解淀粉芽胞桿菌α-淀粉酶高活力突變體的創建與性質研究

牛丹丹，靳曉，吳海洋，劉曉光，林娟，葉秀云*

1(福州大學 生物科學與工程學院，福建省海洋酶工程重點實驗室，福建 福州，350116)2(天津科技大學 生物工程學院，天津，300457)

解淀粉芽胞桿菌α-淀粉酶高活力突變體的創建與性質研究

牛丹丹1，靳曉1，吳海洋2，劉曉光2，林娟1，葉秀云1*

1(福州大學 生物科學與工程學院，福建省海洋酶工程重點實驗室，福建 福州，350116)2(天津科技大學 生物工程學院，天津，300457)

為進一步提高解淀粉芽胞桿菌α-淀粉酶(Bacillusamyloliquefaciensα-amylase, BAA)發酵生產與應用性能，對BAA編碼基因實施了體外隨機突變，建立了含有2×104個轉化子的BAA突變庫。BAA編碼基因的突變頻率為56%，基因突變效率為2.8/kb DNA，錯義突變26.8%；以平板篩選法和搖瓶發酵法對BAA突變庫進行篩選，得到6個酶活力顯著提高的突變體，其中突變體BAA28的酶活力提高最多，提高達37%；進一步分析突變體BAA28序列，發現其4個氨基酸殘基發生突變，分別是：T341P、P348L、T356P和P362L，其中T341P和T356P位于無規卷曲結構中，P348L位于α-螺旋結構中，P362L位于β-折疊結構中。進一步制備與純化BAA28，并比較分析其酶學特征，與野生型BAA相比，BAA28的離子依賴性、熱穩定性發生了顯著變化；BAA28的比酶活提高了約31%，κcat/Km值提高了92%。突變體BAA28較BAA在催化與應用屬性上有了顯著提升，可應用于后續中溫α-淀粉酶高產新菌種的構建并可顯著改善其工業應用性能。

中溫α-淀粉酶；突變體；催化效率

解淀粉芽胞桿菌α-淀粉酶 (Bacillusamyloliquefaciensα-amylase, BAA)，又被稱為中溫α-淀粉酶(簡稱：中淀)，是中高溫段淀粉液化的主要酶種之一[1]，廣泛應用于洗滌、造紙、淀粉糖、焙烤工業、啤酒釀造、織物退漿、釀造、酒精工業、有機酸工業和醫藥行業等[2-4]，是我國工業酶制劑的重要組成成員。

BAA屬于糖苷水解酶的第13家族 (glycoside hydrolase family 13，GH13)。BAA的編碼基因，首先由PALVA 等于1982年通過鳥槍法在Bacillussubtilis中克隆成功[5-6]，對其結構-功能相關關系研究揭示，D194N或E185K突變，可降低BAA的熱穩定性[7]；LEE[8]等對 BAA編碼基因進行了隨機突變，發現位于氨基酸殘基233位置上的 Ca2+結合位點對于 BAA 的性質具有重要影響；劉洋等[9-10]對BAA中Ca2+結合位點上的氨基酸殘基231、233和438 分別進行定點突變，與天然 BAA 相比，3個突變體的比酶活均有下降，突變體 D233NKm上升了 55.6%，κcat值下降了 85%，另外2個突變體的Km和κcat值與天然BAA相比沒有明顯的變化。另一方面，我國科研工作者運用分子克隆與遺傳重組技術等[9, 11-12]，對BAA工業生產菌種進行了成功改良，BAA工業菌種的發酵生產水平從早期的300 U/mL大幅提升到1 200 U/mL以上，并且顯著改善了發酵工藝與產品穩定性，使我國成為世界上中溫α-淀粉酶的生產國與供應國。

與相關重要淀粉液化酶特別是高溫α-淀粉酶相比，有關BAA分子特性改良等研究相對滯后。通過分子進化等技術提高其催化效率，不僅有助于其工業應用，也有可能進一步提高其生產菌種的發酵生產水平。為此，本文就BAA催化效率的分子進化進行探索，為后續BAA生產菌種遺傳改良奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒

解淀粉芽胞桿菌(B.amyloliquefaciens)CICIM B2125為中溫α-淀粉酶生產菌株[9]，用于本研究的BAA編碼基因的供體，大腸桿菌(Escherichiacoli)JM109和地衣芽胞桿菌(Bacilluslicheniformis)D402[11,13](ΔamyΔhspΔaprE)用于本研究基因克隆與表達宿主。pND-113為前期經pHY-WZX[14]改造獲得，可介導外源基因在大腸桿菌和地衣芽胞桿菌等宿主細胞中分泌表達外源酶分子。pND-BAA為本研究構建重組分泌表達質粒，含有BAA編碼基因。除特別說明外，所有菌株在LB培養基(酵母膏0.5%，蛋白胨1%，NaCl 1%)中，于37 ℃下培養，必要時在培養基中添加0.5%可溶性淀粉或/和添加20 μg/mL卡那霉素。

1.1.2 工具酶和試劑

限制性內切酶、連接酶、蛋白質分子量標準購自美國Thermo Fisher Scientific公司；Pyrobest、TaqDNA聚合酶、dNTPs、三磷酸核苷、MgCl2及MnCl2購自上海生工生物工程有限公司。質粒小提試劑盒及PCR產物純化試劑盒購于美國OMEGA公司，其余化學常用試劑均為進口或國藥分析純。BAA純品為實驗室前期純化并保存。

1.2 方法

1.2.1 分子克隆常規操作

PCR擴增、質粒DNA和PCR產物的提取、純化、酶切、瓊脂糖凝膠電泳、連接、轉化等按照實驗室常規方法進行[15]。DNA序列測定采用Sanger氏的雙脫氧末端鏈終止法進行。

1.2.2 BAA編碼基因的PCR擴增

以B.amyloliquefaciensB2125基因組DNA為模板，以引物BAA-F(5′-TACGGATCCGTAAATGGCACGCTGATGCAGTAT-3′，下劃線處為外加克隆位點BamHI)和BAA-R (5′-TTATTTCTGAACATAAATGGAGACGG-3′)介導目的基因擴增。PCR擴增體系50 μL模板DNA 1 μL，10×PCR 緩沖液5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，BAA-F 1 μL，BAA-R 1 μL，Pyrobest DNA多聚酶0.2 μL，補ddH2O至50 μL；PCR反應條件為：95 ℃ 5 min；擴增30個循環(94 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s)；72 ℃，10 min。

1.2.3 易錯PCR反應

易錯PCR擴增體系(50 μL)為：10×PCR 緩沖液(不含Mg2+和Mn2+)5 μL，100 mmol/L dCTP 0.5 μL，100 mmol/L dTTP 0.5 μL，10 mmol/L dATP 1 μL，10 mmol/L dGTP 1 μL，Mg2+6.5 mmol/L, Mn2+0.5 mmol/L, BAA-F 1 μL，BAA-R 1 μL，BamHI線性化pND-BAA DNA 1 μL。PCR擴增在TaqDNA多聚酶介導下進行。擴增程序為：95 ℃ 5 min；擴增30個循環(94 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s)；72 ℃，10 min。

1.2.4 BAA突變體庫搭建與突變效率檢驗

將易錯PCR產物純化后，先用DpnI酶切去除模板DNA，再用BamHI酶切，然后與表達質粒pND113進行連接，連接物轉化入宿主E.coliJM109,將轉化子點種于96孔微孔板中，培養并保藏。隨機挑取100個轉化子，提取其質粒DNA，進行核苷酸序列測定，統計基因中堿基突變、突變方式及氨基酸突變等。

