Hg對錦州灣表層沉積物異養細菌代謝酶活性的影響研究

徐慶彤, 劉瑞志, 郭小雅, 李 捷, 雷 坤, 劉慶慶, 郝晨林

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Hg對錦州灣表層沉積物異養細菌代謝酶活性的影響研究

徐慶彤1, 2, 劉瑞志2, 郭小雅3, 李 捷1, 雷 坤2, 劉慶慶2, 郝晨林2

(1. 青島理工大學 環境與市政工程學院, 山東 青島 266033; 2. 中國環境科學研究院 環境基準與風險評估國家重點實驗室, 北京 100012; 3. 山東省膠東調水局, 山東 青島 266033)

為了解重金屬Hg對錦州灣海域表層沉積物中異養細菌的主要代謝酶的影響, 采用Hakanson潛在生態危害指數法對錦州灣表層沉積物中重金屬Hg開展潛在生態風險評價, 利用平板擴散法測定了9個站位沉積物中異養細菌四種水解酶活性。結果顯示: 錦州灣海域表層沉積物中重金屬污染嚴重, Hg的含量和潛在生態危害河口最為嚴重, 向外逐步遞減, 表明本海域表層沉積物中的Hg主要由陸源輸入; 表層沉積物中異養細菌水解酶活性與抗性異養菌比例均表現為西南部河口區高于東北部外海海域, 與重金屬Hg的含量分布及Hakanson潛在生態危害指數基本相似, 這表明長期高濃度的重金屬污染, 改變了錦州灣海域表層沉積物中的異養菌的生理代謝過程, 在生理或遺傳物質上對重金屬產生了一定的抗性; 磷酸酶、蛋白酶、脂肪酶與沉積物中Hg的含量具有顯著正相關性, 說明其對重金屬Hg較為敏感, 在一定程度上可作為反映錦州灣海域沉積物中重金屬Hg污染狀況的生物學指標。

重金屬; 潛在生態危害; 異養細菌; 水解酶; 平板擴散法; 抗性

微生物是生態系統中有機物最重要的分解者和初始利用者, 在整個生態系統物質循環和遷移轉化過程中發揮重要作用[1-3]。在海洋環境中, 微生物生產的水解酶類具有非常重要的作用, 它能夠將海水中的大分子的高聚物和顆粒態的有機物分解為可溶性有機物, 便于過細胞膜進入生物體內, 為生物所利用[4]。高濃度重金屬等脅迫下, 會改變微生物菌群的結構和代謝過程, 影響環境中微生物的生物多樣性結構和菌群代謝功能[5]; 同時微生物代謝酶類的變化也能夠反映環境受重金屬污染的水平。近年來, 重金屬污染對近岸海域微生物多樣性和代謝功能的影響已日益受到關注[4, 6]。

錦州灣位于渤海西北, 遼東灣北, 葫蘆島市東, 錦州市西南, 是一個三面環陸, 一面臨海的半封閉海灣[7]。隨著工農業的發展、人口的增長, 排入錦州灣內的污水不僅有周邊市縣的生活污水, 還有葫蘆島鋅廠等眾多企業排放的工業廢水通過連山河、五里河和茨山河等由錦州灣西南部匯合后匯入錦州灣, 這些污水中含有大量的重金屬、有機物、磷酸鹽、石油等, 嚴重影響了周邊海域的水環境質量狀況[8]。此外, 近幾年錦州灣海域的圍填海造成了灣內納潮量的減少、水動力減弱, 降低了海灣的自凈能力, 加劇了水環境的污染[9]。為了研究重金屬對錦州灣海域表層沉積物中異養細菌分布及代謝酶類的影響, 本實驗將錦州灣海域表層沉積物中分離、純化、鑒定得到的116株(17屬)菌株在一定濃度的重金屬Hg脅迫下, 通過平板擴散法測定了淀粉酶、蛋白酶、磷酸酶和脂肪酶四種水解酶的活性, 揭示重金屬污染脅迫下微生物代謝功能的調整規律, 從微生物代謝功能變化角度解析重金屬污染效應。

