雨生紅球藻細胞形態轉換和藻落形成差異研究

程天佑, 徐曉瑩, 張文蕾, 張 維, 陳 林, 袁冠華, 劉天中

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雨生紅球藻細胞形態轉換和藻落形成差異研究

程天佑1, 2, 徐曉瑩1, 2, 張文蕾1, 張 維1, 陳 林1, 袁冠華1, 2, 劉天中1

(1. 中國科學院 青島生物能源與過程研究所, 中國科學院 生物燃料重點實驗室, 山東 青島 266101; 2. 中國科學院大學, 北京 100049)

基于雨生紅球藻()培養過程中游動細胞和不動細胞的形態差異與轉換, 對比研究了兩種細胞類型在離心收集與藻落形成效率上的差異。結果表明, 雨生紅球藻SCCAP K-0084在BYA培養基中培養 4~6 d和9~12 d分別以綠色游動細胞與綠色不動細胞為主; 早期游動細胞離心收集需要更高的離心力, 但500~1 000離心5 min可以在不影響細胞存活率的情況下有效收獲所有類型細胞; 相比于傳統直接涂布法, 雙層瓊脂平板法可有效提高平板藻落形成效率, 且游動細胞藻落形成效率比不動細胞藻落形成效率更高。TAP培養基由于藻落形成效率較低并不適合于雨生紅球藻平板培養與篩選, 自養型培養基雖然具有較好的藻落形成效率但是藻落形成速度較慢, 相比而言, BYA培養基藻落形成效率較高且生長速度快, 更適合用于雨生紅球藻細胞的后期平板培養與篩選過程。

雨生紅球藻(); 游動細胞; 不動細胞; 形態轉換; 藻落形成差異

蝦青素具有極強的抗氧化活性和良好的著色能力[1], 在醫藥、保健、食品以及養殖業等方面均具有巨大應用價值[2]。雨生紅球藻的蝦青素含量可高達其干質量的4%, 是目前已知的蝦青素含量最高的生物物種[3]。近年來, 隨著雨生紅球藻的技術產業化應用, 基于細胞與基因工程篩選[4-5]、選育與開發性狀優良的雨生紅球藻藻種越來越受到研究者們的關注。

許多國內外學者層通過電轉化[6]、基因槍[7]、土壤農桿菌介導整合[8]等方法嘗試建立穩定的雨生紅球藻轉化與外源基因表達技術, 但以色列Sammy Boussiba的研究[9]顯示, 迄今為止僅有基因槍法實現了雨生紅球藻穩定的遺傳轉化。相反, 普遍用作分子生物學研究模式物種的萊茵衣藻能夠通過多種途徑與手段實現外源基因的穩定轉化與表達[10]。因此, 開發更豐富的雨生紅球藻轉化手段, 并建立更穩定的轉化體系, 一直是學界關注的問題。

雨生紅球藻在培養過程中存在游動細胞與不動細胞兩種細胞類型, 這兩種細胞在形態結構以及生理上存在明顯差異[11]。當對雨生紅球藻細胞進行分子生物學操作時, 這兩種細胞類型在遺傳轉化效率上必定存在明顯差異。因此要實現雨生紅球藻細胞高效穩定的遺傳操作, 比較理想的條件是首先要獲得單一類型(或至少占絕大多數比例)的細胞。要實現這一點, 必須要了解雨生紅球藻培養過程中的細胞形態轉換及其影響因素。

本研究以雨生紅球藻SCCAP-K0084為材料, 在含有低濃度醋酸鈉和酵母提取物的BYA培養基中培養, 通過觀測培養過程中細胞生長與形態轉換, 確定培養過程中兩種細胞類型的組成變化特點, 并考察了兩種細胞的離心收集和藻落形成差異。研究結果證明雨生紅球藻游動細胞和不動細胞的藻落形成效率存在明顯差異, 而且不同的培養基組成對于細胞的藻落形成效率也存在重要影響。這一研究的報道, 對于根據不同細胞類型建立更高效與穩定的雨生紅球藻分子生物學操作技術具有重要支持作用。

