miR-221/miR-222家族在神經膠質瘤患者腦脊液中的表達及其診斷價值

張青，仇誠，夏東彥，李英斌

·神經生物學研究·

miR-221/miR-222家族在神經膠質瘤患者腦脊液中的表達及其診斷價值

張青，仇誠，夏東彥，李英斌

目的探討miR-221/miR-222在膠質瘤患者腦脊液中的表達及其診斷價值。方法采用實時熒光定量PCR檢測31例膠質瘤患者和33例非膠質瘤患者的腦脊液miR-221/miR-222表達水平，并采用ROC曲線評價其診斷膠質瘤的價值。結果miR-221和miR-222在膠質瘤患者腦脊液中的表達水平均明顯高于對照組(均P<0.001)。高級別膠質瘤患者的腦脊液miR-221、miR-222表達水平高于低級別組，其中miR-222表達水平的差異具有統計學意義(1.49倍，P=0.007)。腦脊液miR-221、miR-222的表達水平都能將膠質瘤患者與對照者區分開；而二者聯合診斷膠質瘤的曲線下面積(AUC)為0.849，靈敏度為81.8%，特異度為83.9%。結論腦脊液中高表達的miR-221/miR-222有可能作為膠質瘤診斷的生物標志物。

膠質瘤；腦脊液；miR-221/miR-222；診斷

神經膠質瘤是起源于神經膠質細胞的腫瘤，是中樞神經系統原發惡性腫瘤中最常見的一種類型，約占全部顱內腫瘤的40%～50%[1-2]。膠質瘤細胞在腦組織中呈彌漫、浸潤性生長，且隨著腫瘤級別的增加而侵襲性增強。由于腫瘤組織與正常腦組織分界不清，常規手術難以徹底切除腫瘤；且膠質瘤對放化療均不敏感，使得膠質瘤患者的預后很差，中位生存期只有14個月；大部分腦膠質瘤患者在診斷后的兩年內死亡[3]。早期診斷，并對膠質瘤患者進行早期干預，能提高患者的生存期和生存質量。目前臨床上主要通過影像學檢查對膠質瘤進行術前診斷，并通過病理檢查進行確診。但是影像學檢查診斷膠質瘤的特異性和敏感性并不十分理想[4]。目前還未發現外周血或者腦脊液中有較為理想的，用于輔助診斷膠質瘤的生物標志物。

MicroRNA(miRNA)是一類長度約為22個核苷酸的小非編碼RNA分子，可與靶基因的3’UTR進行特異性結合從而對靶基因進行調控，進而廣泛參與機體的正常生理及病理過程[5]。有許多研究表明，miRNA在腫瘤的發生、進展、診斷及預后和治療中起重要的基因調控作用[6-8]。近年來大量研究發現，miRNA可以穩定存在于血液、尿液和腦脊液等體液中，且可以作為眾多腫瘤潛在的無創性診斷標志物[9-11]。多個研究顯示，miR-221/miR-222在膠質瘤組織、細胞系及血液中呈高表達，并具有癌基因的作用[12-14]。目前還很少有關于miR-221/miR-222家族在膠質瘤患者的腦脊液中表達水平的報道；只有1篇研究報道miR-221在神經膠質瘤患者的腦脊液中呈高表達，但并未分析其潛在的診斷價值[15]。本研究通過檢測31例神經膠質瘤患者和33例對照者的腦脊液miR-221/miR-222表達水平，并進行分析比較；以探討miR-221/miR-222在膠質瘤患者腦脊液中的表達，以及其作為診斷膠質瘤的生物標志物的價值。