1 材料與方法

1.1 研究區域

本研究于2012年8月在連山河、五里河和茨山河匯合口的入海口外的海域放射狀布點, 抓斗式采泥器采集沉積物樣品, 將表層(0~5cm)沉積物, 一部分裝入滅菌管中, 另取一部分裝入聚乙烯密封袋中, 驅盡空氣密閉, 均置于–20℃條件下保存, 采樣點位分布見圖1。

圖1 錦州灣海域表層沉積物采樣站位分布圖

1.2 實驗方法

1.2.1 表層沉積物重金屬測定方法

將沉積物樣品于真空冷凍干燥機中冷凍干燥, 去除雜質, 研磨, 過100目篩, 充分混勻, 儲存備用[10]。稱取0.500 g樣品于小燒杯中, 加入30 mL 王水, 蓋上表面皿, 放在電熱板上加熱2 h, 保持王水處于微沸狀態, 冷卻, 定容至100 mL, 以0.7% KBH4為還原劑, 利用液相色譜-原子熒光光度計聯用儀對其測定[11]。

1.2.2 Hakanson潛在生態危害指數法

本文用Hakanson潛在生態危害指數法對錦州灣海域表層沉積物中的重金屬Hg進行評價[12], 其計算方法如下:

式中,i為重金屬i的污染系數;i為表層沉積物中重金屬的實測含量;i為重金屬i的評價參比值, 本文選取國內學者測定的錦州灣沉積物重金屬背景值0.25 mg/kg做參比[7];i為單個重金屬i的潛在生態危害指數;i為重金屬i的毒性相應系數, 反映了重金屬在水相、沉積相和生物相之間的相應關系, 本試驗評價的重金屬Hg的毒性相應系數為40[13]。

表1 單一重金屬潛在生態危害指數對應的危害程度分級標準

1.2.3 平板擴散法測定水解酶活性

1.2.3.1 菌懸液的制備

將從沉積物樣品中經分離、純化、鑒定[15-16]共得到的116株(17個屬)異養細菌, 分別接種于牛肉膏蛋白胨液體培養基中, 于28℃、200 r/min搖床中培養24 h獲得種子培養液; 吸取2 mL種子培養液接種到60 mL新的液體培養基中, 同樣條件下培養24 h得到所需菌懸液。

1.2.3.2 試驗培養基的制備[15]

在牛肉膏蛋白胨基礎培養基中分別添加不同的底物制成試驗培養基。淀粉酶: 可溶性淀粉(10g/L); 磷酸酶: 1%的磷酸酚酞溶液(每100 mL培養基添加0.1mL); 蛋白酶: 等體積的脫脂牛奶(105℃, 10 min滅菌); 脂肪酶: 三丁酸甘油酯(每100 mL培養基添加1 mL)。

準確稱取HgCl2(分析純)5.430 0g, 用無菌去離子水定容后, 再用0.22 μm的膜過濾, 配成濃度為200 mmol/L的重金屬標準溶液, 作為儲備液。將滅菌(121℃, 30 min)后的上述四種水解試驗培養基冷卻至40~50℃, 加入一定量的重金屬儲備液, 搖勻, 使其最終濃度為1 mmol/L。

用打孔器將濾紙片制成6 mm的小圓片, 滅菌后, 蘸取適量的上述菌懸液貼到各水解試驗培養基表面, 設置三個平行樣, 恒溫培養箱35℃倒置培養2 d后, 測量產生的透明圈直徑, 取平均值[17]。