1 材料與方法

1.1 實驗藻種

雨生紅球藻(K-0084), 購于丹麥哥本哈根大學藻種保藏庫(SCCAP), 本實驗室保存。

1.2 培養基和培養條件

培養基包括: BG11培養基[12], 八倍磷酸二氫鉀8P-BG11培養基, BG11基礎上添加2 g/L的乙酸鈉和2 g/L的酵母提取物的BYA培養基, BBM培養基[13], 三倍硝酸鈉的3N-BBM培養基, TAP培養基[14]; 固體培養基(包括8P-BG11, 3N-BBM, BYA和TAP)則在相應的液體培養基中加入1.5%瓊脂。

在250 mL錐形瓶中加入150 mL BYA培養基, 接入在BG11培養基中培養了10~15 d的雨生紅球藻種子液, 接種密度控制在4×103~6×103個/mL。實驗設兩組平行, 控制培養溫度為(25±1)℃, 持續光照為(25±1)μmol/(m2×s), 每天隨機調換三角瓶位置并定時搖勻3次, 使得各組光照盡可能一致。每隔24 h定點取樣2 mL, 用于細胞計數以及其他參數測定。平板則置于溫度為(25±1)℃, 持續光照為15~20mmol/(m2×s)的環境下培養。

1.3 液體培養基細胞密度計數和形態轉換觀察

液體細胞密度計數: 培養期間每天定時觀察取樣, 取樣前充分搖勻藻液, 游動細胞以0.25%戊二醛固定后用血球計數板在顯微鏡(Olympus BX51)下觀察計數, 每個樣本至少重復統計3次, 每個平行至少統計200 細胞。同時, 在顯微鏡下觀察細胞是否有鞭毛結構、膠質鞘以及細胞大小形狀等以確定不動細胞比例(不動細胞比例=不動細胞/總細胞數×100%), 同時用0.019%的Triton-X100對細胞進行處理以確定游動細胞比例[15-16](游動細胞計算公式為= 0.943+0.846, 其中為Triton敏感細胞比例,為游動細胞比例), 兩個結果共同確定培養中游動細胞以及不動細胞比例。

1.4 細胞活力染色

細胞活力測定以酚番紅花紅為標準[17], 酚番紅花紅染色劑被配制成1 mg/mL保存于4℃冰箱中, 并在0.01% 濃度時檢測細胞活力, 此濃度下只有死細胞才可被染色, 每次統計不低于200 細胞, 每個樣本至少重復統計3次。綠色活細胞數記為, 紅色死亡細胞數記為, 死細胞比例=/(+)×100%, 活細胞比例=/(+)×100%。

1.5 離心收集檢查

在50 mL離心管中加入35 mL藻液后進行不同離心力和離心時間的收集(臺式高速冷凍離心機, Beckman Coulter), 之后觀察上清液是否澄清, 同時取1 mL進行鏡檢, 以確定上清殘留細胞數, 收集率不小于90% 即認為能夠有效離心收集, 記下其最低離心力和時間。2 mL EP管中加入1.8 mL的藻液后操作與50 mL離心管相同(H 1650-W臺式離心機, 湘儀離心機儀器有限公司)。每一次離心之后重新搖勻藻液, 并取出1 mL進行細胞活力染色測定, 以確定離心對藻細胞的影響。收集率=(初始細胞密度–殘留細胞密度)/初始細胞密度×100%。

1.6 不同細胞涂布方式藻落形成效率

直接涂平板: 液體細胞計數后將細胞密度稀釋至 2×103個/mL, 取100 μL液體涂平板(TAP培養基), 每個樣品至少3個重復, 20 d后進行平板藻落計數, 平板藻落形成效率=/200×100%。