1 資料與方法

1.1 資料 (1)膠質瘤組：系南京醫科大學第二附屬醫院神經外科于2013年1月～2017年2月收治的經病理學檢查確診的31例神經膠質瘤患者，男性18例，女性13例，年齡17～76歲，平均年齡(50.8±13.9)歲；術前均未進行放化療治療；根據世界衛生組織(WHO)的分級標準，低級別膠質瘤14例(WHO Ⅰ級5例，Ⅱ級9例)，高級別膠質瘤17例(WHO Ⅲ級11例，Ⅳ級6例)。(2)對照組：為同期在我科行腰穿腦脊液常檢查結果正常，且無腫瘤、肝腎功能異常、中樞神經系統感染或全身感染的33例患者，男性17例，女性16例，年齡25～75歲，平均年齡(48.5±14.6)歲。兩組患者的性別及年齡比較，差異無統計學意義。所有研究對象均簽署了知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 腦脊液標本采集 兩組患者在治療前行腰穿腦脊液檢查時，留取腦脊液標本1 ml，采用4℃離心機兩部離心法(1 500 r/min，10 min；12 000 r/min，2 min)去除細胞等成分后，存于-80℃冰箱待成批進行檢測。

1.2.2 腦脊液RNA的提取 采用mirVana microRNA isolation kit試劑盒(美國Life公司)對腦脊液中的RNA進行提取。每例腦脊液標本取200 μl，加入試劑盒中提供的裂解液200 μl并充分混勻，隨后加入5 μmol/L cel-miR-39標準品(廣州銳博生物技術有限公司)5 μl，按照說明書進行RNA提取，并溶于60 μl的DEPC水中放置于-80℃冰箱備用。利用紫外分光光度計對所提取的RNA的濃度及純度進行分析。

1.2.3 miR-221/miR-222表達的檢測 采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)方法。miR-221/miR-222及cel-miR-39(用作參照基因)的特異性RT-PCR引物均購于廣州RiboBio公司。逆轉錄采用25 μl體系：RNA模板15 μl和500 nM RT primer 2 μl， 經70℃ 10 min，4℃ 4 min后，再加入RT buffer 5 μl， reverse transcriptase 0.5 μl，dNTPs Mixture 2 μl，RNA inhibitor 0.5 μl和DEPC水7.5 μl，經42℃ 60 min，70℃ 10 min生成cDNA。使用SYBR Premix體系(大連寶生物工程有限公司)在ABI 7900實時定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)上進行PCR反應。采用5 μl反應體系：cDNA 0.5 μl，PCR引物工作液 1 μl，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ熒光染料 2.5 μl和DEPC水1 μl。反應條件為95℃ 20 s，95℃ 10 s ，60℃ 20 s及70℃ 10 s；共40個循環。每例腦脊液標本均進行3次檢測。反應結束后分析PCR擴增曲線，根據得到的Ct值，并與參照基因cel-miR-39進行標準化后，計算腦脊液miR-221/miR-222的表達水平。腦脊液miR-221/miR-222的表達水平以2-△△Ct表示，其中△Ct=Ct樣本-Ctcel-miR-39，△△Ct=△Ct病例-△Ct對照。

2 結 果

2.1 膠質瘤組與對照組腦脊液miR-221/miR-222表達水平的比較 見圖1、2。圖1A和圖1B為部分樣本qRT-PCR的擴增曲線(A)和溶解曲線(B)。從圖中可以看出，能較好地檢測出腦脊液的miR-221/miR-222表達水平，且引物具有較高的特異性，表明實驗的可靠性。兩組腦脊液miR-221和miR-222表達水平的比較，膠質瘤組的腦脊液miR-221(△Ct值7.47±1.16)和miR-222(△Ct值6.32±0.93)表達水平分別是對照組的2.89倍(△Ct值8.87±0.87)和2.38倍(△Ct值7.36±1.25)，差異均有統計學意義(均P<0.001)。

圖1 qRT-PCR的擴增曲線(A)和溶解曲線(B)

圖2 膠質瘤組與對照組腦脊液miR-221和miR-222表達水平的比較(注：與對照組比較*P<0.05)

