低頻電針對SNI神經痛大鼠脊髓背角P物質表達的影響

何曉芬,蔣永亮,葉佳瑜,顏思思,邵曉梅,吳媛媛,杜俊英,陳曉軍,陳利芳,嚴偉,方劍喬,趙文勝

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低頻電針對SNI神經痛大鼠脊髓背角P物質表達的影響

何曉芬1,蔣永亮1,葉佳瑜1,顏思思1,邵曉梅1,吳媛媛1,杜俊英1,陳曉軍1,陳利芳1,嚴偉2,方劍喬1,趙文勝3

(1.浙江中醫藥大學第三臨床醫學院,杭州 310053;2.浙江省人民醫院，杭州 310014;3.浙江中醫藥大學附屬浙江省中西醫結合醫院,杭州 310003)

探討低頻電針對神經痛大鼠的干預效應及對脊髓背角P物質(substance P,SP)的調節作用。將SD大鼠隨機分為正常組(normal)、假手術組(sham SNI)、手術組(SNI)和電針組(SNI＋EA),每組8只。采用坐骨神經分支選擇性損傷(spared nerve injury,SNI)模型建立大鼠神經痛模型,2 Hz電針治療選取術側足三里、昆侖穴,每日1次,治療14 d。檢測大鼠術側后足縮腿閾(paw withdrawal threshold,PWT),觀察大鼠痛覺超敏反應。用免疫熒光法檢測術側脊髓背角SP陽性表達。SNI組大鼠術側PWT明顯降低(＜0.01),電針能提高SNI神經痛大鼠術側的PWT(＜0.01)。SNI組大鼠健側痛閾無顯著變化(＞0.05)。SNI組大鼠術側脊髓背角SP表達增多(＜0.01),健側脊髓背角SP陽性表達增多(＜0.05),電針能降低SNI大鼠術側脊髓背角SP表達(＜0.01),電針對健側脊髓背角SP表達無顯著改變(＞0.05)。Sham SNI組大鼠術側、健側PWT和術側、健側脊髓背角SP表達均無顯著變化(＞0.05)。低頻電針能改善大鼠神經痛,其機制可能與其有抑制術側脊髓背角SP表達有關。

電針;神經痛;脊髓背角;P物質;大鼠

神經病理痛,如中風后遺痛、皰疹后遺痛、三叉神經痛等,是臨床上常見、多發又難治的慢性疼痛疾病,針灸尤其是電針療法作為治療痛癥的一種常用方法,已被廣泛應用于神經病理痛的治療,其療效亦十分明確[1-5],然而電針治療神經病理痛的機制有待進一步研究。P物質(Substance P,SP)是與傷害性信息傳導密切相關的神經活性物質,存在于背根神經節和脊髓背角[6-8]。已有研究表明,在多種慢性疼痛中[9-10],SP作為疼痛遞質通過感覺神經傳入纖維向上傳遞至脊髓中樞,參與疼痛在脊髓中樞的傳導和調制[11]。課題組前期研究發現,電針可以通過下調神經病理痛大鼠背根神經節SP的表達以減輕神經痛[12],但對電針能否通過調控脊髓背角SP表達以發揮鎮痛效應有待進一步研究。本研究擬建立坐骨神經選擇性損傷(spared nerve injury,SNI)模型,通過觀察電針對SNI神經痛大鼠脊髓背角SP陽性表達的影響,以進一步探討電針鎮痛的可能機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

選用清潔級健康雄性Sprague Dawley(SD)大鼠32只,體重(180±20)g,購自中國科學院上海實驗動物中心[SCXK(滬)2008-0016],由浙江中醫藥大學實驗動物中心飼養。飼養期間給予嚙齒類動物標準顆粒飼料及自由飲水,12 h循環燈光。

1.2 儀器設備與實驗試劑

足底機械痛測量儀(意大利UGO BASILE公司)、韓式穴位神經刺激儀(北京華衛產業開發公司)、0.25 mm×13 mm無菌針灸針(蘇州醫療用品廠有限公司)、恒溫手術臺(Harvard公司)、冰凍切片機(美國Thermo公司)、激光共聚焦顯微鏡(日本Nikon公司)、兔抗大鼠SP多克隆抗體(美國Abcam公司)。