1.2.5 BAA突變體初篩與復篩

突變體初篩：在篩選平板(含有0.5%淀粉的LB平板)點種轉化子并以E.coliJM109 (pND-BAA)為對照，相同培養條件下培養16～24 h后，目測淀粉水解圈大小，挑取透明圈明顯增大者保藏及進一步實驗。

將初篩得到的透明圈增大的轉化子和對照JM109 (pND-BAA)，1株3瓶接種于LB液體培養基中，37 ℃，200 r/min，振蕩培養12 h后，以10%(v/v)的接種量轉接于發酵培養基(在LB培養基的基礎上添加2%乳糖)，37 ℃，200 r/min，振蕩培養36 h后，將各菌株培養液10 000 r/min 4 ℃離心15 min，收集上清液，并測定淀粉酶酶活力。其質粒DNA經分離純化后進行核苷酸序列測定與分析。

1.2.6 BAA突變體的制備與純化

地衣芽胞桿菌的遺傳轉化按文獻方法進行[14]。將上述獲得的BAA突變體表達質粒轉化入地衣芽胞桿菌D402，在含20 μg/mL卡那霉素的LB平板上于37 ℃培養2～3 d，篩選出轉化子。轉化子接種于LB液體培養基，37 ℃，200 r/min 培養12～14 h作為種子，以10%(v/v)的接種量接于搖瓶發酵培養基中(在LB培養基的基礎上添加2%乳糖)，在37 ℃，220 r/min 條件下發酵培養120 h，發酵結束后，離心收集上清液，即為BAA突變體粗酶液。酶液純化用AKTA pure system H8(29-2827-26型，GE Healthcare 公司)進行。蛋白質純度用SDS-PAGE進行分析[15]，蛋白質濃度按照Bradford的蛋白質微量測定方法進行。

1.2.7 酶活測定

用DNS法[10]。酶活力單位定義為：1 mL稀釋酶液在pH 6.0、60 ℃條件下，1 h水解1.0 %可溶性淀粉產生相當于1 mg葡萄糖還原力，定義為1個酶活力。

1.2.8 酶學性質與特征分析

1.2.8.1 最適反應溫度和溫度穩定性

在不同溫度下(30～90 ℃)測定的淀粉酶活力，以測得的最高酶活力為100%，計算其他溫度下的相對酶活力，確定最適反應溫度；在反應體系中添加或不添加5 mmol/L Ca2+，將其置于60 ℃或70 ℃水浴中，保溫60 min，每隔15 min取樣，冰浴30 min后，用1.2.7的方法在最適溫度下測定處理后酶液的殘余酶活力，以未進行熱處理的酶液酶活力為100%，計算相對酶活，以確定酶的熱穩定性。

1.2.8.2 最適反應pH和pH穩定性

在60 ℃條件下，分別測定不同pH緩沖溶液下的酶活力，以測得的最高酶活力值為100%，計算其他pH條件下的相對酶活力，確定最適反應pH。將酶液置于不同pH值的緩沖液于37 ℃保溫1 h，然后用1.2.7的方法測定酶液的殘余酶活力，以確定酶的pH穩定性。

1.2.8.3 不同金屬離子及化學試劑對酶活力的影響

在酶的最適反應pH和最適反應溫度條件下，研究金屬離子和化學試劑(Na+、Ca2+、K+、Co+、Li+、Mg2+、Fe3+、Mn2+、Zn2+、EDTA、SDS)對酶活性的影響，以相同條件下未加金屬離子和化學試劑的酶反應為對照。

1.2.8.4 酶的動力學參數測定

配制不同濃度的可溶性淀粉溶液為底物，在pH 6.0，溫度60 ℃條件下，反應10 min，采用DNS法測定酶活力，計算酶促反應速度，測定酶的動力學參數。

1.2.9 生物信息學分析

核苷酸序列與氨基酸序列分析采用DNAMAN 5.0軟件進行，BAA及其突變體的3D結構模擬采用SWISS-MODEL在線軟件進行分析(https://swissmodel.expasy.org/)。

