過表達FaSAMDC基因提高黑麥草屬植物的抗旱性和耐熱性

曾慶飛，韋鑫，蔡一鳴，舒健虹，吳佳海，王小利

(貴州省農業科學院草業研究所，貴州 貴陽 550006)

過表達FaSAMDC基因提高黑麥草屬植物的抗旱性和耐熱性

曾慶飛，韋鑫，蔡一鳴，舒健虹，吳佳海，王小利*

(貴州省農業科學院草業研究所，貴州 貴陽 550006)

主要探討了在黑麥草屬植物中導入高羊茅S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶基因(FaSAMDC)對轉基因植株抗旱耐熱性的提高效果，為培育黑麥草抗旱耐熱新品種提供種質新材料。選擇黑麥草成熟種子為外植體，采用貴州省草業研究所分子生物學實驗室構建的過表達載體以及黑麥草胚性愈傷組織高頻植株再生和農桿菌介導的遺傳轉化體系，將克隆自高羊茅的FaSAMDC基因轉入貴州地區主栽品種多花黑麥草特高和多年生黑麥草四季的基因組內，經抗性篩選、PCR檢測和Southern雜交分析驗證，獲得45株特高與44株四季的轉基因植株，轉化頻率分別為2.93%和2.28%。抗旱耐熱試驗表明，在30 ℃高溫和中度干旱脅迫條件下，特高轉基因株系的根冠比比對照組培苗高出7.08%，葉片相對含水量(RWC)比對照高出13.12%，RWC降低幅度比對照少5.49個百分點；四季轉基因株系的根冠比比對照組培苗高出6.54%，RWC比對照高出12.54%，RWC降低幅度比對照少6.50個百分點，差異均達到顯著水平(P<0.05)，證明轉入FaSAMDC基因的黑麥草陽性株系的抗旱耐熱能力得到了明顯提高。形態與生長特征觀測結果顯示，與非轉基因組培苗相比，轉基因株系的葉長、株高、主莖節數減小，葉寬、單株分蘗數增加，葉色變深，植株形狀趨向于葉片叢生的緊湊型，推測導入的FaSAMDC基因參與了基因表達、細胞分裂等生理功能的調節。

黑麥草；根癌農桿菌；遺傳轉化；FaSAMDC基因；抗旱耐熱性

在世界各國種植的優良牧草中，禾本科牧草約占43%的比重，其中黑麥草(Lolium)由于具有生長迅速、莖葉柔嫩光滑、綠色期長、耐牧性強、營養價值高且株型外觀優美等優點，已成為世界溫帶地區建立人工草地和補播天然草場的重要冷季型禾草，在草地草坪建植及飼草供給中占有很重要的地位[1]。但是另一方面，黑麥草對于35 ℃以上的高溫、干旱、-15 ℃以下的嚴寒以及土壤鹽堿均表現出較弱的耐受性，從而使其進一步的廣泛栽培和利用受到限制[2]。針對黑麥草存在的不足，對現有品種進行抗逆性改良，定向培育抗旱、耐熱、耐瘠薄的系列黑麥草優良品種，對于改善區域農業生產結構、促進“三元結構農業”和節糧型畜牧業的發展將起著重要作用。

進行黑麥草耐逆性改良，現代轉基因技術是一條有效的重要途徑。在國外，利用轉基因技術改良黑麥草抗逆性的研究起步較早，選擇分生組織和穎果作為外植體，已建立了多年生黑麥草細胞懸浮系和原生質體培養體系，并獲得了轉基因組培苗[3-4]；另外通過碳化硅纖維介導法和基因槍法都獲得了轉基因植株[5-6]，只是未見轉基因新品種的選育報道。在國內，劉萍等[7]應用農桿菌介導法將克隆自遼寧堿蓬(Suaedaliaotungensis)的甜菜堿醛脫氫酶基因(BADH)轉移進多年生黑麥草，獲得了具有較強耐鹽能力的轉基因株系Gsc-LP5；王奇麗等[8]利用農桿菌介導的遺傳轉化方法，將報告基因GUS和抗除草劑基因BAR成功轉入多年生黑麥草，共計獲得52株T0代表現為Basra抗性的植株。而對于一年生黑麥草遺傳轉化的研究報道相對較少。

