馬鈴薯病毒誘導應答基因抑制消減雜交文庫構建及分析

李忠旺，陳玉梁，歐巧明，葉春雷，裴懷弟，劉新星，王紅梅，羅俊杰

(甘肅省農業科學院生物技術研究所,甘肅 蘭州 730070)

馬鈴薯病毒誘導應答基因抑制消減雜交文庫構建及分析

李忠旺，陳玉梁，歐巧明，葉春雷，裴懷弟，劉新星，王紅梅，羅俊杰*

(甘肅省農業科學院生物技術研究所,甘肅 蘭州 730070)

馬鈴薯病毒積累引起的種薯退化是馬鈴薯生產中造成產量和品質下降的重要原因之一。本研究以馬鈴薯病毒病攜帶植株葉片cDNA為試驗組(Tester)、脫毒種苗葉片cDNA為驅動組(Driver)，采用抑制消減雜交(suppression subtractive hybridization, SSH)技術構建了馬鈴薯病毒誘導應答基因的cDNA文庫；為驗證文庫構建效果，從文庫中隨機挑取了98個陽性克隆經PCR驗證后測序，獲得了45條高質量的有效非重復序列；經與GenBank進行同源比對后發現，其中14條非重復序列屬于馬鈴薯病毒基因序列，22條與已知基因序列同源性較高，9條無同源參考基因；選取文庫中出現頻率較高的2個ESTs(expressed sequence tag，表達序列標簽)用qRT-PCR技術分析發現，其表達量受馬鈴薯病毒侵染的誘導。結果表明，該SSH文庫構建較為成功，為進一步篩選與馬鈴薯病毒致病、防御相關的應答基因，解析馬鈴薯與病毒互作的分子機理，利用生物技術手段培育抗病毒馬鈴薯奠定了基礎。

馬鈴薯；病毒；應答基因；抑制消減雜交

馬鈴薯(Solanumtuberosum)為茄科茄屬多年生草本塊莖植物，是世界上僅次于小麥(Triticumaestivum)、水稻(Oryzasativa)和玉米(Zeamays)的第四大糧食作物[1]，因其塊莖部分含有豐富的碳水化合物、蛋白質和各種維生素，是重要的糧菜飼兼用作物及工業原料。中國是世界最大的馬鈴薯生產國，總產量和人均消費量均處于世界前列且穩步增長，但單位面積產量卻遠遠落后于荷蘭等馬鈴薯生產發達的國家，影響單產的因素很多，其中病毒等病害積累引起的種薯退化是重要的原因之一[2-4]。已報道的在田間條件下能侵染馬鈴薯的病毒有近30余種[4-5]，它們引起馬鈴薯植株花葉、褪綠、卷葉、矮縮以及壞死等癥狀，嚴重時導致植株生長發育異常，塊莖產量下降，特別是復合侵染時可使產量損失80%以上，有些還會嚴重影響塊莖品質和商品性[6-7]。

由于馬鈴薯病毒病的特殊性，目前尚無有效的化學方法防治馬鈴薯病毒病，利用莖尖分生組織培育健康無毒的馬鈴薯已成為預防馬鈴薯病毒病最為有效的方法之一。但莖尖脫毒組織培養技術本身具有成本高、對操作人員技術要求高、是否完全脫毒監測困難、脫毒種薯在栽培過程中易于再次感染的局限性[8]，加上受經濟條件、認知等原因的影響很難全面應用與生產。因此，培育抗病毒馬鈴薯品種可能是從根本上緩解這一問題的可行辦法。但由于栽培種馬鈴薯一般是四倍體無性繁殖材料，育種中存在基因分離復雜、花粉不育和現有栽培種基因庫狹窄等缺陷，極大地限制了可以利用的基因資源[9]。以轉基因、分子標記輔助育種為代表的現代生物育種技術是有效彌補不足的可行方法，可以加速實現馬鈴薯抗病毒特性的改良目的，但需要對病毒入侵后馬鈴薯的應答反應相關主要功能基因及其作用機理有較為清晰的認識。

抑制消減雜交(suppression subtractive hybridization，SSH) 技術是1996年由Diatchenko等[10]以mRNA差異顯示技術為基礎建立起來的一種利用抑制性PCR和差減雜交技術為基礎篩選差異表達基因的方法，由于該方法具有高效和假陽性率低的特點，目前已廣泛應用于植物抗病、抗逆、發育等差異表達基因篩選研究中[11-15]，但在馬鈴薯病毒病相關研究中的應用尚未見報道。