雙層瓊脂法: 以常規方式倒底層培養基平板, 將加入1% 濃度的低熔點瓊脂糖(low melting-point agarose, Solarbio)的培養基溶液滅菌后用42℃維持, 取1 mL該低熔點瓊脂糖培養基于2 mL的EP管中, 加入100 μL細胞液, 混勻后置于平板表面并小心搖晃平板使其均勻分布于平板上。

玉米淀粉法(玉米淀粉, 國藥): 將玉米淀粉用無菌水與無水乙醇依次各洗滌 2 次, 懸于滅菌水配制的75% (/)乙醇中, 并使得玉米淀粉終濃度為 20% (/)。使用的時候先用加入了0.4% PEG8000 (/)的滅菌液體培養基反復洗滌3次, 重懸后每1 mL懸液中加入 50 μL細胞液, 將這1 mL混懸液涂平板。

1.7 數據處理

用excel軟件對平行樣品進行方差分析, 用Sigmaplot作圖, 用SPSS軟件進行結果間的多重分析,<0.05差異顯著。

2 結果

2.1 雨生紅球藻培養中生長曲線和細胞形態轉換

圖1顯示了雨生紅球藻SCCAP K-0084在BYA培養基中培養12 d的生長以及細胞形態轉換。培養2 d后細胞開始進入對數生長期, 第3天細胞密度從初始接種的6×103個/mL增長到 105個/mL以上, 到第6天對數生長期中止, 細胞密度達到6×105個/mL以上, 在整個對數生長期中, 雨生紅球藻主要是以游動細胞的形式進行繁殖, 游動細胞比例基本維持在 80% 以上。從第7天培養開始, 細胞維持了2~3 d的緩慢生長, 細胞密度最高達到8×105個/mL左右, 并且細胞開始逐步的向不動細胞轉換, 培養11~12 d后, 培養液中大約 80% 左右的細胞已完全進入綠色的不動細胞期。

圖1 雨生紅球藻在培養中細胞形態轉換和細胞密度曲線

圖2中分別顯示了雨生紅球藻SCCAP K-0084的綠色游動細胞和綠色不動細胞階段的形態。相對于游動細胞, 不動細胞失去了鞭毛, 且部分細胞還失去了細胞外膠質鞘的包裹, 不同培養時期細胞類型存在明顯差異, 對數期細胞(3~6 d)主要以游動細胞形式存在, 而穩定期的細胞(9~12d)則更多是以不動細胞形態存在。

2.2 雨生紅球藻細胞的離心收集

雨生紅球藻培養中細胞密度一般僅能達到 105~ 106個/mL, 然而對于遺傳轉化等分子生物學操作, 通常需要將細胞濃縮到 107~108個/mL的細胞密度, 因此離心收集是必不可少的環節。

BYA中培養4、8和12 d后的細胞分別在不同離心條件下進行離心, 結果如表1所示。培養4 d后的對數期細胞, 以游動細胞為主, 在50 mL和2 mL離心管中離心5 min需要的最低離心力分別為500和400; 培養8 d的細胞中游動細胞占60%, 其在50 mL和2 mL離心管中離心需要的最低離心力分別為400和300; 而培養12 d后不動細胞占80%以上, 其在50 mL和2 mL離心管中所需的離心力分別降低到了200和100。這一結果表明, 不動細胞相比于游動細胞, 離心收集需要的離心力更低, 研究還發現即使在最低離心力下提高離心時間也不能明顯改善收集效果。實驗中還考察了提高離心力和增加離心時間對細胞存活率的影響, 結果如圖3 所示。游動細胞與不動細胞在離心力不大于1000時, 藻細胞存活率為85%~ 92%, 同未離心的對照樣品沒有明顯差異(>0.05)。因此, 500~1000離心5~10 min完全能夠適用于雨生紅球藻不同類型細胞的高效收集。