2.2 低級別與高級別膠質瘤患者的腦脊液miR-221/miR-222表達水平比較 見圖3。高級別膠質瘤患者的腦脊液miR-221及miR-222表達水平均比低級別膠質瘤患者高，但只有miR-222表達水平的差異有統計學意義(1.49倍，P=0.007)。但是無論是低級別還是高級別膠質瘤患者的腦脊液miR-221(低級別：2.43倍，P=0.001；高級別：3.28倍，P<0.001)和miR-222表達水平(低級別：1.88倍，P=0.001；高級別：2.79倍，P<0.001)均顯著高于對照組。

2.3 腦脊液miR-221、miR-222表達及二者聯合診斷膠質瘤的價值 通過受試者工作特征(ROC)曲線分析評價腦脊液miR-221/miR-222表達水平作為診斷膠質瘤標志物的可能性。結果顯示，腦脊液miR-221和miR-222能夠分別以0.831(95%可信區間：0.727～0.935)和0.773(95%可信區間：0.643～0.903)的曲線下面積(AUC)，將膠質瘤組患者與對照組區分開(圖4A、4B)。最佳臨界點的靈敏度分別為90.9%和81.8%，特異度為67.7%和 83.9%。同時，進一步分析miR-221與miR-222聯合診斷膠質瘤的價值。miR-221與miR-222聯合所得到的AUC為0.849(95%可信區間：0.749～0.95)，比單獨任一miRNA的AUC都要大；最佳臨界點的靈敏度為81.8%，特異度為83.9%(圖4C)。

圖3 低級別和高級別腦膠質瘤患者及對照組腦脊液miR-221、miR-222表達水平的比較(注：與對照組或低級別組比較*P<0.05)

圖4 腦脊液miR-221(A)、miR-222(B)及二者聯合(C)診斷膠質瘤的ROC分析

3 討 論

越來越多的研究顯示，miRNA廣泛參與腫瘤發生、發展的過程。2008年，Mitchell等首先發現miRNA能夠穩定存在于外周血中，并能作為診斷前列腺癌的潛在標志物[16]。這一發現啟動了眾多研究者探索體液miRNA作為腫瘤生物標志物的研究工作。

膠質瘤是臨床上最常見的顱腦惡性腫瘤。根據WHO的分類方法，膠質瘤被分為WHO Ⅰ～Ⅳ級，其中Ⅰ、Ⅱ級為低級別膠質瘤，Ⅲ、Ⅳ級為高級別膠質瘤[17]。由于腫瘤浸潤性生長的特性，且級別越高的膠質瘤侵襲性越強，導致手術難以對腫瘤組織進行完全切除。手術、放化療是目前針對膠質瘤的主要治療方法，雖取得了一定的進展，但膠質瘤患者的預后仍不容樂觀[18]。而早期診斷、早期干預能夠提高患者的生存以及生活質量。

現階段，已有多項研究通過分析膠質瘤患者與對照者之間的miRNA表達譜的差異，來尋找潛在的可用于輔助診斷膠質瘤的miRNA。其中，miR-221/miR-222被證實在膠質瘤組織、細胞系以及血漿中呈高表達。miR-221和miR-222基因是較為明確的原癌基因簇，二者呈前后排列，位于Xp11.3區約1 kb的區域內，是成簇分布的miRNA，在胃癌、肝癌、結腸癌、惡性黑色素瘤、前列腺癌、肺癌等惡性腫瘤中表達異常[15]。miR-221和miR-222的種子序列完全同源，具有許多相同的作用靶點，在膠質瘤中發揮著癌基因的作用。高表達的miR-221/miR-222可促進膠質瘤細胞生長、侵襲以及血管生成，是膠質瘤患者預后不良的因素[19-22]。最近的研究發現，miR-221/miR-222通過靶向TIMP2 促進人體神經膠質瘤細胞侵襲和血管生成[22]。同時，血漿中高表達的miR-221/miR-222也可以作為膠質瘤患者非侵入性的診斷以及預后評判的標志物[23]。但是，目前還沒有關于miR-221/miR-222家族在膠質瘤患者腦脊液中的表達水平，及其診斷意義的相關研究。

