免疫增強(qiáng)藥物“歸芪飲”臨床劑量的確定

王玉坤 劉文利 王尚明 李 麗 （山東迅達(dá)康獸藥有限公司 山東 濟(jì)南 250300）

韓征軍 （山東省萊州市柞村畜牧獸醫(yī)站）

免疫增強(qiáng)藥物“歸芪飲”臨床劑量的確定

王玉坤 劉文利 王尚明 李 麗 （山東迅達(dá)康獸藥有限公司 山東 濟(jì)南 250300）

韓征軍 （山東省萊州市柞村畜牧獸醫(yī)站）

為研究歸芪飲對雞免疫增強(qiáng)效果,確定臨床用藥劑量。選用23日齡非免疫健康羅曼蛋公雞640羽隨機(jī)均分6個不同劑量用藥組、1個疫苗對照和1個空白對照組，另取60羽設(shè)1個疫苗對照組和1個空白對照組，30羽/組，除空白對照組外均用新城疫Ⅳ系苗滴鼻、點(diǎn)眼免疫(3羽份/羽)，37日齡二免。結(jié)果顯示，各組給藥后未見任何不良反應(yīng)，各劑量組在各時間點(diǎn)的抗體效價多明顯或顯著高于疫苗對照組和空白對照組，1g/ml劑量組雞只末重顯著增加，1g/ml、1.5g/ml劑量組日增重顯著高于對照組，料重比顯著低于對照組，2g/ml劑量組料重比顯著低于對照組；1.5g/ml組的攻毒保護(hù)率最高，其次為1g/ml劑量組；體外試驗(yàn)結(jié)果顯示，歸芪飲在合適的劑量可以刺激外周血T淋巴細(xì)胞增殖。表明歸芪飲臨床應(yīng)用安全，增強(qiáng)細(xì)胞免疫和體液免疫的效果確實(shí)，可以將1～2g/ml劑量作為臨床試驗(yàn)應(yīng)用劑量，1g/ml劑量最佳。

歸芪飲 臨床給藥反應(yīng) 抗體效價 生長性能 攻毒保護(hù) 體外增殖

歸芪飲是以當(dāng)歸、黃芪、淫羊藿、山楂、枸杞、蒼術(shù)六味中藥經(jīng)過現(xiàn)代工藝提取制成的口服液，是一種具有免疫增強(qiáng)作用的復(fù)方制劑。藥效試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)歸芪飲具有較佳的免疫增強(qiáng)作用，能夠有效提高雞體的體液免疫功能，顯著增強(qiáng)新城疫疫苗的免疫效果。本試驗(yàn)進(jìn)一步觀察了系列劑量的歸芪飲對雞的給藥反應(yīng)和對新城疫苗免疫效果的影響，及其在體外對T淋巴細(xì)胞增殖作用的影響，旨在確證歸芪飲的安全性和藥理作用，并為臨床試驗(yàn)篩選出最佳劑量。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物 試驗(yàn)藥品由山東迅達(dá)康獸藥有限公司提供。分別將藥液配制成濃度為0.5、1、1.5、2、2.5、3g/ml。

1.2 疫苗和毒株 新城疫IV系疫苗(LaSota株)，新城疫檢測抗原，用新城疫IV系弱毒苗。新城疫強(qiáng)毒株，由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。

1.3 主要試劑 淋巴細(xì)胞分離液。植物血凝素(pHA)，Sigma分裝，用RPMI1640培養(yǎng)液配制成0.5mg/ml，0.22μm的微孔濾膜過濾除菌，分裝-20℃保存。四甲基偶氮藍(lán)(MTT)溶液(Sigma進(jìn)口分裝)，用pH值7.4的PBS配成成5mg/ml的溶液，0.22μm微孔濾膜過濾除菌，分裝，4℃避光保存。裂解液，二甲基亞砜(DMSO)，Sigma分裝。

1.4 動物分組及處理 1日齡非免疫健康羅曼蛋公雞飼養(yǎng)至23日齡(平均體重161g/羽，平均母源抗體效價3.5Log2)時，取640羽隨機(jī)均分為8組，每個組4個重復(fù)，分別為6個不同劑量用藥組、1個疫苗對照和1個空白對照組；另取60羽設(shè)1個疫苗對照組和1個空白對照組，30羽/組，隔離飼養(yǎng)，除2個空白對照組外均用新城疫Ⅳ系苗滴鼻、點(diǎn)眼免疫(3羽份/羽)，37日齡二免。在首次免疫的同時，6個用藥組分別飲水添加6種濃度的的歸芪飲(即分別為每羽0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5g生藥量)，0.5ml/羽，1次/d，連續(xù)3d。然后進(jìn)行臨床觀察和免疫效果測定。分別于首次免疫后第7(D7)、14(D14)、21 (D21)、28(D28)、35(D35)、42(D42)天，每組隨機(jī)抽取20羽，翼下靜脈采血，分離血清，用β-微量法檢測血凝抑制(HI)抗體效價。于免疫后第2、4、6周各組隨機(jī)抽取 20只稱取體重，每個重復(fù)5只。自由采食飲水，計(jì)算各組平均日增重和料肉比。