在植物的生長發育過程中，S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶基因(SAMDC)是一個與抗逆相關的重要功能基因。研究表明，當植物體內多胺生物合成流量增加時，植株能產生對生物及非生物脅迫的耐受性[9]。而在多胺生物合成途徑中，S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶(SAMDC)能以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)為底物催化形成脫羧S-腺苷甲硫氨酸(dcSAM)，為精氨和亞精氨的合成提供氨丙基，從而成為了亞精胺和精胺合成的關鍵酶。SAMDC能對多種外界條件的脅迫作出反應，會受高鹽、高熱、干旱、寒冷及水分脅迫的誘導[10]。已有試驗證明，轉入康乃馨SAMDC的轉基因植株能獲得對非生物脅迫的廣譜抗性[11]；SAMDC調節合成的精胺積累有助于植物在經受干旱后的快速復蘇[12]；SAMDC在轉基因番茄中的組成型表達能同時提高植株對生物及非生物脅迫的耐受性[13]，但還未見在黑麥草中超量表達SAMDC基因的研究報道。本研究利用貴州省草業研究所分子生物學實驗室構建的過表達載體以及黑麥草組培再生體系和農桿菌介導的遺傳轉化體系，將克隆自高羊茅的SAMDC基因導入多花黑麥草特高和多年生黑麥草四季的基因組內，經抗性篩選、PCR檢測、Southern雜交和抗旱耐熱性鑒定，獲得了一批耐逆性增強的轉基因植株。

1 材料與方法

1.1 材料

黑麥草外植體選用在貴州地區種植較為普遍的品種的成熟種子，一年生黑麥草特高于2014年購于貴陽霖卉園林綠化有限公司，多年生黑麥草四季由貴州省草業研究所保存。2013至2014年構建的過表達載體是由經貴州省草業研究所分子生物學實驗室改造過的植物表達載體pCAMBIA 1300與克隆自高羊茅黔草1號的SAMDC基因(FaSAMDC)所形成的重組質粒pCAMBIA 1300-FaSAMDC。該載體具有潮霉素(hygromycin，Hyg)和卡那霉素(kanamycin，Kan)抗性，在FaSAMDC片段的兩側各具有一個CaMV 35S啟動子，主要表達框架如圖1所示。通過凍融法將重組質粒導入根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株EHA105和GV3101中，經PCR和酶切驗證獲得陽性克隆[14]。

圖1 構建的過表達載體結構圖Fig.1 Schematicic diagram of constructed recombinant plasmid LB：左邊界 Left border；CaMV poly(A)：來自花椰菜花葉病毒35S啟動子的多聚腺苷酸尾 Polyadenylation from 35S promoter of cauliflower mosaic virus；HYG：抗潮霉素序列 Hygromycin resistant sequence；XhoI：限制性內切酶XhoI識別序列 Sequence recognized by restriction enzyme XhoI；CaMV 35S promoter 1：來自花椰菜花葉病毒的35S啟動子1 35S promoter 1 from cauliflower mosaic virus；EcoRI：限制性內切酶EcoRI識別序列 Sequence recognized by restriction enzyme EcoRI；NsiI：限制性內切酶NsiI識別序列 Sequence recognized by restriction enzyme NsiI；SphI：限制性內切酶SphI識別序列 Sequence recognized by restriction enzyme SphI；PstI：限制性內切酶PstI識別序列 Sequence recognized by restriction enzyme PstI；FaSAMDC：插入的高羊茅腺苷甲硫氨酸脫羧酶基因 Inserted S-adenosylmethionine decarboxylase gene from Festuca arundinacea；KpnI：限制性內切酶KpnI識別序列 Sequence recognized by restriction enzyme KpnI；SacI：限制性內切酶SacI識別序列 Sequence recognized by restriction enzyme SacI；NrVI：限制性內切酶NrVI識別序列 Sequence recognized by restriction enzyme NrVI；CaMV 35S promoter 2：來自花椰菜花葉病毒的35S啟動子2 35S promoter 2 from cauliflower mosaic virus；HindⅢ：限制性內切酶HindⅢ識別序列 Sequence recognized by restriction enzyme HindⅢ；LacZa：β-半乳糖苷酶a基因 Gene A of beta-galactosidase；RB：右邊界 Right border.