本研究以馬鈴薯病毒病攜帶植株葉片cDNA為試驗組(Tester)、脫毒種苗葉片cDNA為驅動組(Driver)，構建了馬鈴薯病毒誘導應答基因抑制消減雜交cDNA文庫，篩選與馬鈴薯病毒病致病、防御相關的應答基因并研究其轉錄模式，以期在整體水平上了解馬鈴薯與病毒互作的分子機理、克隆抗病基因奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

本實驗于2014年7月-2016年4月進行，以甘肅省農業科學院馬鈴薯研究所育成品種“隴薯8號”(對花葉病毒病和卷葉病毒病具有很好的田間抗性)葉片為受試材料，實驗組感病植株是從田間選取，驅動組脫毒種苗取材于馬鈴薯脫毒種苗繁育專用溫室，均隨機選取5株后混合取樣。

供試Clontech SMARTerTM PCR cDNA synthesis Kit、Clontech SMARTerTM PCR cDNA synthesis Kit、SYBR Premix ExTaq購自大連TAKARA 公司，RNA提取試劑TRIzol購自上海Invitrogen公司，測序、引物合成及克隆載體pUCm-T、DH5α感受態細胞、質粒提取試劑盒、非酶DNA清除劑、PCR產物回收、純化試劑盒購自上海生工生物工程有限公司。

1.2 RNA 的提取、純化及SSH文庫構建

取約100 mg 馬鈴薯葉片于液氮中研磨后參照Invitrogen公司TRIzol試劑說明書抽提總RNA，在氯仿抽提前加一步酚∶氯仿(24∶1)純化步驟，最后RNA溶液用上海生工非酶DNA清除劑純化，進一步提高了RNA的質量。

所獲得的RNA合成雙鏈cDNA后，分別感病植株cDNA 為實驗組，以脫毒種苗cDNA 為驅動組，按照PCR-SelectTM cDNA Subtraction Kit(Clontech，Cat. No. 637401)試劑盒說明書進行RsaⅠ酶切消化、接頭連接、雜交、PCR 擴增等操作，每步操作均設置3個平行實驗；采用StTublin基因引物PCR 檢測雜交效率，分別在18、20、22、24、26、28、30、32 個循環取PCR 產物進行凝膠電泳檢測。利用DNA 回收試劑盒回收第2次PCR 差減產物連接到pUCm-T克隆載體，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5α。

1.3 差減文庫的鑒定及ESTs 測序分析

隨機挑選轉化平板的白斑用pUCm-T載體M13引物(表1)PCR驗證為陽性克隆后送交生工生物工程(上海)股份有限公司測序。將測序結果用VectorScreen分離出載體序列，再對EST序列進行比對后獲得非冗余序列，再用tblastx(Search translated nucleotide database using a translated nucleotide query)進行同源性搜索分析基因功能。

1.4 候選基因Real-time PCR 驗證

應用Invitrogen公司TRIzol試劑提取對照組和處理組的葉片總RNA，應用Clontech SMARTerTM PCR cDNA synthesis Kit試劑盒反轉錄合成cDNA，進行qRT-PCR分析，參考試劑盒說明書建成20 μL反應體系，反應條件為95 ℃預變性2 min，95 ℃變性20 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環，延伸階段收集信號，從58 ℃到95 ℃，采集熔解曲線熒光信號。選取其中2個差異表達基因，利用Primer Premier 6.0 軟件分別設計差異表達ESTs正、反向引物，以馬鈴薯持家基因StTublin為內參，做3次重復計算基因的相對表達量(表1)。

2 結果與分析

圖1 馬鈴薯塊莖RNA電泳Fig.1 Total RNA tested by agarose gel M：DNA marker；1～3：驅動組總RNA Driver total RNA；4～6：試驗組總RNA Tester total RNA.