1.3 分組與造模

采用完全隨機法將大鼠隨機分為4組,即正常組(Normal)、假手術組(Sham SNI)、手術組(SNI)、電針組(SNI＋EA),每組8只。采用坐骨神經分支選擇性損傷神經痛大鼠模型[13]。SD大鼠稱重后,用10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)腹腔注射麻醉。大鼠俯臥位固定在手術臺上,右后肢剃毛,碘伏消毒,乙醇脫碘。在大鼠股骨中點下約0.5 cm處,將大鼠皮膚切開約1 cm,鈍性分離臀部肌肉和股二頭肌,暴露坐骨神經主干及其分支(脛神經、腓腸神經和腓總神經),用5/0絲線將脛神經和腓總神經緊緊結扎,在結扎遠側端距神經干遠端約2～4 mm處切斷,腓腸神經保留完整性。避免過分牽拉及損傷神經。然后逐層縫合傷口,并在術側大腿肌注4～5單位青霉素以預防感染。Sham SNI組大鼠僅暴露神經,不進行結扎與切斷,其余操作同SNI組。Normal組不做任何處理。

1.4 電針干預

造模1 d后開始電針干預。電針組選取術側足三里、昆侖,采用0.25 mm×13 mm毫針,進針后連接韓氏穴位神經刺激儀進行電刺激,頻率選用2 Hz,電流強度先用1 mA,每10 min遞增1 mA,共治療30 min,每日治療1次,共治療14 d。Normal、Sham SNI、SNI組不進行電針干預,僅給予同電針組相同的固定。

1.5 痛閾檢測

采用動態足底測量儀檢測大鼠雙側后足縮腿閾(paw withdrawal threshold,PWT),作為大鼠痛覺異常的指標。各組大鼠于基礎痛閾測量前,進行3 d適應性測痛,以減少環境對實驗大鼠痛閾的影響。測量時將大鼠置于鐵絲網上透明塑料盒內,待大鼠安靜后(即停止梳理毛發和探索活動),將類似Von Frey絲的金屬絲置于大鼠后足足底外側(腓腸神經支配區域)。啟動機械泵,刺激力量從0 g開始以2.5 g/s遞增,直至引發大鼠逃逸反應(縮腿),此時電子記錄器記錄的數值即為大鼠痛閾。設定最大刺激力量為50 g,以免大鼠足跖損傷。痛閾檢測時間點為造模前(base)、造模后1 d (D1)、電針后14 d(D14)3個時間點,檢測所有大鼠術側和健側PWT。連續測量5次,每次間隔5 min,去最大值和最小值后,取3次縮腿閾的平均值作為一個時間點痛閾值。

1.6 免疫熒光法檢測脊髓背角SP水平

用10%水合氯醛0.35 mL/100 g的劑量腹腔注射麻醉大鼠,開胸暴露心臟,經左心室、升主動脈用生理鹽水(4℃預冷)快速灌注,直至流出液為澄清液體,接著緩慢推注4%多聚甲醛150 mL,隨后以先快后慢的方式滴注4%多聚甲醛500 mL。快速取出大鼠腰段脊髓(即腰膨大),置于4%多聚甲醛溶液中后固定6 h,繼以移入15%、 30% 蔗糖溶液梯度脫水,經液氮速凍后,置入﹣80℃冰箱保存。取出大鼠脊髓,用OCT包埋后,固定于冰凍切片機的凍頭上,以50mm厚度修片至所需組織部位,以30mm切取組織。小心取出切片,TBST漂洗10 min×3次;用10%驢血清(TBST稀釋),37℃孵育1 h,以增加細胞通透性和封閉非特異性結合點,切勿洗片;加入兔抗大鼠SP多克隆抗體(1:1000),4℃孵育過夜, TBST漂洗10 min×3次;加入Alexa Fluor?488驢抗兔IgG(H＋L)(1:400,用含10%驢血清的TBST稀釋),進行免疫熒光標記,37℃孵育(避光)1 h,TBST漂洗10 min×5次(避光);將漂洗干凈的切片轉移至處理好的載玻片上,擦干水漬,滴加抗熒光淬滅封片液封片;激光共聚焦顯微鏡下觀察并攝取圖片。選用ImageProPlus6.0病理圖像分析系統計算陽性細胞率。每組選取3只大鼠,每只大鼠取5張不連續切片,分別記錄大鼠術側腰段脊髓背角淺層(Ⅰ～Ⅱ層)內磷酸化SP陽性像素點和區域總像素點,并計算其陽性百分率。

1.7 統計學方法

本實驗所有數據采用均數±標準誤表示。術側、健側PWT數據采用多次重復測量方差分析方法分析,其余數據均采用單因素方差()分析,以＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 電針對SNI大鼠術側PWTs變化的影響