2 結果與討論

2.1 BAA編碼基因的克隆、表達與突變體庫的搭建

以B.amyloliquefaciensB2125基因組DNA為模板，克隆出大小約1.4 kb、編碼BAA成熟肽的編碼基因amyQ[9-10]，將其克隆入表達質粒pND-113，獲得重組表達質粒pND-BAA，此質粒能夠在E.coliJM109中分泌表達BAA，在淀粉平板上可形成典型的淀粉水解透明圈。

以BamHI線性化的pND-BAA為模板，進行易錯PCR擴增，擴增產物經純化與酶切后克隆入表達質粒pND-113并轉化入E.coliJM109，點種轉化子于含200 μL培養基的96孔微孔培養板中，繼續培養13～15 h，分裝與保藏，由此搭建出庫容為2×104個轉化子的BAA突變庫。隨機挑取其中100個轉化子進行分析，有99個轉化子含有重組質粒，其中有56個轉化子的BAA編碼基因發生了突變，包括26.8%發生單點突，14.3%發生雙位點突變，57.1%發生多位點突變，1.8%發生無義突變，1 kb基因平均有2.8個堿基發生突變，同義突變率占73.2%，非同義突變率占26.8%，基本滿足篩選需要。

2.2 BAA酶活提高突變體的篩選

在含有可溶性淀粉的篩選平板上，通過目測透明圈大小對BAA突變體進行初篩，共篩選得到68株透明圈大于對照的轉化子，占比0.68%。進一步通過搖瓶發酵進行復篩，最終篩選得到6株酶活力高于對照的突變體，以其中的突變體BAA28酶活力提高最高，是BAA的1.37倍(表1)，以此作為后續進一步研究對象。

表1 BAA突變體復篩Table 1 The secondary screening results of BAA mutants

2.3 BAA28突變體序列分析

對BAA28突變體的編碼基因進行序列測定與分析，其分子共發生了有7個堿基突變(G513A、T627C、A1021C、CG1044TT、A1066C、C1085T)并引起4個氨基酸殘基 (T341P、P348L、T356P、P362L) 發生變化。從一級結構看，BAA28的4個氨基酸突變位點均位于(β/α)8桶狀結構處，即α-淀粉酶家族中的催化區域，由203-392 aa折疊形成[16]；從二級結構看，BAA28的突變位點T341P和T356P位于無規卷曲結構中，P348L位于α-螺旋結構中，而P362L位于β-折疊的結構中[16]；從三級結構看，各突變酶的三維結構和BAA相比，沒有發現明顯的差異[16]。

2.4 BAA28酶學特征

將重組質粒pND-BAA28轉化入B.licheniformisD402，獲得重組菌D402(pND-BAA28)，通過搖瓶發酵制備酶液，經純化，在SDS-PAGE上呈現單一條帶，大小約58 kDa(圖1)。可以用于后續酶學特征分析。采用B.amyloliquefacientsM2125發酵制備BAA酶液并純化(圖1)，用于后續研究對照。

M-相對分子質量標準；1-BAA28粗酶液；2-純化后的BAA28；3-BAA發酵液；4-純化后的BAA圖1 BAA28純化后的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE profile of the purified BAA28

2.4.1 最適作用溫度和最適作用pH

將BAA28置于不同溫度或不同pH條件下測定其酶活力，BAA28的最適反應溫度為60 ℃，最適作用pH為6.0；在50～70 ℃或pH5～8下皆具有較高活力。此特性與BAA基本保持一致(圖2)。

圖2 BAA28的最適作用溫度(A)與最適作用pH(B)Fig.2 Temperature (A) and pH (B)optima of BAA28

2.4.2 熱穩定性與pH穩定性

在反應體系中添加或不添加5 mmol/L Ca2+，并在不同溫度(60 ℃，70 ℃)或不同pH下保溫，然后按照標準酶法測定條件進行殘余酶活的測定，結果匯總于圖3。可見，BAA28的熱穩定性明顯優于BAA。BAA28的pH穩定性則與BAA基本一致，即沒有發生顯著改變(數據未呈現)。