2.1 RNA的分離與質量檢測

圖1是用Invitrogen公司Trizol 試劑盒提取馬鈴薯葉片總RNA，總RNA經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，其28S和18S RNA帶型清晰可見，且比例適當，表明總RNA質量好、純度高，滿足文庫構建的要求。以該RNA作模板，以OligodT18 為引物進行反轉錄獲得第一鏈cDNA，再進一步合成雙鏈cDNA用于后續實驗。

2.2 雙鏈cDNA 酶切效果檢測

為了驗證長片段雙鏈cDNA 是否被充分消化成小片段，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切前后的雙鏈cDNA，酶切前雙鏈cDNA 分布在100～2000 bp(圖2：Lane 1，3)，經高頻四堿基內切酶RsaⅠ酶切后，雙鏈cDNA 分布范圍明顯下移(圖2：Lane 2，4)，說明RsaⅠ已將較長的雙鏈cDNA 消化成帶有粘性平末端的小片段，達到了實驗預期，保證了實驗操作的準確性。

2.3 接頭連接及連接效率檢測

圖2 雙鏈cDNA酶切效果驗證Fig.2 ds-cDNA enzyme digestion efficiency M：DNA marker；1，3：未經過Rsa I酶切的驅動組雙鏈cDNA、試驗組雙鏈cDNA Driver ds-cDNA and Tester ds-cDNA；2，4：經過Rsa I酶切的驅動組雙鏈cDNA、試驗組雙鏈cDNA Driver ds-cDNA and Tester ds-cDNA after Rsa I digestion.

圖3 接頭連接效果PCR驗證Fig.3 Detection of ligation efficiency of adaptor M：DNA marker；1，2：與接頭1的連接產物 Ligased with adaptor 1；3～6：與接頭2R的連接產物 Ligased with adaptor 2R；1，3，5：PCR Primer 1和StTublin 3′引物組合PCR產物 Product of Primer 1 and StTublin 3′primer；2，4，6：StTublin引物PCR產物 Product of StTublin primer.

圖4 巢式PCR產物檢測Fig.4 Nested PCR products tested by agarose gel

ds-cDNA與接頭連接效率的高低是決定抑制性消減雜交成敗非常關鍵的一步。將經酶切驗證可用的實驗組雙鏈cDNA分成兩份， 分別連接接頭Adaptor 1和Adaptor 2R以便于后續的消減雜交。連接產物分別用試劑盒提供引物Primer 1和馬鈴薯持家基因StTublin反向引物組合以及馬鈴薯持家基因StTublin正反向引物組合(擴增片段內不含RsaI酶切位點)進行PCR擴增檢測。結果顯示(圖3)，持家基因的3′反向引物與接頭的外側引物Primer 1組合的擴增片段(連接接頭的PCR產物)大于StTublin正反向引物組合的擴增片段，與預期結果一致。

2.4 巢式PCR產物檢測

消減雜交后富集的差異表達基因片段再經過兩次PCR擴增，第1次僅末端具有不同接頭的雙鏈cDNA呈指數擴增，在第2次巢式PCR將進一步降低背景和富集差異表達序列。實驗結果顯示，第2輪巢式PCR在擴增到15個循環時已經有較多的擴增產物出現，大小分布在100 bp到500 bp之間(圖4)，可以保證后續實驗的順利進行。

2.5 消減效率的PCR分析

用馬鈴薯內標基因StTublin引物進行PCR驗證消減效率，結果顯示在消減雜交產物中均不能擴增出目標產物，而非消減雜交對照組在22個循環就有目標條帶出現(圖5)，說明本實驗消減雜交成功，消減效率較高。

2.6 陽性克隆的獲得與篩選

2次PCR產物純化后連接到克隆載體pUCm-T后轉化大腸桿菌感受態細胞DH5α，轉化后涂布在含有X-gal和IPTG的Amp抗性LB平板上生長16 h，將其于4 ℃放置24 h后，挑選白斑于液體LB培養基培養10 h。以菌液為模板PCR鑒定陽性克隆結果顯示，在隨機挑選的28個克隆中，陽性克隆為27個，片段大小分布在200 bp到600 bp之間(圖6)，陽性重組率大于95%，滿足隨機挑選克隆測序要求，從而成功建立了馬鈴薯淀粉合成積累相關抑制消減雜交文庫。

2.7 差異表達ESTs測序與分析

根據所獲得的PCR產物大小隨機挑選了98個陽性克隆經PCR驗證后送交上海生工測序后，將測序結果用VectorScreen分離出載體序列，再對EST序列進行比對后獲得45條非冗余序列，再用tblastx(Search translated nucleotide database using a translated nucleotide query)進行同源性分析基因功能。結果顯示(表2)，45 條非冗余序列中有9條序列尚無同源序列，14條序列屬于馬鈴薯病毒基因片段，此外還有與植物抗病毒相關LRR類轉錄因子、衰老相關基因等，說明本文庫質量較高，差異表達基因與馬鈴薯病毒致病及防御過程密切相關。

圖5 消減效率的PCR檢測Fig.5 Reduction efficiency by PCR analysis M：DNA marker；H：H2O；1：消減組cDNA Subtracted cDNA；2：未消減cDNA Unsubtracted cDNA；18C～32C：循環數Cycles number.