2 結果與討論

2.1 錦州灣表層沉積物中重金屬Hg的含量及其潛在生態風險分布

錦州灣海域表層沉積物重金屬Hg在J9站位含量最低為0.179 mg/kg, 屬于第一類沉積物質量標準(≤0.20 mg/kg), J7和J8站位屬于第三類沉積物質量標準(≤1.00 mg/kg), 其余6個站位均屬于劣三類(>1.00 mg/kg), J1站位重金屬Hg的含量最高, 其值為13.034 mg/kg, 平均含量為4.337 mg/kg, 超出第三類沉積物質量標準, 標準偏差為3.89。錦州灣海域表層沉積物中重金屬Hg的含量分布有一定的差異(圖2)。重金屬Hg的含量空間分布趨勢由錦州灣西南部河流入海口向東北部外海海域逐漸降低, 這表明, 錦州灣海域表層沉積物中重金屬Hg主要由陸源輸入[18]。

圖2 錦州灣海域表層沉積物中重金屬Hg的含量 (mg/kg)

將錦州灣研究海域表層沉積物中的重金屬Hg含量平均值與國內其他典型海灣進行比較(表2), 研究發現, 本海域重金屬Hg的含量明顯高于其他海灣, 表明錦州灣研究海域表層沉積物中的重金屬平均含量在國內海灣中處于相對較高的水平, 錦州灣表層沉積物中的重金屬污染相對嚴重。

重金屬Hg的潛在生態危害指數評價結果如表3所示, 研究區域i在27.72~2085.39之間, 最小值在J9站位, 最大值在J1站位。重金屬Hg在整個研究海域的潛在生態危害分布具有明顯的差異, 在西南部近岸海域潛在生態危害極強, 東北部海域危害較弱, 東部與外海相連的區域危害最弱。

表2 錦州灣表層沉積物中重金屬Hg平均含量與國內其他海灣比較

表3 錦州灣海域表層沉積物中重金屬Hg的潛在生態危害指數評價結果

綜上所述, 錦州灣海域表層沉積物中, 重金屬Hg具含量較高, 且Hg的毒性水平也很高, 具有極強的潛在生態危害風險。在J1站位, Hg的含量最多, 超過了第三類沉積物質量標準,i值最大, 危害程度為極強。這主要是由于該站位于錦州灣西南部五里河、連山河和茨山河三條河流入海口處, 附近有一個葫蘆島鋅廠以及北港工業區的許多企業, 其排放的工業廢水含有大量的重金屬, 此外, 該處入海口較窄長, 灣內的潮流運動較弱, 重金屬較多的沉降在入海口內[13]。

2.2 重金屬Hg脅迫下異養細菌水解酶活性大小分布

本文研究了重金屬Hg脅迫下錦州灣海域表層沉積物中的異養菌水解酶活性, 包括淀粉酶、磷酸酶、蛋白酶和脂肪酶, 見表4和圖3。

表4 錦州灣海域表層沉積物中異養細菌水解酶產生的透明圈直徑

淀粉酶可直接參與海洋C循環, 在海洋有機物污染防治中具有重要作用[24], 研究海域各站位表層沉積物中異養細菌淀粉酶水解產生的透明圈直徑由西南部河口向東部外海海域先增大后減小; 磷酸酶能夠裂解有機磷化合物, 在農藥污染以及富營養化防治中具有重要作用[25], 透明圈直徑差別較小, 西南部河口區略高于東北部外海海域; 蛋白酶是一種優良的酶制劑, 在海洋有機物污染以及船舶防污領域具有重要的作用[26], 透明圈直徑差別較小, 西南部河口區高于東北部外海海域; 脂肪酶是一類具有多種催化能力的酶, 在海洋石油污染方面具有重要作用[27], 透明圈直徑具有明顯差異, 西南部河口區明顯高于東北部外海海域。

海洋微生物能夠利用代謝酶類將溶解態和顆粒態有機物降解成小于600 Da的小分子物質, 這對海洋環境的可持續發展非常關鍵[28-29]。因此, 了解重金屬脅迫下微生物水解酶活性的強弱對環境中大分子有機物的分解以及海洋生態系統的能量流動和物質循環均具有重要意義。總體上, 重金屬Hg脅迫下, 錦州灣海域表層沉積物中異養細菌水解酶活性表現為西南部河口區高于東北部外海海域, 與重金屬Hg的含量分布趨勢基本相似。錦州灣海域西南部河口區重金屬Hg的含量低, 在本實驗中高濃度重金屬Hg脅迫下, 重金屬離子與異養細菌酶分子必需基團巰基進行不可逆結合, 從而抑制了水解酶的活性[30]; 西南部河口區重金屬Hg含量高, 長期高濃度重金屬暴露下, 有些微生物通過改變生理代謝等過程對重金屬產生不同程度的抗逆性能, 與其抗性有關的水解酶會表現出一定的活性并得到積累[31], 因此本研究中, 高濃度重金屬Hg脅迫下, 西南部河口區異養菌水解酶表現出較高的活性。