動態觀察造模前(base)、造模后1 d和14 d術側足跖PWT變化。如表1所示,造模前各組大鼠術側足跖基礎(base)PWT差異無統計學意義(＞0.05)。造模后各時間點,SNI組和SNI＋EA組大鼠術側足跖PWT顯著降低,明顯低于Normal組和Sham SNI組大鼠(＜0.01)。電針治療1 d、14 d后,SNI＋EA組大鼠術側PWT明顯高于SNI組。造模后各時間點,Sham SNI組大鼠術側足跖PWT與Normal組比較差異均無統計學意義(＞0.05)。

2.2 電針對SNI大鼠健側PWT變化的影響

動態觀察造模前(base)、造模后1 d和14 d健側足跖痛閾變化。

如表2所示,造模前各時間點各組大鼠健側足跖PWT差異均無統計學意義(＞0.05)。

表1 電針對SNI大鼠術側PWTs變化的影響 (±s,g)

注:與Normal組比較1)＜0.01;與Sham SNI組比較2)＜0.01;與SNI組比較3)＜0.01

2.3 電針對SNI大鼠術側脊髓背角SP陽性細胞表達變化的影響

如表3所示,Normal組和Sham SNI組大鼠術側脊髓背角SP陽性細胞表達(圖1)差異無統計學意義(＞0.05)。與Normal組和Sham SNI組比較,SNI組大鼠術側脊髓背角SP陽性細胞表達明顯升高(＜0.01);與SNI組比較, SNI＋EA組大鼠術側脊髓背角SP陽性細胞表達明顯下降(＜0.01)。

表2 電針對SNI大鼠健側PWTs變化的影響 (±s,g)

表3 電針對SNI大鼠術側脊髓背角SP陽性細胞表達變化的影響 (±s,%)

注:與Normal組比較1)＜0.01;與Sham SNI組比較2)＜0.01;與SNI組比較3)＜0.01

圖1 為術側脊髓背角SP陽性細胞表達免疫熒光代表圖;

(免疫熒光×100)

2.4 電針對SNI大鼠健側脊髓背角SP陽性細胞表達的影響

如表4所示,Normal組和Sham SNI組大鼠健側脊髓背角SP陽性細胞表達(圖2)差異無統計學意義(＞0.05)。與Normal組和Sham SNI組比較,SNI組大鼠健側脊髓背角SP陽性細胞表達明顯升高(＜0.05);SNI組和SNI＋EA組大鼠健側脊髓背角SP陽性細胞表達差異無統計學意義(＞0.05)。

表4 電針對SNI大鼠健側脊髓背角SP陽性細胞表達變化的影響 (±s,%)

注:與Normal組比較1)＜0.05;與Sham SNI組比較2)＜0.05

圖2 為健側脊髓背角SP陽性細胞表達免疫熒光代表圖;

(免疫熒光×100)

3 討論

神經病理痛是臨床常見的病癥之一,由于其發病機制復雜,一直是基礎和臨床研究的重點和難點[14-16]。目前常用的神經病理痛模型有脊神經選擇結扎模型[17]、坐骨神經部分結扎模型[18]、坐骨神經慢性壓迫模型[19]以及坐骨神經選擇性損傷(SNI)模型[13]。SNI模型制作時,選擇性結扎腓總神經及切斷脛神經后遠端,保留腓腸神經的完整性,是相對比較新型的神經痛制作模型,主要模擬臨床上外周神經損傷所致的神經病理痛,具有制作簡單、模型穩定、重復性好等優勢[20-22],課題組前期已成功建立SNI模型[23],用于急性和慢性實驗的行為學及機制探討。我們在實驗中觀察到,造模后SNI模型大鼠健側機械痛閾無明顯變化,而模型制作1 d后,SNI模型大鼠術側機械痛閾明顯降低,一直持續至實驗結束,表明神經病理痛模型成功建立。

神經病理痛可歸屬于中醫學“痹證”范疇,中醫學理論認為“不通則痛”“經脈者,所以能決生死,處百病,調虛實,不可不通”。基于“始足脛者,先取足陽明而汗出”理論,故本實驗選取足三里穴。昆侖穴具有通利關節、舒經活絡作用[24],故同時選用昆侖穴。本實驗結果顯示電針治療可顯著提高SNI大鼠痛閾,與前期實驗結果相一致[23],已有研究證明多次重復針刺具有累積效應,其療效隨著治療次數的增加而明顯增加。而針刺耐受是影響鎮痛效果的重要因素,針刺耐受導致電針隨著治療次數的增加其鎮痛作用反而降低[25-26],本實驗電針治療14 d痛閾沒有高于電針治療1 d的痛閾,可能由于針刺耐受導致電針隨著治療次數的增加其鎮痛作用反而降低而致,也有可能是由于SNI神經病理痛大鼠疼痛一直在逐漸加重所致。