圖6 陽性克隆PCR篩選電泳Fig.6 PCR products of positive clones which were selected randomly M：DNA marker；H：H2O；1～14： PCR擴增的插入片段The PCR products of the inserts.

表2 非冗余序列Blast注釋結果Table 2 Non redundant sequence Blast annotation results

2.8 差異表達基因Real-time PCR驗證

選取文庫中出現頻率較高、片段較長而易于設計引物的2個ESTs：一個是與植物抗病毒相關LRR類蛋白基因(EST1)，一個是Blast比對無同源序列的EST(EST2)。用qRT-PCR技術，檢測上述ESTs代表的基因在馬鈴薯病毒侵染前后的表達情況。結果發現，這兩個ESTs在脫毒種苗中表達量很低或者幾乎沒有表達，但是在感染病毒的植株中表達水平急劇升高(圖7)，兩個ESTs在病毒侵染前后的相對表達量差異均達到了極顯著水平(PEST1=0.000219<0.01，PEST2=0.00038<0.01)， 這初步說明上述兩個ESTs所代表的基因參與了馬鈴薯對病毒侵染脅迫的應答反應。

圖7 差異表達ESTs的qRT-PCR驗證Fig.7 Validation for the differential expression ESTs by qRT-PCR EST1：LRR類轉錄因子LRR type transcription factor；EST2：未知功能基因Functional unknown gene.

3 討論

3.1 SSH文庫的構建

基因的差異表達是調控生命活動的核心，通過比較同一植物組織在不同的病理條件下的基因表達差異是揭示植物病害致病機理及植物對病害防御機理的重要手段，抑制消減雜交技術的應用加快了基因差異表達分析的速度[16]。目前為止，抑制消減雜交技術已廣泛應用于植物抗逆、抗病及生長發育相關領域[11-15]，但在馬鈴薯病毒病入侵及抗病機理方面還沒有相關研究報道。本研究以馬鈴薯病毒病攜帶植株的RNA為試驗組(Tester)、脫毒種苗RNA為驅動組(Driver)，構建了馬鈴薯病毒誘導應答基因抑制消減雜交cDNA文庫，篩選出病毒入侵前后的差異表達基因，為進一步深入研究馬鈴薯病毒入侵機制，克隆馬鈴薯抗病毒基因并利用基因工程手段創制抗病毒馬鈴薯新種質奠定了基礎。

但是抑制消減雜交技術也存在著一些不足，如：對實驗材料的需求量較多，不適于來源困難的樣品；得到的cDNA是限制酶消化后的小片段，進一步研究還需要擴增全長序列；要求對比實驗組之間的差異性較低等。此外，實驗本身的技術環節也存在不足，如酶切不完全、cDNA與接頭的鏈接效率不高等，都會降低消減效率，致使消減結果存在一定的假陽性。在本文庫的構建過程中，在每一個關鍵環節都進行了相應的驗證，保證了實驗結果的可靠性，差異表達ESTs測序結果顯示文庫內含有較多的病毒基因片段，選取的兩個差異表達ESTs在病毒浸染后的相對表達量均顯著提高，說明該消減文庫構建比較成功，文庫內包含的ESTs應該都是實驗組所特有的基因片段。

3.2 馬鈴薯抗病毒基因的篩選

由于馬鈴薯在生產中造成產量下降的一個主要原因就是種薯感染病毒后導致的，再加上脫毒種薯的生產成本較高，因此，科學家一直在致力于抗病毒馬鈴薯新品種的培育[17]。而由于轉基因技術的獨特優勢，科學家們也利用了多種轉基因策略創制抗病毒馬鈴薯新種質，尤其是在馬鈴薯中表達病毒外殼蛋白基因和利用病毒反義RNA技術創制抗病毒種質方面開展了較多的研究[18-23]，然而大多收效甚微或只能對一種病毒具有較好的效果，應用價值不高。因此，缺乏有效的抗病毒基因是利用基因工程技術培育馬鈴薯抗病毒品種多面臨的最大困難。