圖2 雨生紅球藻綠色游動細胞與綠色不動細胞的形態

表1 游動細胞與不動細胞離心最低離心力

圖3 不同離心條件對游動細胞與不動細胞存活率的影響

A. 300×10 min, B. 500×5 min, C. 500×10 min, D. 700×5 min, E. 1000×5 min

2.3 植板方式對藻落形成效率的影響

平板的篩選是細胞轉化過程不可缺少的步驟, 因此平板藻落形成的效率對于高效與成功的轉化過程非常重要。傳統涂布器的涂布方式有可能對藻細胞產生物理損傷, 從而降低藻落形成效率。本研究對比了涂布器直接涂布、玉米淀粉法以及雙層瓊脂法3種植板方式下的藻落形成效率。

如表2所示, BYA培養4 d后的雨生紅球藻游動細胞通過直接涂布方式在TAP平板上藻落形成效率很低, 僅為10.83%。通過玉米淀粉輔助的方法藻落形成效率可提高到13.83%, 效果仍不顯著(>0.05)。頂生瓊脂法則能夠顯著性的將藻落形成效率提高到21.67%(<0.05)。因此, 頂生瓊脂法是較適合于雨生紅球藻細胞藻落形成與篩選的植板方式。

表2 不同植板方式對藻落形成效率的影響

2.4 雨生紅球藻在不同培養基上藻落形成效率的差異

為了進一步提高雨生紅球藻的藻落形成效率, 對比考察了BYA液體培養基中培養4、8與12 d的細胞, 在8P-BG11、TAP、BYA和3N-BBM四種培養基中的藻落形成效率。

如圖4, 在傳統TAP平板上雨生紅球藻藻落形成效率較低, 4 d、8 d和12 d細胞的藻落形成效率僅有18%、11.33% 和6%。而4 d培養獲得的游動細胞在BYA、8P-BG11和3N-BBM平板上藻落形成效率可分別能達到52.83%、53.17%和42.67%, 顯著性高于TAP平板的藻落形成效率(<0.05)。這種顯著性的差異同樣在培養8 d與12 d細胞的藻落形成中出現。結果還顯示培養4 d后獲得的細胞比培養8 d與12 d后獲得的細胞具有更高的藻落形成效率。考慮到培養4d后獲得的細胞主要是游動細胞(>80%), 這說明游動細胞比不動細胞有更高的藻落形成效率。另外, 四種平板培養基中, 在TAP和BYA培養基中細胞生長速率更快, 一般經過2周時間就能夠出現明顯的藻落, 如圖5所示。經過25 d平板培養后, BYA和TAP上的克隆已經非常明顯。在8P-BG11和3N-BBM平板培養基中才剛剛形成較為明顯的克隆。因此, 對于雨生紅球藻的平板培養與篩選, 游動細胞藻落形成效率較高, TAP培養基因藻落形成效率低并不適合培養與篩選, 8P-BG11和3N-BBM雖然藻落形成效率較高但生長緩慢, 只有BYA培養基能夠更快更有效的用于雨生紅球藻的平板篩選。

圖4 8P-BG11、TAP、BYA和3N-BBM四種培養基對BYA培養4、8和12 d細胞藻落形成效率的影響

Fig. 4 Effects of different phycocolony forming rates of cells cultivated at 4, 8, and 12 days in the mixotrophic medium BYA on four types of solid plates (8P-BG11, TAP, BYA, and 3N-BBM)