2.3 重金屬Hg脅迫下抗性異養菌比例分布

錦州灣海域表層沉積物中抗性異養菌所占比例如圖4所示。水解酶作用下, 重金屬含量最高的J1站位, 有50%左右的異養菌對重金屬Hg產生抗性, 而在重金屬含量低的J7站位, 抗性異養菌的數量所占的比例僅為20%左右, 西南部河口區各站位抗性異養菌所占的比例明顯高于東北部外海海域各站位, 與重金屬Hg的含量分布趨勢相似。產生本結果的原因為: 本研究中異養細菌在高濃度重金屬Hg試驗培養基中培養時間為2d, Hg對異養細菌產生短期的“觸殺”效應[32], 而錦州灣海域表層沉積物中的重金屬污染是長期積累的, 部分微生物通過自身生理代謝功能的應性改變, 進而適應不利外部條件, 對重金屬產生不同程度的抗逆性能, 從而能夠在本研究高濃度重金屬環境下存活下來。

圖3 錦州灣海域表層沉積物中抗性微生物4種水解酶透明圈直徑大小(cm)

圖4 錦州灣海域表層沉積物抗性異養細菌比例分布

有關研究表明, 微生物群落通常用于揭示重金屬長期污染的結果, 微生物對重金屬的抗性與環境中重金屬的含量有直接關系[33, 34]。長期重金屬污染環境中, 微生物自身會發展一系列的抗性機制以減小外界環境對機體的傷害[35], 研究分離菌株與重金屬抗性的關系對環境污染狀況的治理具有重要的意義。

2.4 異養細菌水解酶活性與沉積物中Hg含量之間的相關關系

用SPSS19對重金屬Hg脅迫下異養細菌水解酶活性與表層沉積物中Hg含量之間的相關性進行分析, 結果如表5所示。

表5 異養細菌水解酶活性與重金屬Hg含量之間的相關關系

注: “**”表示=0.01時顯著相關

重金屬脅迫下, 磷酸酶、蛋白酶、脂肪酶活性與表層沉積物中Hg含量之間具有極顯著正相關性, 相關系數分別為0.878、0.814、0.871(<0.01), 而淀粉酶與重金屬Hg含量之間不存在相關性。這表明磷酸酶、蛋白酶、脂肪酶對重金屬Hg較為敏感, 在一定程度上可作為反映錦州灣海域重金屬Hg污染狀況的生物學指標。

3 結論

(1) 錦州灣海域表層沉積物中重金屬Hg的含量以及潛在生態危害具有明顯的空間分布特征, 呈現從河口向外海方向遞減的趨勢, 最高值出現在錦州灣西南部五里河、連山河和茨山河入海口處, 最低值出現在錦州灣東部與外海相連接處。與國內其他海灣相比, Hg的平均含量處于相對較高水平, 潛在生態危害極強。

(2) 錦州灣海域表層沉積物中異養細菌水解酶活性表現為西南部河口區高于東北部外海海域, 與重金屬Hg的含量分布及Hakanson潛在生態危害指數趨勢基本相似。西南部河口區重金屬污染嚴重, 長期高濃度的重金屬污染, 改變了錦州灣海域表層沉積物中的異養菌的生理代謝過程, 一些對重金屬敏感的菌株會逐漸產生適應性, 水解酶活性的增加是異養細菌在逆境下的適應表現之一。磷酸酶、蛋白酶、脂肪酶與沉積物中Hg含量之間存在極顯著正相關性, 對沉積物中的重金屬更為敏感, 可作為反映重金屬污染狀況的靈敏性指標, 進而反映錦州灣海域表層沉積物的環境質量。