1.5 攻毒保護(hù)試驗(yàn) 于首次免疫后第8周用新城疫尿囊液進(jìn)行人工攻毒。試驗(yàn)共設(shè)8個組：0.5、1、1.5、2g/ml4個劑量組(50羽/組)，1個疫苗攻毒對照組(50羽/組)，1個空白攻毒對照組(50羽/組)，1個疫苗對照組(30羽/組)和1個空白對照組(30羽/組)。攻毒劑量為10-7雞胚尿囊液，0.5ml/羽。攻毒后觀察臨床癥狀和病理變化，并比較其嚴(yán)重程度，記錄發(fā)病數(shù)、存活數(shù)。待雞群死亡率穩(wěn)定后結(jié)束觀察。

1.6 體外試驗(yàn) 成年雞無菌采血，分離淋巴細(xì)胞，活細(xì)胞計(jì)數(shù)后，用RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106個/ml，加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，80μl/孔，分別加安全濃度范圍內(nèi)5個濃度的歸芪飲溶液100μl，協(xié)同刺激時每孔再加20μlPHA，每個濃度重復(fù)4孔，然后置于38℃、5%CO2條件下培養(yǎng)44h后取出，每孔加MTT20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，吸棄上清液，每孔加DMSO100μl，將細(xì)胞板置于微量震蕩器上震蕩5min 使沉淀完全溶解，檢測其在570nm處吸光度(A570值)。

1.7 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS軟件比較各組間的差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 臨床表現(xiàn) 各劑量組給藥后，未見任何不良反應(yīng)。整個試驗(yàn)期間，各組雞只精神活潑、采食、飲水和糞便正常，未出現(xiàn)發(fā)病和死亡，未見任何不良反應(yīng)。

2.2 生長性能變化 表1結(jié)果顯示，0.5、0.75g/羽劑量組的第2、4周體重均顯著高于(P＜0.05)疫苗對照和空白對照組。1g/羽劑量組在第4周體重顯著高于(P＜0.05)疫苗組和空白對照組。第6周時，第0.5g/羽組體重顯著高于(P＜0.05)疫苗對照組。而2、3組體重沒有差異；0.5g/羽、0.75g/羽劑量組的總的日增重顯著高于(P＜0.05)疫苗對照組和空白對照組。0.25、1.25和1.5g/羽總?cè)赵鲋仫@著低于(P＜0.05)疫苗對照組；0.5、0.75和1.0g/羽組料重比顯著低于疫苗對照組和空白對照組(P＜0.05)。所以，0.5、0.75g/羽劑量組均能顯著提高雞體重，降低料重比。但低劑量和最高劑量對生長沒有促進(jìn)作用，還有一定抑制作用。

表1 各組體重變化 (g)

2.3 血清抗體效價的變化

表2 各組血清ND-HI抗體效價的變化 (log2)

表2結(jié)果顯示，歸芪飲各劑量組在絕大多數(shù)時間點(diǎn)的抗體效價均高于免疫對照組。0.75g/羽組的抗體效價在所有時間點(diǎn)均顯著高于免疫對照組(P＜0.05)，0.5g/羽組在除第7天和第35天外均顯著高于免疫對照組(P＜0.05)。1.0g/羽、1.25g/羽和1.5g/羽組的抗體效價在所有時間點(diǎn)均明顯或顯著低于0.75g/羽組，但這三組間則差異不顯著(P＞0.05)。首免后第7天，0.75g/羽組的抗體效價最高，顯著高于免疫對照組和其他各方劑組(P＜0.05)，其次為1.5g/羽組；第14天，0.5g/羽組的抗體效價最高，顯著高于免疫對照組和其他各方劑組(P＜0.05)，其次為0.75g/羽組，顯著高于除1.5g/羽組外的其他各組(P＜0.05)；第21天和第28天，0.75g/羽組和0.5g/羽組抗體效價相當(dāng)，顯著高于免疫對照組和其他各劑量組(P＜0.05)；第35天和第42天，0.75g/羽組抗體效價最高，顯著高于免疫對照組(P＜0.05)。

2.4 攻毒保護(hù)率測定

表3 攻毒保護(hù)試驗(yàn)各組死亡數(shù)和死亡率 (羽、%)

由表3結(jié)果可以看出，中藥復(fù)方各劑量組的死亡率均低于疫苗攻毒對照組，保護(hù)率均高于疫苗攻毒對照組。0.75g/羽組的死亡率最低，保護(hù)率最高，其次為0.5g/羽組，1.0g/羽組，說明該中藥復(fù)方在高、中劑量時能提高機(jī)體對新城疫病毒的抵抗力。0.25g/羽組死亡率高，保護(hù)率低，說明劑量較低時保護(hù)效果較差。