本研究通過qRT-PCR的方法對31例膠質瘤患者和33例對照者的腦脊液miR-221/miR-222表達水平進行定量檢測，并進一步分析腦脊液miR-221/miR-222作為診斷膠質瘤生物標志物的價值。結果顯示，miR-221和miR-222在膠質瘤患者腦脊液中的表達水平均顯著高于對照組(均P<0.001)。且與低級別膠質瘤患者比較，高級別膠質瘤患者腦脊液miR-221和miR-222的表達水平更高，但只有miR-222表達水平的差異具有統計學意義(1.49倍，P=0.007)。這表明miR-221與膠質瘤的惡性程度及侵襲性可能有密切關系。而miR-221在低級別與高級別膠質瘤患者的腦脊液表達水平之間的差異無統計學意義；這可能與本組的樣本數較少有關，有待收集更多的病例進一步研究。通過ROC曲線分析發現，腦脊液miR-221與miR-222都能夠很好地將膠質瘤與對照組患者區分開。進一步的合并分析結果顯示，miR-221與miR-222聯合診斷膠質瘤的價值要高于單一的miRNA，且靈敏度和特異度也都要好于單一的miRNA。這一結果也表明，腦脊液miR-221、miR-222表達的聯合檢測對于診斷膠質瘤具有十分重要的價值。

相較于外周血漿、血清，腦脊液樣本受細胞、蛋白等影響較小；因此其可能是檢測miRNA的更好的樣本來源。但由于腦脊液標本不易獲得，導致本研究的樣本數偏少。將來的研究應納入更多的樣本數，將更有利于驗證檢測腦脊液miR-221/miR-222表達水平對膠質瘤的診斷價值。

綜上所述，本研究通過分析比較膠質瘤患者與對照者的腦脊液miR-221/miR-222表達水平的差異，發現其有作為診斷膠質瘤的生物標志物的潛力。

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IdentificationofmiR-221/miR-222incerebrospinalfluidasbiomarkerfordiagnosisofglioma

ZHANGQing,QIUCheng,XIADong-yan,etal.

DepartmentofNeurosurgery,theSecondClinicalMedicalCollegeofNanjingMedicalUniversity,Nanjing210011,China

LIYing-bin

ObjectiveTo explore different expression of miR-221/miR-222 in cerebrospinal fluid (CSF) between glioma patients and controls,and investigate the potential role of CSF miR-221/miR-222 in detecting glioma.MethodsA total of 31 glioma patients and 33 non-glioma patients (controls) were enrolled in our study.Expression levels of CSF miR-221/miR-222 were analyzed by quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR).Diagnostic value of CSF miR-221/miR-222 was assessed by receiver operating characteristic (ROC) method.ResultsCSF miR-221 and miR-222 were significantly higher in glioma patients compared with controls (allP<0.001).The expression of miR-221/miR-222 in the CSF of patients with high grade glioma was higher than that in low grade glioma,and the difference of miR-222 expression was statistically significant (1.49 fold,P=0.007).The area under the ROC curve (AUC) of the combination of the two miRNAs was 0.849,with sensitivity of 81.8% and specificity of 83.9%.ConclusionmiR-221/miR-222 in CSF can serve as a biomarker in diagnosing glioma.

glioma;cerebrospinal fluid;miR-221/miR-222;diagnosis

南京市科技計劃項目基金(201303042)

210011 南京，南京醫科大學第二臨床醫學院(南京醫科大學第二附屬醫院)神經外科

李英斌

10.3969/j.issn.1672-7770.2017.06.001

R739.41

A

1672-7770(2017)06-0401-05

(收稿2017-07-26 修回2017-10-08)