愈傷組織誘導培養基：特高的愈傷組織誘導采用CC+7 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L 6-BA，四季采用CC+5 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L 6-BA；愈傷組織繼代培養基：MS+0.5 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L 6-BA+1.25 mg/L CuSO4+1.0 g/L CH； 農桿菌培養基采用YEB培養基：10 g/L胰蛋白胨+1 g/L酵母抽提物+5 g/L蔗糖+0.5 g/L MgSO4·7H2O，pH 7.0；農桿菌懸浮培養基：AA+1.0 mg/L 2,4-D+100 μmol/L乙酰丁香酮，pH 5.2；預培養基：MS+10 g/L葡萄糖+3 mg/L 2,4-D+2 mg/L KT+100 μmol/L乙酰丁香酮+0.1 mol/L甘露醇+5 mg/L AgNO3+8 g/L瓊脂粉；液體預培養基：MS+30 g/L麥芽糖+10 g/L葡萄糖+3 mg/L 2,4-D+2 mg/L KT+100 μmol/L乙酰丁香酮+0.1 mol/L甘露醇+5 mg/L AgNO3；共培養基：MS+5 mg/L 2,4-D+0.05 mg/L 6-BA+100 μmol/L乙酰丁香酮+0.1 mol/L甘露醇+5 mg/L AgNO3+8 g/L瓊脂粉；選擇培養基：MS+10 g/L葡萄糖+3 mg/L 2,4-D+2 mg/L KT+150 mg/L特美汀+40 mg/L潮霉素+8 g/L瓊脂粉；分化篩選培養基：特高轉化苗采用 MS+2 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+0.1 mg/L TDZ+40 mg/L潮霉素+8 g/L瓊脂粉，四季轉化苗采用 MS+6 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA+5 mg/L KT+40 mg/L潮霉素+8 g/L瓊脂粉；生根培養基：1/2MS+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L IAA+8 g/L瓊脂粉。

1.2 根癌農桿菌介導轉化黑麥草

遺傳轉化試驗于2015年進行。2個品種均以剝去穎殼后切除1/3胚乳端的種子作為外植體，分別接種于愈傷組織誘導培養基上，在(26±1) ℃黑暗條件下培養40 d形成愈傷組織，接著轉移至繼代培養基上，每次培養25 d，通過2次繼代培養后獲得胚性愈傷組織，然后按下列步驟進行遺傳轉化。

1.2.1受體愈傷組織預培養 將繼代培養形成的愈傷組織轉接至預培養基上，(25±1) ℃無光照條件下預培養3 d后在液體預培養基中振蕩預培養2 d，以促進愈傷組織的活化并使之處于感受狀態。

1.2.2農桿菌感染與共培養 在YEB平板上挑取活化的已導入過表達載體pCAMBIA 1300-FaSAMDC的根癌農桿菌EHA105的單菌落，接種于含Hyg和Kan各50 mg/L的YEB液體培養基中，28 ℃、180 r/min培養至OD600為1.0，5000 r/min離心10 min收集菌體，用農桿菌懸浮培養基重懸成OD600為0.7的懸浮液。將預培養的胚性愈傷組織浸入懸浮液30 min，用無菌濾紙吸干菌液，轉接至共培養基上，(25±1) ℃黑暗條件下培養3 d。

1.2.3抗性愈傷組織篩選 共培養后的愈傷組織先用0.1 mol/L甘露醇無菌液振蕩清洗，再用含200 mg/L特美汀的無菌水洗滌3～5次，吸干水分后轉移到Hyg濃度為40 mg/L的選擇培養基上，(25±1) ℃暗培養4周。將長出的抗性愈傷組織轉接至新的含相同濃度Hyg的選擇培養基上，連續進行2輪繼代篩選，每20 d轉接一次。

1.2.4抗性植株再生 將3輪篩選后的抗性愈傷組織分別轉移至特高與四季各自的篩選分化培養基上，在(25±1) ℃、光照時間12 h/d、光強2000 lx的培養室中進行分化培養。當分化形成的不定芽長至2 cm左右時轉入生根培養基中，待幼根長出且再生苗株高達到6～8 cm時，在15～25 ℃室溫條件下揭開瓶蓋煉苗2～3 d后，將再生苗從瓶內小心取出，清水洗凈瓊脂，移栽至盛有營養土(腐殖土∶蛭石∶砂壤土=1∶1∶1)的花缽中。

1.3 抗性植株的PCR檢測

轉化苗的PCR檢測、Southern blot 分析和抗旱耐熱鑒定試驗于2016年開展進行。

采用常用的CTAB法提取轉化植株及對照非轉化組培苗的葉片總DNA，根據潮霉素B基因的片段序列設計一對特異引物，正向引物F1：TTCTGCGGGCGATTTGTG，反向引物R1：AGCGTCTCCGACC TGATG。以提取的基因組DNA為模板，每個反應體系總體積20 μL，采用Touch down PCR方法進行擴增：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，63 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，10個循環，每個循環退火溫度減1 ℃；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，25個循環。擴增產物用1.2%凝膠電泳檢測。