R基因能夠賦予植物對病毒、細菌、真菌等多種病原物的抗性，這種主動抗性依賴于寄主的R基因產物與病毒編碼的無毒因子(Avr)之間的特異性識別，是目前為止所知道的能夠賦予植物抗病性最好的基因[24]。目前克隆鑒定出來的植物抗病毒R基因中，絕大多數都是屬于NBS-LRR蛋白，這類蛋白因為都有保守的核酸結合位點(nucleotide binding site，NBS)和亮氨酸重復結構域(leucine-rich repeats，LRR)而得名[25-26]。NBS-LRR類基因是在植物中發現的成員最多、多樣性最豐富的基因家族之一，很多植物的基因組中含有很多個NBS-LRR蛋白家族成員，有報道指出二倍體栽培種馬鈴薯基因組中含有738個部分和完整的NBS-LRR序列[27]。目前從馬鈴薯中已克隆兩個抗PVX基因Rx1和Rx2，它們均編碼CC-NBS-LRR類型蛋白，特異性識別PVX的外殼蛋白(coat protein，CP)，兩者核酸序列也高度同源，轉基因煙草和馬鈴薯也表現出了對PVX的極端抗性[28-30]。

本研究所構建的馬鈴薯病毒誘導應答基因SSH文庫中就包含有一個具有亮氨酸重復結構域的LRR類蛋白基因，經Real-time PCR分析結果表明，該基因在不感染病毒的馬鈴薯植株中不表達，感染病毒植株中高表達。因此，該基因很可能是一個新的馬鈴薯抗病毒R基因，值得進一步深入研究。

References：

[1] Hawkes J. The Potato: Evolution, Biodiversity and Genetic Resources. London: Belhaven Press, 1990.

[2] Jansky S, Jin L, Xie K,etal. Potato production and breeding in China. Potato Research, 2009, 52(1): 57-65.

[3] Wang Q, Zhang W. An economic analysis of potato demand in China. American Journal of Potato Research, 2010, 87(3): 245-252.

[4] Wang B, Ma Y, Zhang Z,etal. Potato viruses in China. Crop Protection, 2011, 30(9): 1117-1123.

[5] Gebhardt C, Valkonen J P T. Organizatioin of genes controlling disease resistance in the potato genome. Annual Review of Phytopathology, 2001, 39(1): 79-102.

[6] Nie B H, Xie C H, Nie X Z. Progress in research on the resistance mechanism against viruses in potatoes. Acta Horticulturae Sinica, 2012, 39(9): 1703-1714.

聶碧華, 謝從華, 聶先舟. 馬鈴薯抗病毒機制研究進展. 園藝學報, 2012, 39(9): 1703-1714.

[7] Solomon-Blackburn R M, Barker H. Breeding virus resistant potatoes (Solanumtuberosum): A review of traditional and molecular approaches. Heredity, 2001, 86(1): 17-35.

[8] Wang X M, Jin L P, Yin J. Advances in research on potato virus breeding. Chinese Potato Journal, 2005, 19(5): 285-289.

王曉明, 金黎平, 尹江. 馬鈴薯抗病毒病育種研究進展. 中國馬鈴薯, 2005, 19(5): 285-289.

[9] Jia X X, Qi E F, Ma S,etal. Analysis of drought tolerance and herbicide resistance in transgenic potato plants over-expressing DREB1A/Bar. Acta Prataculturae Sinica, 2015, 24(11): 58-64.

賈小霞, 齊恩芳, 馬勝, 等. 轉DREB1A/Bar雙價基因馬鈴薯的耐旱性及除草劑抗性分析.草業學報, 2015, 24(11): 58-64.

[10] Diatchenko L, Lau Y F, Campbell A P,etal. Suppression subtractive hybridization: a method for generating differentially regulated or tissue-specific cDNA probes and libraries. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1996, 93(12): 6025-6030．

[11] Qiao S Y, Liu X Y, Wang Y H,etal. Constructing and analyzing SSH library for the early response genes in wheat brock afterBlumeriagraminisf.sp.tritici stress. Bulletin of Botanical Research, 2015, 35(1): 60-67.

喬石瑤, 劉曉穎, 王艷紅,等. 栽培小麥Brock白粉菌誘導早期應答基因SSH 文庫構建及分析. 植物研究, 2015, 35(1): 60-67.