2.5 體外試驗(yàn)結(jié)果

表4 體外最大安全濃度測定結(jié)果(A570值) (μg/ml)

表4結(jié)果顯示，歸芪飲在125～1000μg/ml時，A570值顯著低于細(xì)胞對照組(P＜0.05)，在1.95μg/ml時，A570值顯著 高 于 細(xì) 胞 對 照 組 (P＜0.05)， 在 0.98μg/ml， 3.91～62.5μg/ml時，A570值高于細(xì)胞對照組，但和細(xì)胞對照組差異不顯著(P＞0.05)。因此可以將62.5μg/ml作為歸芪飲的最大安全濃度。

表5 歸芪飲單獨(dú)和協(xié)同PHA促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖作用結(jié)果(A570值) (μg/ml)

根據(jù)最大安全濃度測定結(jié)果，進(jìn)行了歸芪飲對T淋巴細(xì)胞的體外刺激試驗(yàn)。由表5的結(jié)果可以看出，歸芪飲單獨(dú)作用時，在3.91～31.25μg/ml時，A570值顯著高于細(xì)胞對照組(P＜0.05)，說明在3.91～31.25μg/ml時歸芪飲可以顯著促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖。歸芪飲協(xié)同PHA共同作用時，在7.81～62.5μg/ml范圍內(nèi)，A570值高于細(xì)胞對照組，但和細(xì)胞對照組差異不顯著(P＞0.05)，說明在7.81～62.5μg/ml時歸芪飲可能協(xié)同PHA促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，但其作用不顯著。

3 討論

（1）結(jié)果表明，臨床給藥后，各劑量組未見任何不良反應(yīng)。試驗(yàn)期間各劑量組雞只精神活潑、采食、飲水和排便正常，未出現(xiàn)發(fā)病和死亡。中劑量組雞只不但未見任何不良反應(yīng)，而且雞的生長最好，體重增加明顯。表明歸芪飲臨床應(yīng)用安全，且在合適的劑量能顯著提高雞只的生長性能。許多試驗(yàn)研究也表明，中草藥在提高動物生長性能、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、防治動物疾病等方面具有良好的效果[1-3]。孫永梅等試驗(yàn)結(jié)果也表明，在日糧中添加黨參、黃芪、甘草等中草藥，可提高飼料效率，提高肉仔雞的生產(chǎn)性能[4]。（2）抗體效價測定結(jié)果顯示，歸芪飲各劑量組在絕大多數(shù)時間點(diǎn)的抗體效價均高于免疫對照組，1、1.5g/ml組的抗體效價最高；攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果也顯示出，歸芪飲在0.75g和1.0g時的保護(hù)率較高，表明歸芪飲在合適的劑量能顯著提高新城疫疫苗免疫雛雞的血清抗體效價，提高機(jī)體對新城疫病毒的抵抗力。邱妍等[5]研究發(fā)現(xiàn)，合適劑量的多糖能顯著增強(qiáng)雛雞的特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)，提高疫苗的免疫力，使抗體產(chǎn)生早、上升速度快、高峰持續(xù)時間長。這個結(jié)果與Wang等[6]報道的重要有效成分復(fù)方能夠增強(qiáng)免疫雛雞的體液免疫是一致的。本試驗(yàn)結(jié)果也與這些報道相一致。（3）體外T淋巴細(xì)胞增殖結(jié)果顯示，歸芪飲在3.91～62.5μg/ml時對細(xì)胞基本無毒害作用。在3.91～31.25μg/ml單獨(dú)作用時可以顯著促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，協(xié)同PHA共同作時，在7.81～62.5μg/ml范圍內(nèi)可能促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖。表明歸芪飲在體外有刺激淋巴細(xì)胞增殖的效果，可能提高機(jī)體的細(xì)胞免疫功能。目前已有不少研究報道了黃芪及其活性成分APS具有良好的免疫增強(qiáng)作用。APS等中藥成分在一定濃度既能單獨(dú)又能協(xié)同ConA或LPS刺激淋巴細(xì)胞增殖[7]。聶小華等[8]的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了APS對于ConA誘導(dǎo)的脾臟、胸腺T淋巴細(xì)胞增殖具有顯著的促進(jìn)作用。4 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果可以表明，歸芪飲能夠顯著增強(qiáng)體液免疫和細(xì)胞免疫，提高機(jī)體的免疫力和生長性能。歸芪飲臨床應(yīng)用安全，體內(nèi)增強(qiáng)體液免疫和體外增強(qiáng)細(xì)胞免疫的效果確實(shí)。體內(nèi)每羽0.5～1g(1～2g/ml劑量組)劑量作用效果都好，從作用效果和用藥成本考慮，推薦0.5g/羽可以作為臨床試驗(yàn)應(yīng)用的最佳劑量。

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S853.92

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1007-1733(2017)12-0004-03

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