1.4 轉基因植株的Southern雜交分析

在特高和四季的T0轉基因植株中分別隨機選擇4株轉化苗和1株非轉化對照組培苗，CTAB法大量提取基因組DNA。經分光光度法檢測合格后各取30 μg基因組DNA，用EcoR I酶切完全后在0.8%瓊脂糖凝膠中4 ℃條件下電泳(100 V，5 min，接著70 V約5 h)，再轉移到HybondTM-N+尼龍膜上。以潮霉素抗性標記基因HYG片段(877 bp)作為探針，探針標記、分子雜交和信號檢測采用“DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit”試劑盒(上海浩洋生物科技有限公司)說明書中的操作步驟進行。

1.5 轉基因植株的抗旱耐熱性鑒定

采用根冠比測定法[15]以及苗期葉片相對含水量測定法[16]，以組培產生的非轉基因苗為對照，對陽性株系的抗旱耐熱性進行鑒定。

根冠比測定：隨機選取特高轉基因株系、四季轉基因株系以及特高與四季非轉基因組培苗各3株，移栽于花缽中后轉入30 ℃人工氣候室內培養。正常澆水12 d后接著作連續斷水12 d的中度干旱脅迫處理。將連同根系的整個植株帶土取出，沖凈后用吸水紙吸取根表面的水分，將地上、地下部分分離，于105 ℃殺青30 min，在恒溫85 ℃下烘干12 h至恒重后采用萬分之一電子天平稱重。

根冠比(R/S)=地下根系干重(root)/地上部干重(shoot)

葉片相對含水量(RWC)的測定：在盆栽苗中選擇苗高、生長狀況一致的特高和四季轉基因苗以及組培產生的非轉基因的特高和四季苗各6株，轉入30 ℃人工氣候室內培養。正常澆水12 d后各選3株測定其葉片相對含水量，計算平均值；剩下3株作連續斷水12 d的中度干旱脅迫處理后再分別測定葉片相對含水量，計算各株系葉片相對含水量變化值的平均值。

RWC數值測定采用鮮重法：剪取整株黑麥草葉片，稱出鮮重(Wf)；再將葉樣浸入蒸餾水中24 h，取出后用吸水紙擦干樣品表面水分，稱出飽和重(Wt)；最后將葉樣放入已升溫至105 ℃的烘箱中殺青15 min，然后于80 ℃下烘至恒重，采用萬分之一電子天平稱出干重(Wd)。

葉片相對含水量 RWC=(Wf-Wd)/(Wt-Wd)×100%

1.6 轉基因植株形態與生長觀察

將組培形成的非轉化對照植株和轉基因株系首先移植于花缽中，2周后移栽至溫室大棚內，25 ℃條件下控溫生長。60 d后每組各選擇5個植株，觀察記錄它們的生長、分蘗、葉色、株型等形態特征，分別測定各類株系的株高、葉片長度、葉片寬度、節數與單株分蘗數，計算各測定項目的平均值。

1.7 數據處理

對各試驗處理的數據，采用Excel統計分析軟件、SPSS數據處理軟件分別進行統計分析和顯著性測驗。

2 結果與分析

2.1 轉基因植株的獲得

利用優化建立的多花黑麥草特高和多年生黑麥草四季的高頻組培再生體系，分別以2個品種的成熟種子為外植體，將外植體經過前處理后分別接種于各自的愈傷組織誘導培養基，40 d后選擇生長狀態良好、致密均一的愈傷組織轉接至統一的繼代培養基中，通過2次共50 d的繼代培養后，挑選顏色鮮黃、生長旺盛且結構密實的Ⅱ型胚性愈傷組織(圖2A)進行3 d的預培養和2 d的振蕩培養，接著與已導入過表達載體pCAMBIA 1300-FaSAMDC的根癌農桿菌EHA105共培養(圖2B)，經Hyg篩選6周后將抗性愈傷組織轉移至篩選分化培養基上，待形成不定芽后(圖2C)轉入生根培養基中(圖2D)，3周后移栽至盛有營養土的花缽中(圖2E、F)，最終獲得131棵抗性植株。

2.2 轉基因植株的PCR檢測

選取移栽成活的131棵抗性植株，提取葉片總DNA，以EHA105-p1300菌作陽性對照，非轉化的特高和四季苗的葉片總DNA為陰性對照，用設計的引物對擴增抗潮霉素B基因的部分片段。PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測發現，其中有45株特高轉基因抗性植株和44株四季轉基因株系擴增出了與預期長度相吻合的877 bp的目的片段，非轉化對照植株均未出現相應擴增帶(圖3)，表明FaSAMDC基因已經整合進入到2個品種的黑麥草基因組中。特高和四季的轉化頻率分別為2.93%和2.28%(表1)。