1-BAA，60 ℃，5 mmol/L Ca2+;2-BAA28,60 ℃, 5 mmol/L Ca2+; 3-BAA 28,60 ℃;4-BAA28,70 ℃,5 mmol/L Ca2+;5-BAA,60 ℃; 6-BAA,70 ℃,5 mmol/L Ca2+;7-BAA28,70 ℃;8-BAA,70 ℃圖3 BAA28的熱穩定性Fig.3 Effects of temperature on activities of BAA28

2.4.3 金屬離子及化學試劑對酶活性的影響

不同金屬離子及化學試劑對酶活性的影響見表2。BAA28酶活幾乎不依賴Li+、Ca2+、Na+或Co2+，但此4種金屬離子對BAA酶活有顯著促進作用。可見BAA28中發生的組合突變，引起了對金屬離子依賴性的巨大變化。而這一變化明顯有利于此突變體的后續工業應用，因為長期以來BAA的Ca2+依賴性，是其工業應用屬性中不利的一面[10]。

表2 不同離子和化學試劑對BAA28酶活力的影響Table 2 Effects of different metal ions and chemicals on BAA28

2.4.4 BAA28動力學特征

對BAA28進行比酶活測定與酶促反應動力學特征進行分析，結果匯總于表3。與BAA相比，BAA28的比酶活提高約31%，Vmax和κcat分別提高了2.5倍和1.97倍，κcat/Km值提高92%，即突變酶BAA28的催化效率提高了92%。

3 結論

綜上所述，本研究通過分子進化與篩選，獲得了催化屬性顯著改進的BAA突變體，進一步對突變體BAA28進行了較深入的研究與分析，與BAA相比，其比酶活、催化效率等皆有大幅度提升，對金屬離子的依賴性也發生了顯著變化。這些改進有助于后續高產菌種的構建及其工業應用。

表3 BAA28的酶促動力學特征Table 3 Kinetic parameters of BAA28

[1] SIVARAMAKRISHNAN S,GANGADHARAN D,NAMPOOTHIRI′K M, et al. α-Amylases from microbial sources[J]. Food Tech Biotechnol, 2006, 44(2): 173-184.

[2] 姜錫瑞. 酶制劑應用手冊[M]. 北京: 中國輕工出版社, 1999:33-66.

[3] van derMAAREL MJ, van der VEEN B, UITDEHAAG JC, et al. Properties and applications of starch-converting enzymes of the alpha-amylase family[J]. J Biotechnol, 2002, 94(2):137-155.

[4] TOMASIK P, HORTON D. Enzymatic conversions of starch[J]. Adv Carbohydr Chem Biochem, 2012, 68:59-436.

[5] PALVA I, PETTERSSON R F, KALKKINEN N, et al. Nucleotide sequence of the promoter and NH2-terminal signal peptide region of the ALPHA-amylase gene fromBacillusamyloliquefaciens[J]. Gene, 1981, 15(1): 43-51.

[6] PALVA I. Molecular cloning of alpha-amylase gene fromBacillusamyloliquefaciensand its expression inB.subtilis[J]. Gene, 1982, 19(1): 81-87

[7] SMIRNOVA NA, SOROKIN AV, IOMANTAS Iu V, et al. Mutations in the alpha-amylase gene ofBacillusamyloliquefaciens, leading to a decrease in the temperature of protein inactivation[J]. Mol Biol (Mosk), 1988, 22(5): 1 257-1 264.

[8] LEE S, MOURI Y, MINODA M, et al. Comparison of the wild-type alpha-amylase and its variant enzymes inBacillusamyloliquefaciensin activity and thermal stability, and insights into engineering the thermal stability ofBacillusalpha-amylase[J]. J Biochem, 2006, 139(6): 1 007-1 015.