神經肽SP是速激肽家族中重要一員[27-28],廣泛分布于中樞神經系統和外周組織中[29-31]。脊髓作為傷害性信號向上位腦結構傳遞的中繼站,初級傷害性傳入神經終末止于脊髓背角的不同層,并且與不同的二級脊髓神經元接觸,從而使脊髓背角成為疼痛信息傳遞和整合的初級中樞,所以本研究選擇大鼠脊髓背角脊髓來作為研究部位。脊髓的SP是公認的與傷害性信息傳導密切相關的神經活性物質[30,32],參與多種疼痛過程[33]。研究表明大鼠注射甲醛后發現脊髓背角Ⅰ、Ⅱ層SP免疫陽性物表達明顯增強,也有研究表明大鼠左側后爪足底切口可增加同側脊髓背角SP免疫反應[9],也有研究表明SNL神經痛模型大鼠健側脊髓背角的小膠質細胞陽性細胞表達增多[34]。本實驗結果也顯示SNI模型大鼠術側脊髓背角SP陽性物表達明顯增多,且主要表達在脊髓背角淺層,健側脊髓背角SP陽性物表達也明顯增多,這可能與病理狀態下自身代償有關。電針能顯著降低脊髓背角SP陽性物表達,對健側脊髓背角上升的SP陽性物表達雖有下調作用,但是無統計學差異,可能與只選取了術側的足三里和昆侖穴有關,建議在以后的研究中選用雙側足三里和昆侖穴對神經病理痛進行治療。

綜上所述,我們的研究表明,低頻電針能改善神經病理痛,其機制可能與抑制術側脊髓背角SP的表達有關。本實驗闡明了電針治療神經病理痛的部分機制,有利于電針更廣泛、更有效地運用于臨床上神經病理痛的治療。

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Effect of Low-frequency Electroacupuncture on Substance P Expression in the Spinal Dorsal Horn in SNI Neuralgia Rats

1,1,1,1,1,1,1,1,1,2,1,3.

1.Z310053,; 2.310014,;310003,

To investigate the intervening effect of low-frequency electroacupuncture on rat neuralgia and its regulating effect on substance P (SP) in the spinal dorsal horn.SD rats were randomized to normal, sham operation (sham SNI), operation (SNI) and electroacupuncture (SNI+EA) groups, 8 rats each. A rat model of neuralgia was made by spared sciatic nerve injury (SNI). Points Zusanli(ST36) and Kunlun(BL60) on the operation side were given 2 Hz electroacupuncture once daily for 14 days. The rat hind paw withdrawal threshold (PWT) was measured on the operation side to observe its pain hypersensitivity. SP-positive expression in the spinal dorsal horn on the operation side was determined by immunofluorescence.Operative side PWT decreased significantly in the SNI group of rats (＜0.01). Electroacupuncture increased operative side PWT in the SNI neuralgia rats (＜0.01). Pain threshold on the healthy side had no marked change in the SNI group of rats (＞0.05). SP-positive expression in the spinal dorsal horn increased on the operation side (＜0.01) and also on the healthy side (＜0.05) in the SNI group of rats. Electroacupuncture decreased SP-positive expression in the spinal dorsal horn on the operation side in the SNI rats (＜0.01). Electroacupuncture did not significantly change SP-positive expression in the spinal dorsal horn on the healthy side (＞0.05). PWT on the operation and healthy sides and SP-positive cell expression in the spinal dorsal horn on the operation and healthy sides had no marked changes in the SNI group of rats (＞0.05).Low-frequency electroacupuncture can relieve rat neuralgia. Its mechanism may be related to it inhibiting SP-positive expression in the spinal dorsal horn on the operation side.

Electroacupuncture; Neuralgia; Spinal dorsal horn; Substance P; Rats

1005-0957(2017)12-1469-06

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2017.12.1469

2017-05-20

浙江省自然科學基金項目(LY16H270013,LQ17H270003,LY14H270007,LY14H270002);國家自然科學基金項目(81303038,81303039,81473772);浙江中醫藥大學校級科研基金項目(2013ZZ06)

何曉芬(1986—),女,實驗師

方劍喬(1961—),男,教授,博士生導師,Email:fangjianqiao7532@163.com

趙文勝(1970—),男,副教授,碩士生導師,Email:zjmzhaowensheng@163.com