2.3 轉基因株系的Southern blot分析

在經PCR檢測呈陽性的轉基因植株中，為進一步確證外源的FaSAMDC基因已整合到黑麥草基因組中，分別隨機選擇4株特高轉化苗(編號FT1～FT4)和4株四季轉化苗(編號FS1～FS4)，提取葉片總DNA，并以非轉化的特高和四季苗的葉片總DNA為對照，經EcoR I酶切后用含抗潮霉素B基因部分片段的探針進行Southern雜交，結果見圖4和圖5。雜交結果顯示，多花黑麥草特高的4個35S:SAMDC轉化子(FT1～FT4)均出現了明顯的單一雜交條帶，對照沒有雜交帶，推測4個35S:SAMDC轉化子均為單拷貝HYG陽性植株；而多年生黑麥草四季的4個35S:SAMDC轉化子中(FS1～FS4)，FS1和FS4兩個轉化子的雜交條帶較為明顯，FS2與FS3的條帶較弱，對照也沒有條帶；其中FS1、FS3和FS4為單一條帶，推測它們為單拷貝的HYG陽性植株，而FS2號出現了微弱的2個條帶，推測其可能為雙拷貝的HYG陽性株系。

2.4 轉基因陽性株系的抗旱耐熱能力鑒定

2.4.1根冠比測定結果 當轉基因陽性株系與非轉化的組培對照苗在設定的高溫干旱脅迫環境中生長24 d以后，分別分離地上部與地下部，烘干稱重，測定每一植株的根冠比，并計算每一材料根冠比3個重復的平均值，結果見表2。從表中看出，2個品種的轉基因陽性株系經高溫干旱脅迫后其根冠比值均高于相應的對照株系，其中特高轉基因株系比對照苗高出7.08%，四季轉基因株系比對照高出6.54%，差異均達到顯著水平(P<0.05)。

圖2 農桿菌介導的黑麥草遺傳轉化及植株再生Fig.2 Agrobacterium-mediated transformation of ryegrass and regeneration of the transformed plantlets A：誘導出的特高胚性愈傷組織；B：特高胚性愈傷組織與根癌農桿菌的共培養；C：四季抗性愈傷組織不定芽的分化；D：生根培養基中特高和四季抗性植株生根；E：特高和四季抗性植株移栽至花缽并成活；F：特高和四季抗性植株在人工氣候室內生長。 A: Induced embryogenic callus of Tetragold; B: Co-culture of embryogenic callus of Tetragold and Agrobacterium tumefaciens; C: Differentiation of adventitious buds from resistant callus of Four seasons; D: Hygromycin-resistant plants of Tetragold and Four seasons growing in rooting medium; E: Hygromycin-resistant plants of Tetragold and Four seasons potted in soil successfully; F: Hygromycin-resistant plants of Tetragold and Four seasons growing in climatic laboratory.

圖3 轉基因黑麥草抗性植株潮霉素B基因的PCR檢測Fig.3 PCR analysis of B gene of hygromycin in putative transgenic plants of ryegrass M：DNA分子量；+：EHA105-p1300菌(陽性對照)；-：非轉化植株(陰性對照)；1～9：特高和四季轉基因抗性植株。 M: DNA marker; +: Strain EHA105-p1300 as positive control; -: Non-transformed plant as negative control; 1-9: Transgenic hygromycin-resistant plants of Tetragold and Four seasons.

表1 農桿菌介導2個黑麥草品種的轉化頻率Table 1 Transgenic frequency of two ryegrass cultivars by Agrobacterium tumefaciens

圖4 特高轉基因植株潮霉素B基因的Southern雜交分析Fig.4 Southern analysis of B gene of hygromycin in putative transgenic plants of Tetragold

圖5 四季轉基因植株潮霉素B基因的Southern雜交分析Fig.5 Southern analysis of B gene of hygromycin in putative transgenic plants of Four seasons

CK-T：特高非轉化植株(陰性對照)；FT1～FT4：特高轉基因植株。CK-T: Non-transformed Tetragold plant as negative control; FT1-FT4: Transgenic hygromycin-resistant plants of Tetragold.

CK-S：四季非轉化植株(陰性對照)；FS1～FS4：四季轉基因植株。CK-S: Non-transformed Four seasons plant as negative control; FS1-FS4: Transgenic hygromycin-resistant plants of Four seasons.