(3) 錦州灣海域表層沉積物中抗性異養菌的數量西南部河口區明顯高于東北部外海海域, 這種趨勢表明錦州灣海域異養細菌的重金屬抗性與沉積物中重金屬的長期積累有一定的關系。東北部海域重金屬含量低, 異養細菌對重金屬的抗性低, 本研究中高濃度重金屬含量對該海域的異養細菌產生了短期的“觸殺”效應, 而西南部河口區沉積物中的重金屬污染是長期積累的, 在該區域存活的異養細菌在生理或遺傳物質上必定對重金屬產生一定的抗性。

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(本文編輯: 康亦兼)

Research on effects of Hg on the metabolic enzymes of heterotrophic bacteria in surface sediments of Jinzhou Bay

XU Qing-tong1, 2, LIU Rui-zhi2, GUO Xiao-ya3, LI Jie1, LEI Kun2, LIU Qing-qing2, HAO Chen-lin2

(1. School of Environmental and Municipal Engineering, Qingdao University of technology, Qingdao 266033, China; 2. State Key Laboratory of Environmental Criteria and Risk Assessment (SKLECRA), CRAES, Chinese Research Academy of Environmental Sciences, Beijing 100012, China; 3. Shandong Province Jiaodong Water Transfer Bureau, Qingdao 266033, China)

To understand the effects of Hg on the major metabolic enzymes of heterotrophic bacteriain the surface sediments of Jinzhou Bay, in this study, we conducted field investigations and collected surface sediment samples from Jinzhou Bay in August 2012. We evaluated the potential ecological risk of Hg using the Hakanson method and performed diffusion plate assays to measure the activity of four kinds of metabolic enzymes of heterotrophic bacteria. The results showed that the content and potential ecological risk of Hg were highest and most serious in the estuary and this situation gradually weakened from the estuary to the ocean, which indicated that most Hg in the surface sediments of Jinzhou Bay originated from land sources. The metabolic enzyme activity of heterotrophic bacteria and the ratio of resistant heterotrophic bacteria were both higher in the southwest coastal waters than in the northeast offshore waters, which were also similar to the distribution of the heavy metal Hg content and the Hakanson potential ecological risk. This indicates that the metabolism of heterotrophic bacteria changed under long-term high concentrations of heavy metals pollution and produced a certain physiological resistance to heavy metals. The contents of phosphatase, protease, and lipase showed a significant positive correlation with the content of the heavy metal Hg, respectively, which indicates that they can be used as sensitivity indexes to reflect heavy metal Hg pollution in the surface sediments of Jinzhou Bay.

heavy metal; potential ecological risk; heterotrophic bacteria; metabolic enzyme; diffusion plate assay; resistance

[National Science and Technology Basic Work, No.2013FY111100- 005; Special Fund for Marine Public Welfare Industry Research, No.201505001; Natural Science Foundation of Shandong Province, No. ZR2013DM003; Special Fund for Environmental Public Welfare Industry Research, No.201409100]

Sep. 30, 2016

X172

A

1000-3096(2017)08-0108-08

10.11759/hykx20160930001

2016-09-30;

2016-12-08

科技基礎工作專項(2013FY111100-005); 海洋公益性行業科研專項項目(201505001); 山東省自然科學基金項目(ZR2013DM003); 環保公益性行業科研專項(201409100)

徐慶彤(1991-), 男, 山東濰坊人, 碩士研究生, 主要研究方向為環境微生物, E-mail: Andyxqt@163.com; 劉瑞志(1980-), 通信作者, 博士, 副研究員, 主要從事環境微生物與海洋污染防治研究, E-mail: liuruizhi@craes.org.cn; 李捷(1972-),通信作者, 博士, 教授, 主要研究方向為環境生態學, E-mail: jli2001@sina.cn