[9] 劉洋. 中溫α-淀粉酶編碼基因劑量對其生產水平提高的重要作用[D]. 無錫: 江南大學, 2009.

[10] LIU Yang, SHEN Wei, SHI Gui-yang, et al. Role of the calcium-binding residues Asp231, Asp233, and Asp438 in alpha-amylase ofBacillusamyloliquefaciensas revealed by mutational analysis[J]. Curr Microbiol, 2010, 60(3):162-166.

[11] 范如意. 基因工程技術改造地衣芽孢桿菌實現中溫α-淀粉酶高效表達[D]. 無錫: 江南大學, 2014.

[12] 范如意, 牛丹丹, 應喜娟, 等. 中溫α-淀粉酶在地衣芽孢桿菌中的異源表達[J]. 工業微生物, 2015, 45(2): 47-54.

[13] NIU Dan-dan, ZUO Zhi-rui, SHI Gui-yang, et al. High yield recombinant thermostable α-amylase production using an improvedBacilluslicheniformissystem[J]. Microbial Cell Factories, 2009, 8:58e1-7

[14] NIU Dan-dan, WANG Zheng-xiang. Development of a pair of bifunctional expression vectors forEscherichiacoliandBacilluslicheniformis[J]. J Ind Microbiol Biotechnol, 2007, 34(5): 357-362.

[15] 諸葛健, 王正祥. 工業微生物實驗技術手冊[M]. 北京：中國輕工業出版社, 1994.

[16] FITTER J, HABER-POHLMEIER S. Structural stability and unfolding properties of thermostable bacterial alpha-amylases: a comparative study of homologous enzymes[J]. Biochem, 2004, 43(30):9 589-9 599.

ConstructionandpropertiesofBacillusamyloliquefaciensα-amylasemutantofimprovedcatalyticefficiency

NIU Dan-dan1， JIN Xiao1, WU Hai-yang2，LIU Xiao-guang2, LIN Juan1, YE Xiu-yun1*

1(College of Biological Science and Engineering, The Key Laboratory of Marine Enzyme Engineering of Fujian Province, Fuzhou University, Fuzhou 350116,China)2(College of Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tiqnjin 300457,China)

Bacillusamyloliquefaciensα-amylase (BAA) is one of the most widely used industrial enzymes in the starch processing, food, brewing, fermentation, textile, papermaking, and medical industries. To further enhance fermentation level and application property, the mutant with significantly improved catalytic properties was constructed viainvitromolecular evolution and its nature was preliminarily illustrated. The BAA mutation library, with the mutational frequency of 56%, the efficiency of mutation of 2.8 points/kb DNA, and the missense mutation rate of 26.8%, was constructed with the capacity of 2×104transformants by using error-prone PCR. The BAA mutants with enzymatic activity were screened using halo-plate assay and shaking flask fermentation test. Six mutants with improved activity were selected out and one of which, mutant BAA28, displayed 37% increased activity. Sequencing results illustrated that mutant BAA28 had four separated mutations: T341P, P348L, T356P, and P362L and of which, T341P and T356P were in the random coil structure, P348L was in the-helix structure, and P362L was in the-fold structure. The BAA28 was further heterologously prepared and purified and its biochemical properties were examined in comparison to wild BAA. BAA28 displayed a remarkable change in ion-dependence and thermostability. Its specific activity was significantly increased with 1.31 folds of BAA andκcat/Kmwas increased by 92%. BAA28 mutant performed significantly improved catalysis and application properties in comparison to BAA, which is of potential application in BAA-overproducing strain improvement and industrial properties.

Bacterial α-amylase; mutant; catalysis efficiency

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014866

工學博士(葉秀云教授為通訊作者,E-mail：xiuyunye@fzu.edu.cn)。

國家高技術研究發展計劃(863計劃)(2013AA102101)；福建省教育廳產學研項目(JA15049)；國家自然科學基金(31601407)；福建省自然科學基金(2016J01157)

2017-06-01,改回日期：2017-06-21