表2 特高、四季轉基因株系與對照苗根冠比測定Table 2 The root to shoot ratios of transgenic lines of Tetragold and Four seasons and control seedlings

較CK高：Increase rate compared with CK.同行不同大寫字母表示轉基因株系與對照苗之間差異達極顯著水平(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。Different capital letters after data in the same row indicate the significant difference between transgenic lines and control seedlings atP<0.01 level, different lowercase letters indicate significant differences atP<0.05 level. The same below.

2.4.2葉片相對含水量(RWC)測定 經設置的30 ℃高溫以及正常澆水和中度干旱脅迫處理后，先后對轉基因株系與非轉基因組培對照苗3個重復的葉片相對含水量進行了測定，計算平均值(表3)。結果顯示，在高溫及正常澆水條件下，特高轉基因株系的葉片相對含水量比對照高出7.63%，四季轉基因株系比對照高出6.04%，2個品種轉基因株系與對照組培苗的RWC差異均達顯著水平(P<0.05)；而在高溫和連續斷水12 d的中度干旱脅迫處理以后，特高轉基因株系的葉片相對含水量比對照要高出13.12%，四季轉基因株系比對照高出12.54%，RWC差異都達到極顯著水平(P<0.01)；同時，在經受中度干旱脅迫后，特高與四季2個品種轉基因株系的RWC降低幅度分別比對照少5.49和6.50個百分點，說明所獲得的轉基因株系比對照組培苗具有更強的抗旱耐熱能力。

表3 特高、四季轉基因株系與對照苗葉片相對含水量測定Table 3 The leaf relative water content of transgenic lines of Tetragold and Four seasons and control seedlings %

較CK高或低：Increase or decrease rate compared with CK.

2.5 轉基因陽性株系的形態與生長特征

對轉基因陽性株系與同批次的非轉基因組培苗在移栽60 d后苗期的形態特征考察結果見表4。觀測結果顯示，與對照相比，特高和四季轉基因株系的株高與節數均有所降低，葉片寬度增加而長度略有減小，單株分蘗數增加，葉色變深，株型更趨向于葉片叢生的緊湊型。說明2個品種轉基因株系的形態與生長特征與非轉基因對照組培苗存在著差異，FaSAMDC基因的過量表達對轉基因植株的垂直生長具有一定的抑制作用，但能增加株系的單株分蘗數，且葉色、株型的變化更有利于植株抵抗干熱的環境條件。

表4 轉基因植株與非轉化對照植株的形態與生長特征Table 4 Morphological and growth characteristics of transgenic lines of Tetragold and Four seasons and control plants

3 討論

國內外關于黑麥草遺傳轉化的研究始于20世紀80年代，前期采用的遺傳轉化方法主要是硅碳纖維轉導法、原生質體直接轉導DNA法和基因槍法等，并獲得了少量的轉基因多花黑麥草植株[17-18]。不過這些方法普遍存在著受基因型限制較大、轉化頻率較低、外源基因易于多拷貝插入、存在基因沉默與共抑制現象、后代株系呈非孟德爾遺傳、再生植株不育等系列問題，后來建立起來的根癌農桿菌介導的遺傳轉化方法在一定程度上克服了這些缺點[19]，并已逐漸成為作物遺傳轉化的主要途徑之一[20]。然而，農桿菌介導的遺傳轉化是以愈傷組織再生體系作為受體系統的，黑麥草作為禾本科牧草對愈傷誘導和轉化再生都不敏感，被稱為組織培養頑固種類[21]。為獲得較高的遺傳轉化效率，在轉化實驗開展前，課題組專門針對多花黑麥草特高和多年生黑麥草四季2個貴州地區的黑麥草主栽品種，先后進行了種子外植體的預處理、愈傷組織誘導及繼代培養基組分、抗生素的臨界濃度、愈傷組織分化培養基組分、預培養與共培養基組分、菌液濃度、浸染方式、農桿菌菌株與胚性愈傷組織的共培養時間、抑菌處理等內容的系統對比試驗，優化建立了2個黑麥草品種農桿菌介導的遺傳轉化體系，保證了本研究中FaSAMDC基因轉化實驗的順利進行。