圖5 BYA培養4、8和12 d的細胞在8P-BG11、TAP、BYA和3N-BBM四種固體培養基平板上生長25 d的藻落大小對比

3 討論

雨生紅球藻不僅可以進行光合自養生長, 而且可以基于乙酸(鹽)為底物進行異養或兼養生長[18]。以往的研究證明乙酸鈉的添加, 提高了雨生紅球藻的生長速率, 且在乙酸鈉濃度為1.5 g/L時細胞密度最高可達6×105個/mL[19]。本研究中采用的BYA培養基, 僅通過6 d的培養細胞密度就可達到6×105個/mL以上。而且研究發現在不同培養時期培養液中細胞類型存在巨大差異, 這可能與雨生紅球藻復雜生活史有關[11, 20]。本研究中雨生紅球藻BYA培養第3~6 d對數生長期時, 主要是以綠色游動細胞為主, 第7 d后, 綠色游動細胞逐漸向不動細胞階段轉變, 在培養9~12 d時, 以綠色不動細胞為主, 這可能是由于后期營養鹽濃度降低所導致。BYA中第7~9 d的后期培養中, 細胞生長緩慢, 這一過程中仍然保持較為緩慢的細胞個數增殖, 龍元薷等[18]認為雨生紅球藻不動細胞雖然呈現不游動的靜止狀態, 但仍然能以較低的概率進行無性的細胞增殖, 不動細胞可以通過形成孢子囊或出芽等方式釋放游動或不動的子細胞。

離心是藻類分子生物學操作必不可少的環節, 藤長英等[21]在進行雨生紅球藻基因槍轉化實驗中以 4 000離心 8 min收集藻細胞; Gutierrez等[22]以 2700離心 10 min收集細胞用于葉綠體基因槍轉化; 盧水秀等[6]在雨生紅球藻電轉化研究中則以 1000離心 5 min收集藻細胞; Kathiresan等[8]在土壤農桿菌介導的雨生紅球藻轉化實驗中以110離心 5 min收集細胞。這些離心條件的選擇性差異可能源于實驗中雨生紅球藻細胞類型的不一致。本研究中發現, 雨生紅球藻不動細胞在100~200離心力下即可實現高效率的收集, 而游動細胞則至少需要400~500的離心力條件。研究結果還發現, 500~ 1000離心5 min足以滿足不同時期與不同類型雨生紅球藻細胞的收集, 其對細胞活力沒有明顯影響, 能夠滿足后期分子生物學研究的需要。

固體平板的藻落形成與培養是細胞轉化和篩選的最后一步。藻落形成效率的高低會直接影響轉化和篩選成功與否。文獻報道萊茵衣藻中淀粉粒包裹的方法被證明能夠有效的提高細胞藻落形成與篩選效率[23], 雙層瓊脂平板也被證明能夠有效的提高細胞的菌落形成效率[24-25]。本研究發現, 雙層瓊脂法能夠有效的提高雨生紅球藻的藻落形成效率, 但淀粉粒包裹法的效果并不明顯。以往的雨生紅球藻轉化研究中大部分并未報道所采用的細胞來源中的主要細胞類型, 僅有盧水秀等[6]和Kathiresan等[8]的報道中分別提到采用不動期的細胞用于電轉化和農桿菌介導轉化研究, 而且都沒有對細胞在平板上的藻落形成效率對轉化過程的影響進行過相關分析。本研究發現不同時期細胞在雙層瓊脂平板上的藻落形成效率有顯著差異。培養4 d獲得的細胞大部分維持在游動細胞階段, 比培養8 d和12 d后大部分處于不動細胞階段的細胞有更高的藻落形成效率。

