試管分成兩組，分別加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml的標準牛血清溶液，用水補足到1ml，然后各加入4ml雙縮脲試劑，充分搖勻后，在室溫放置30min，于540nm處進行比色測定。取兩組測定的平均值，以牛血清白蛋白的含量為橫坐標，光吸收度為縱坐標繪制標準曲線，作為定量的依據。（見圖1）

1.1.3.2水解度的測定：取2ml加熱滅活的酶解液，加入等體積10%的三氯乙酸（TCA），振蕩5min，4000rpm/min離心15min，取1ml上清液，加入4ml雙縮脲試劑，靜置30min，在540nm測定光吸收值，與標準曲線對照得蛋白含量。以計算公式可得水解度（DH）。

計算公式：DH%=（N2-N1）/（N0-N1）×100%

其中：

N0——凱氏定氮所測莜麥粗蛋白粉中的蛋白含量（mg）

N1——反應前蛋白液中10%TCA可溶性蛋白（mg）

N2——反應后酶解液中10%TCA可溶性蛋白（mg）

2.實驗結果

2.1 脂肪含量測定結果

脂肪平均含量為3.8%。

2.2 蛋白含量測定結果

未脫脂細粉中蛋白平均含量為11.2%，脫脂細粉中蛋白平均含量為15.68%。

2.3 單因素的確定

2.3.1 溫度的確定：酶反應條件為：pH11，底物濃度3%，酶用量5‰，酶解時間2h，試驗不同溫度對蛋白質水解度的影響。實驗表明，當溫度在45℃時，DH較大。

2.3.2 pH的確定：酶反應條件為：溫度45℃，底物濃度3%，酶用量5‰，酶解時間2h，試驗不同pH對蛋白質水解度的影響。實驗表明，當pH在10時，DH較大。

2.3.3酶用量的確定：酶反應條件為：溫度45℃，底物濃度3%，pH11，酶解時間2h，試驗不同酶用量對蛋白質水解度的影響。實驗表明，隨著酶加量的增加，DH提高，當酶加量達到3‰時再增加酶量，DH值增加不明顯。

2.3.4底物濃度的確定：反應條件為：溫度45℃，pH11，酶用量5‰，酶解時間2h，試驗不同底物濃度對蛋白質水解度的影響。實驗表明，隨著底物量的增加，DH值提高。

2.4 最佳酶解條件的確定

以溫度、pH值、酶用量、底物濃度為四因素各取三水平。以水解度為指標，按L9（34）設計正交試驗。實驗結果顯示，酶的反應條件為：溫度55℃，pH9，酶用量5‰，底物濃度3%，水解時間2h，水解度達到最大值71.96%，即A3B1C3D2。各因素對水解度的影響依次為：D>B>A>C，其中底物濃度和溫度對水解度的影響較大。對實驗結果進行級差分析發現，最佳條件為A3B3C3D2。即溫度55℃，pH11，酶用量3‰，底物濃度3%。綜合分析，取最佳反應條件：A3B1C3D2。即：溫度55℃，pH9，酶用量5‰，底物濃度3%。堿性蛋白酶水解莜麥蛋白水解度結果見表1。

2.5 酶解時間的確定

酶反應條件為：溫度55℃，pH9，酶用量5‰，底物濃度3%，試驗不同水解時間對蛋白質水解度的影響。實驗表明，隨著時間的延長，DH值不斷增加，在水解達到2h以后，DH值增加不明顯，開始變緩。

3.結果分析

通過實驗說明可用堿性蛋白酶對莜麥蛋白進行有效水解，產生分子量小于5000D的多肽產品。通過正交試驗可獲得減性蛋白酶水解莜麥蛋白制備莜麥多肽的最佳條件為：溫度55℃，pH9，酶用量5‰，底物濃度3%，酶解時間2h。在此條件下水解度為71.96%。endprint