在農桿菌介導的遺傳轉化過程中，由于絕大多數單子葉植物都不能積累足夠的酚類物質，難以激活農桿菌的侵染能力，從而不能成為農桿菌的天然寄主[22]。乙酰丁香酮作為一種酚類化合物具有潛在的誘導農桿菌vir基因的作用，已被證明是一種能夠提高單子葉植物和部分雙子葉植物農桿菌轉化效率的有效誘導物[23]。甘露醇作為一種中性單糖，也是一種農桿菌vir區基因的誘導劑，同時還可作為滲透調節物質調節細胞內外的滲透壓而有助于遺傳轉化。另外，在單子葉植物的遺傳轉化過程中，農桿菌浸染后極易造成愈傷組織的褐化壞死，而硝酸銀作為一種強還原劑，能夠降低愈傷組織的氧化率、弱化甘露醇的高滲透作用并抑制農桿菌的過度生長，在不影響T-DNA轉移和整合的同時，還能促進愈傷組織不定芽的分化，從而顯著提高遺傳轉化效率[24]。因此，本研究在預培養及共培養基中分別添加了100 μmol/L乙酰丁香酮、30 g/L甘露醇和5 mg/L的硝酸銀，并獲得了較為理想的轉化效果，轉化效率分別達到2.93%和2.28%。總基因組單酶切的Southern雜交結果顯示，在隨機挑選的多花黑麥草特高的4個35S:SAMDC轉化子中，FaSAMDC基因都是以單拷貝形式進入黑麥草基因組中的，而在隨機選取的多年生黑麥草四季的4個轉化子中，其中1個株系的FaSAMDC基因則以雙拷貝數整合進入到了染色體中。在轉基因株系中，外源基因無論以單拷貝或雙拷貝形式存在都能正常表達[25]，因此可以預見，轉入FaSAMDC基因的黑麥草其抗逆性都會得到不同程度的增強。

試驗轉入FaSAMDC基因的目的是為了獲得適合在貴州地區廣泛種植的抗旱耐熱性增強的黑麥草種質新材料。為了檢測所獲材料的抗旱耐熱能力，本研究對2個品種的轉基因株系分別進行了經高溫干旱脅迫處理后根冠比和葉片相對含水量的對比測定。根冠比是衡量作物地上部分與地下部分生長發育協調程度的重要指標，高溫干旱條件下，根冠比較高的植株具有更強的供應地上部生長所需養分的能力，有利于作物抵御高溫干旱并保持較好的生長狀況。在一定范圍內，根冠比越大，抗旱耐熱能力越強[26]。由于根冠比的測定會耗費整個植株，因而本研究只在每個品種的陽性轉化株系中隨機選擇3個株系用于測定。測定結果顯示，2個品種轉基因株系的根冠比與非轉基因組培苗的差異均達到顯著水平。說明SAMDC基因的過量表達，一方面能通過增加植株體內亞精胺、精胺和內源腐胺的合成含量而提高植物的抗逆性[27]，同時也還會通過增加植株的根冠比值來提高其對高溫干旱的耐受性。葉片相對含水量是反映植物水分狀況以及保水能力的另一個重要指標，它能夠密切反映出水分狀況與蒸騰作用之間的平衡關系以及植物對高熱干旱環境脅迫的抵御能力[16]。相對含水量較高的葉片具有較高的滲透調節功能和較強的抗旱耐熱性，葉片相對含水量與植物的抗旱耐熱能力呈正相關關系[28]；經過高熱和水分脅迫處理后，葉片相對含水量的降低幅度愈小，植株的抗旱耐熱能力愈強[29]。本研究獲得的2個品種的轉基因株系，無論是在高溫及正常水分條件下，還是在高溫及水分脅迫處理后，其葉片相對含水量都要顯著高于對照組培苗，而且經中度干旱脅迫后，葉片相對含水量的降幅也明顯低于對照。這進一步證實，轉入FaSAMDC基因的黑麥草種質新材料，其抗旱耐熱能力確信得到了有效的提高。

SAMDC基因的超量表達，不僅能提高植株的抗旱耐熱性能，同時還能增強對于鹽及其他滲透脅迫的適應能力，并具有控制基因表達、細胞分裂等多種生理功能[30]，因此在一定程度上可以改變植株的形態與生長特征。本研究中轉入了FaSAMDC基因的黑麥草株系，與非轉基因對照苗相比，葉長株高略有減小，葉片寬度與單株分蘗數有所增加，葉色變深，植株形狀更趨向于葉片叢生的緊湊型。這種形態與生長特征的變化，應該是外源SAMDC基因多種耐逆性機制共同作用的結果，而且可能更有利于提高植株對非生物脅迫的廣譜抗性。