TAP培養基是一種較常用于萊茵衣藻培養與轉化的培養基, 盧水秀等[6]和Sharon-Gojman等[9]分別在雨生紅球藻的電轉化和基因槍轉化中均采用TAP平板篩選克隆子; Kathiresan等[8]在農桿菌介導的轉化中采用TAP進行細胞的菌藻共生培養。然而本研究的結果發現, 無論雨生紅球藻的游動細胞或不動細胞, 它們在TAP平板的藻落形成效率都明顯較低, 其細胞藻落形成效率最高僅為21.67%, 而在8P-BG11,3N-BBM和BYA三種培養基中藻落形成效率最高均超過50%。表3中對比了四種培養基的主要成分與組成, TAP中的氮磷含量略低, 分別為7.5 mmol/L和1.13 mmol/L。Borowitzka等[26]的研究認為, 雨生紅球藻適宜的氮磷濃度分別為4.95~9.89 mmol/L和0.57 mmol/L, TAP中的氮磷含量完全可以滿足雨生紅球藻生長的需要。但所不同的是TAP中的氮源完全是以銨根離子形式提供, Borowitzka等[26]認為雨生紅球藻最適宜的氮源形式為硝酸鹽, 因此, 氮源的形式有可能是導致TAP平板藻落形成效率低的主要原因。同時, 研究發現兩種兼養型培養基TAP和BYA中, 由于乙酸鹽的存在大大促進了藻細胞的生長速度, 其藻落往往僅需培養1~2周即可出現, 而純自養型培養基8P-BG11和3N-BBM需要經過約4周的培養才能獲得較明顯的藻落。而且BYA培養基中, 酵母提取物作為一種豐富有機營養源, 滿足了異養生長所需的其他類型營養, 在快速獲得藻落的同時大大提高了平板藻落形成效率, 因此更適合應用于雨生紅球藻的轉化克隆篩選。

表3 四種培養基(8P-BG11, TAP, BYA and 3N-BBM)中主要營養元素含量對比

4 結論

綜上所述, 本研究結果表明: (1)雨生紅球藻在不同的培養時期具有不同的細胞類型; (2)雨生紅球藻游動細胞比不動細胞離心收集時需要更高的離心力, 但500~1000離心5 min完全可以適用于兩種類型細胞的收集; (3)相比于傳統的直接涂布法, 雙層瓊脂平板法能有效地提高雨生紅球藻細胞平板藻落形成效率; (4)雨生紅球藻游動細胞藻落形成效率顯著高于不動細胞, BYA培養基可能更適合用于雨生紅球藻的平板藻落形成以及轉化后的篩選。

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(本文編輯: 梁德海)

Effect of morphological shift on phycocolony forming in

CHENG Tian-you1, 2, XU Xiao-ying1, 2, ZHANG Wen-lei1, ZHANG Wei1, CHEN Lin1, YUAN Guan-hua1, 2, LIU Tian-zhong1

(1. Key Laboratory of Biofuels, Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266101, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

Difference in cell collection and phycocolony forming between motile and non-motile cells ofwas studied considering the morphological shift under mixotrophic conditions. The results showed that motile and non-motile cells could be enriched separately after 4~6 days and 9~12 days, respectively, through mixotrophic cultivation in BYA. Although a greater centrifugal force was required for motile cell collection, motile and non-motile cells could both be collected by centrifugation at 500~1000for 5 min without obvious negative effects on the cell viability. Furthermore, the plate data indicated that the phycocolony forming rate ofcould be significantly improved using double layer of the apical low melting point agarose in comparison with that using traditional direct coating, and the phycocolony forming rate of motile cells was significantly higher than that of non-motile cells. Besides, the phycocolony forming rate in TAP was lower than that in the other three mediums, indicating that TAP was not suitable for the screening of, and the growth rate of colonies in BG11 and BBM was significantly lower than that in TAP and BYA. Above results indicated that BYA is more suitable for phycocolony formation and the screening ofconsidering the high phycocolony forming rate and rapid growth.

; motile cell; non-motile cell; morphological shift; phycocolony forming

[2016 Sino-Thai Cooperation Project from the National Science Foundation of China (Grant No. 51561145015)]

Dec. 5, 2016

Q945.1

A

1000-3096(2017)08-0001-08

10.11759/hykx 20161109002

2016-12-05;

2017-03-22

國家自然科學基金中泰合作研究基金資助項目(51561145015)

程天佑(1991-), 男, 湖北咸寧人, 碩士研究生, 研究方向為微藻生物技術, 電話: 0532-80662737, E-mail: chengty@qibebt.ac.cn; 張維,通信作者, 男, 湖北襄陽人, 副研究員, 博士, 主要從事經濟微藻的應用基礎與藻類分子遺傳學, 電話: 0532-80662737, E-mail: zhangwei@qibebt.ac.cn