[12] Li Z Y, Jia L X, Dong L,etal. Construction and preliminary analysis of the SSH library from the foxtail millet rust resistant variety of Shilixiang. Acta Agriculturae Boreali-Sinica, 2014, 29(6): 126-130.

李志勇, 賈麗霞, 董立, 等. 谷子十里香抗銹抑制消減雜交文庫構建及初步分析. 華北農學報, 2014, 29(6): 126-130.

[13] Han M P, Wang Y H, Gao Y G,etal. Construction of differently expressed cDNA library of alfalfa by using suppression subtractive hybridization under the high temperature. Acta Prataculturae Sinica, 2011, 20(5): 126-132.

韓明鵬, 王彥華, 高永革, 等. 高溫脅迫下紫花苜蓿抑制消減文庫的構建. 草業學報, 2011, 20(5): 126-132.

[14] Wang T Z, Zhao M G, Zhang W H. Construction and analyses of two suppression subtractive hybridization libraries of Medicago falcate and Medicago truncatula under drought stress. Acta Prataculturae Sinica, 2012, 21(6): 175-181.

王天佐, 趙敏桂, 張文浩. 干旱脅迫下黃花苜蓿與蒺藜苜蓿兩個抑制性差減雜交文庫的構建及分析. 草業學報, 2012, 21(6): 175-181.

[15] Min Z, Geng W G, Fang Y L,etal. Screening and identification of differentially expressed endodormant genes from latent buds and prompt buds by suppression subtractive hybridization. Scientia Agricultura Sinica, 2014, 47(5): 1029-1040.

閔卓, 耿萬剛, 房玉林, 等. 應用抑制消減雜交技術篩選葡萄冬芽和夏芽生理休眠相關基因. 中國農業科學, 2014, 47(5): 1029-1040.

[16] Diatchenko L, Lukyanov S, Lau Y F C,etal. Suppression subtractive hybridization: a versatile method for identifying differentially expressed genes. Methods in Enzymology, 1999, 303: 349-380.

[17] Chen Y L, Shi Y, Wang F Y. Utilization of new cultivars in China potato breeding//Chen Y L. Potato Research and Industry Development in China. Harbin: Harbin Engineering University Press, 2003, 70-76.

陳伊里, 石瑛, 王鳳義. 新型栽培種在中國馬鈴薯育種中的利用//陳伊里. 中國馬鈴薯研究與產業開發. 哈爾濱: 哈爾濱工程大學出版社, 2003: 70-76.

[18] Song Y R, Ma Q H, Hou L L,etal. Transgenic potato with PVY coat protein gen and it’s small-scale field test. Acta Botanica Sinica, 1996, 38(9): 711-718.

宋艷茹, 馬慶虎, 侯林林, 等. 轉PVY外殼蛋白基因馬鈴薯及其田間實驗. 植物學報, 1996, 38(9): 711-718.

[19] Cui X J, Peng X X, Shen Y F,etal. Cloning and sequencing of PLRV coat protein gene and construction of vectors for transgenic potato resistant to coinfection of PVY, PVX and PLRV. Chinese Journal of Biotechnology, 1994, 10(2): 185-189.

崔曉江, 彭學賢, 沈禹飛, 等. 馬鈴薯單雙三價抗病毒基因表達載體的構建. 生物工程學報, 1994, 10(2): 185-189.

[20] Xiang Y, Yang L Y, Peng X X,etal. High virus-resistance of transgenic tobacco plants mediated by expression of modified Nib gene of potato virus Y. Chinese Journal of Biotechnology, 1996, 12(3): 258-265.

項瑜, 揚蘭英, 彭學賢, 等. 改造的馬鈴薯Y 病毒復制酶基因介導高度抗病性. 生物工程學報, 1996, 12(3): 258-265.

[21] Dong J L, Hasi A, Zhang H L. The cDNA cloning and nucleotide sequence analysis of potato leafroll virus intergenic region. Virologica Sinica, 1996, 11(2): 144-148.

董江麗, 哈斯阿古拉, 張鶴齡. 馬鈴薯卷葉病毒基因間隔區的克隆及序列分析. 中國病毒學, 1996, 11(2): 144-148.

[22] Lamb J W, Hay R T. Ribozymes that cleave potato leafroll virus RNA within the coat protein and polymerase gene. Journal of General Virology, 1990, 71: 2257-2264.