4 結論

在前期優化建立的多花黑麥草特高和多年生黑麥草四季2個品種高效組培再生及農桿菌介導的遺傳轉化體系的基礎上，以2個黑麥草貴州主栽品種的成熟種子為外植體，通過胚性愈傷組織的誘導培養與根癌農桿菌EHA105介導的遺傳轉化，克隆自高羊茅與抗逆功能相關的S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶基因(FaSAMDC)被導入多花黑麥草特高和多年生黑麥草四季的基因組內。經抗性篩選、PCR檢測和Southern blot分析，確證獲得45株特高和44株四季轉基因陽性株系，轉化頻率分別達到2.93%和2.28%。在30 ℃高溫和中度干旱脅迫條件下，2個品種轉基因植株的根冠比與非轉基因組培對照苗的差異達到顯著水平(P<0.05)，葉片相對含水量則呈現出極顯著差異(P<0.01)；經高溫干旱脅迫后，特高與四季轉基因株系葉片相對含水量的降低幅度比對照植株分別少出5.49%和6.50%，證明轉入FaSAMDC基因陽性株系的抗旱耐熱能力在出發材料的基礎上得到了明顯提高。與非轉基因對照植株相比，轉基因株系的葉長、葉寬、葉片顏色、主莖節數、株高、單株分蘗數及植株形狀均有所變化，推測導入的FaSAMDC基因參與了植株體內基因表達、細胞分裂等生理功能的調節。性狀改良試驗達到了通過遺傳轉化獲得抗旱耐熱性增強的黑麥草種質新材料的研究目的。

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EnhancingdroughtandheattoleranceinLoliumspp.throughoverexpressionoftheFaSAMDCgene

ZENG Qing-Fei, WEI Xin, CAI Yi-Ming, SHU Jian-Hong, WU Jia-Hai, WANG Xiao-Li*

GuizhouInstituteofPrataculture,GuizhouAcademyofAgriculturalSciences,Guiyang550006,China

To obtain new ryegrass germplasm with enhanced drought and heat tolerance a genetic transformation experiment using plants from the genusLoliumwas conducted. By using mature seeds of ryegrass as explants and adoption of the overexpression vector,tissue culture and regeneration system of ryegrass, and genetic transformation mediated byAgrobacteriumtumefaciens, the S-adenosylmethionine decarboxylase gene cloned fromFestucaarundinacea(FaSAMDC) was introduced into the genome of ‘Tetragold’ annual ryegrass and ‘Four Seasons’ perennial ryegrass. Eighty-nine transgenic plants (45 Tetragold and 44 Four Seasons) were regenerated from independent resistant calli, which were confirmed by antibiotic resistance screening, PCR assay and southern hybridization analysis; the transgenic frequency was 2.93% and 2.28%, respectively. Drought and heat resistant tests under high temperature (30 ℃) and moderate drought stress showed that in Tetragold, the root to shoot ratio was 7.1% higher, leaf relative water content (RWC) 13.1% higher and the RWC descent scope 5.5% lower than the controls; for transgenic Four Seasons plants the root to shoot ratio was 6.5% higher, RWC 12.5% higher and the RWC descent scope 6.5% lower than the control; differences between transgenic plants and controls were all statistically significant (P<0.05), indicating that drought and heat resistance in transgenic plants was significantly improved. Observations of morphological and growth characteristics showed that, compared with non-transgenic plants, leaf length, plant height and main stalk pitch number of transgenic plants were lower but leaf width and tiller number per plant were higher. Leaves of transgenic plants were darker in colour and plants tended to become compact with tufted leaves suggesting that the insertedFaSAMDCgene was involved in the regulation of physiological function, such as gene expression and cell division. The transgenic material developed in the study could be used as foundation for the cultivation of new ryegrass varieties with enhanced drought and heat resistance.

ryegrass;Agrobacteriumtumefaciens; genetic transformation;FaSAMDCgene; drought and heat tolerance

10.11686/cyxb2017208http//cyxb.lzu.edu.cn

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ZENG Qing-Fei, WEI Xin, CAI Yi-Ming, SHU Jian-Hong, WU Jia-Hai, WANG Xiao-Li. Enhancing drought and heat tolerance inLoliumspp. through overexpression of theFaSAMDCgene. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(12): 117-127.

2017-05-02；改回日期：2017-07-03

貴州省農業科技攻關項目(黔科合NY[2013]3060號)，貴州省農業科學院博士科研啟動基金(2013-06)，黔農科院自主創新科研專項[(2014)010號]，貴州省高層次創新型人才培養項目(黔科合人才[2016]4024)和貴州省科技創新人才團隊建設項目(黔科合平臺人才[2016]5617)資助。

曾慶飛(1969-)，男，貴州德江人，副研究員，博士。E-mail:zengqingfei2008@163.com*通信作者Corresponding author. E-mail:wangxiaolizhenyuan@126.com