[23] Yang X C, Zhu F, Liu Y L. The study on ribozyme gene of potato spindle tuber viroid//Chen Y L. Chinese Potato Academic Proceedings. Harbin: Heilongjiang science and Technology Press, 1996: 262-263.

楊希才, 朱峰, 劉玉樂. 抗馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的轉核酶基因研究//陳伊里. 中國馬鈴薯學術研討文集. 哈爾濱: 黑龍江科學技術出版社, 1996: 262-263.

[24] Martin G B, Bogdanove A J, Sessa G. Understanding the functions of plant disease resistance proteins. Annual Review of Plant Biology, 2003, 54: 23-61.

[25] Jones J D G, Dangl J L. The plant immune system. Nature, 2006, 444: 323-329.

[26] Moffett P. Mechanisms of recognition in dominant R gene mediated resistance. Advances in Virus Research, 2009, 75: 1-33.

[27] Bakker E, Borm T, Prins P,etal. A genome-wide genetic map of NB-LRR disease resistance loci in potato. Theoretical and Applied Genetics, 2011, 123(3): 493-508.

[28] Bendahmane A, Querci M, Kanyuka K,etal. Agrobacterium transient expression system as a tool for the isolation of disease resistance genes: Application to the Rx2 locus in potato. The Plant Joural, 2000, 21(1): 73-81.

[29] Grube R C, Radwanski E R, Jahn M. Comparative genetics of disease resistance within the Solanaceae. Genetics, 2000, 155(2): 873-887.

[30] Kang B C, Yeam I, Jahn M M. Genetics of plant virus resistance. Annual Review of Phytopathology, 2005, 43(1): 581-621.

Constructionandanalysisofasuppressionsubtractivehybridizationlibraryforthepotatovirusinducedresponsegene

LI Zhong-Wang, CHEN Yu-Liang, OU Qiao-Ming, YE Chun-Lei, PEI Huai-Di, LIU Xin-Xing,WANG Hong-Mei, LUO Jun-Jie*

BiotechnologyInstitute,GansuAcademyofAgriculturalSciences,Lanzhou730070,China

Potato virus accumulation is one of the important reasons for the decline of yield and quality in potato production. In order to screen and clone the potato virus induced response gene, we constructed a suppression subtractive hybridization (SSH) library using cDNAs from potato virus disease carrying plant leaf as the tester, and those cDNAs from a virus-free seedling leaf as the driver. To verify the effect of library, 98 randomly selected positive clones were identified by PCR from the library and sequenced, and 45 high quality non repeat sequences were obtained. By blast analysis in GenBank, we found that 14 of them were sequences belonging to the potato virus gene, 22 of them had high homology with known genes, and 9 of them had no homologous reference gene. Two frequently found ESTs in the library were analyzed using quantitative real time PCR, and their expression was induced by potato virus. The results therefore showed that the SSH library was constructed successfully. This work has thus laid a foundation for further screening for potato virus related pathogenicity, and induction of corresponding defense response genes. This may lead to analysis of the molecular mechanisms of interaction between the potato plant and the virus, and use of biotechnology to cultivate virus resistant potato varieties.

potato; virus; response gene; suppression subtractive hybridization

10.11686/cyxb2017063http//cyxb.lzu.edu.cn

李忠旺, 陳玉梁, 歐巧明, 葉春雷, 裴懷弟, 劉新星, 王紅梅, 羅俊杰. 馬鈴薯病毒誘導應答基因抑制消減雜交文庫構建及分析. 草業學報, 2017, 26(12): 152-159.

LI Zhong-Wang, CHEN Yu-Liang, OU Qiao-Ming, YE Chun-Lei, PEI Huai-Di, LIU Xin-Xing, WANG Hong-Mei, LUO Jun-Jie. Construction and analysis of a suppression subtractive hybridization library for the potato virus induced response gene. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(12): 152-159.

2017-02-20；改回日期：2017-04-19

甘肅省農科院青年創新基金(2013GAAS29),甘肅省農業科學院創新團隊(2015GAAS02),甘肅省農業科學院農業科技創新重大項目(2016GAAS59-02)和國家自然科學

基金項目(31460388)資助。

李忠旺(1980-)，男，甘肅山丹人，助理研究員。E-mail: lizhongwang33@163.com*通信作者Corresponding author. E-mail：hnsljjie@163.com