阿哌沙班中8種已知雜質的HPLC法定量檢測

摘 要：建立高效液相色譜法測定阿哌沙班中的8個已知雜質。色譜柱為Waters Xbridge Shield RP18（150 mm×4.6 mm，

5 μm）；以乙腈-醋酸銨溶液為流動相，柱溫：40 ℃，流量：1.0 mL/min，檢測波長280 nm。阿哌沙班中8種雜質分離較好，與主峰均能有效分離，線性范圍為0.01～11 μg/mL；8種雜質的平均回收率分別為98.7%，105.3%，100.7%，111.4%，97.4%，103.4%，98.9%，97.6%，RSD分別為2.8%，4.3%，3.3%，4.5%，3.1%，4.0%，2.7%，3.1%。該法簡便、準確、重復性好，可為阿哌沙班質量標準的制定提供參考。

關鍵詞：阿哌沙班；高效液相色譜法；雜質；回收率；分離

文獻標志碼：A 文章編號：1674-5124（2017）03-0036-07

Abstract： To establish an HPLC method to determine eight kinds of impurities in Apixaban. Chromatographic column is Waters Xbridge Shield RP18（150 mm×4.6 mm，5 μm）， acetonitrile- ammonium acetate solution is mobile phase， The column temperature is 40 ℃ and the flow velocity is 1.0 mL/min， The detection wavelength is 280 nm. Eight kinds of impurities in Apixaban were separated from the primary front effectively and the linearity range was 0.01-11 μg/mL. The average recovery rates of the eight impurities are 98.7%， 105.3%， 100.7%， 111.4%， 97.4%， 103.4%， 98.9%， 97.6%， and the RSDs were 2.8%， 4.3%， 3.3%， 4.5%， 3.1%， 4.0%， 2.7%， 3.1%. This method is simple， accurate and of good repeatability. It provides quality standards for erythromycin apixaban.

Keywords： Apixaban； high performance liquid chromatographic method； impurities； recovery rate； separate

0 引 言

阿哌沙班（Apixaban）是一種新型口服Xa因子抑制劑，用于預防和治療血栓[1-2]，其化學名為1-（4-甲氧基苯基）-7-氧代-6[4-（2-氧代-1-哌啶基）苯基]-4，5，6，7-四氫-1H-吡唑[3，4-c]吡啶-3-甲酰胺。

2007年，百時美施貴寶與輝瑞正式執行全球戰略性合作協議，聯合開發并銷售抗凝血產品阿哌沙班；2011年，在歐盟27國及冰島、挪威，率先批準用于擇期髖關節或膝關節置換手術成人患者靜脈血栓癥的預防[3-5]；2013年1月，獲得中國國家食品藥品監督管理局頒發的進口藥品許可證，用于髖關節或膝關節擇期置換術的成年患者，預防靜脈血栓栓塞（VTE），于2013年4月正式在中國上市[6-8]。

采用高效液相色譜法測定阿哌沙班中有關物質已有文獻報道，但未明確降解產物以及可能存在的雜質[9-10]。根據人用藥物注冊技術要求國際協調會議（ICH）原料藥雜質研究要求，參考阿哌沙班的進口標準，并按照《中國藥典》2015年版四部中藥品雜質分析指導原則，探索HPLC分離阿哌沙班與其8個已知雜質（結構見圖1[11]）的檢測條件，并進行方法學驗證。

1 儀器與試藥

儀器：Series 1500高效液相色譜儀；UV759CRT紫外可見分光光度計；BP 210D電子分析天平。

試藥：阿哌沙班樣品（批號：131101，140101，

140201，140301）；阿哌沙班對照品（批號：130901，含量：99.80%）；雜質A（批號：130701，含量：97.12%）；雜質B（批號：130701，含量：96.71%）；雜質C（批號：130701，含量：98.92%）；雜質D（批號：130701，含量：99.17%）；雜質E（批號：130601，含量：97.97%）；雜質F（批號：130701，含量：97.11%）；雜質G（批號：130701，含量：96.12%）；雜質A9-5（批號：130701，含量：99.54%）；以上試藥均為成都克萊蒙醫藥科技有限公司制造。乙腈為分析純，純化水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Xbridge Shield RP18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：A相為乙腈，B相為10 mmol/L醋酸銨溶液，梯度洗脫（見表1）；流量1.0 mL/min；檢測波長為280 nm；柱溫40 ℃；進樣量：10μL。

2.2 系統適用性試驗

精密稱取雜質A，B，C，D，E，F，G，A9-5及阿哌沙班對照品適量，用乙腈-水（35∶65，ν∶ν）溶解并制成每1 mL含各雜質及阿哌沙班對照品約1.0 μg的混合溶液，按2.1項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖。雜質A，B，阿哌沙班，C，D，E，F，G，A9-5依次出峰，阿哌沙班與相鄰雜質以及各雜質峰之間的分離度大于1.3，理論塔板數按阿哌沙班主峰計大于5 000，見圖2。

2.3 專屬性試驗

分別精密稱取阿哌沙班樣品（批號131101）適量，對其進行酸、堿、氧化、高溫及紫外光照等強制降解試驗，按2.1項下色譜條件進行測定，結果如表2及圖3～圖8所示。

由上述破壞實驗結果可知，阿哌沙班對高溫、酸、氧比較穩定，在高溫120 ℃條件下破壞72 h、0.01 mol/L的酸條件下破壞1 h、3%的雙氧水下破壞1 h，基本無變化；在堿破壞下，于相對保留時間0.363產生了一個未知雜質，雜質量為0.3%，已知雜質A的量有所增加，由0.3%增加至0.6%；在紫外光下光照72 h，相對保留時間0.4的未知雜質由0.1%增加至0.2%，其他雜質幾乎無變化。結果表明本品對熱、酸、氧穩定，對堿、紫外燈光不穩定，因此在本品的儲藏和運輸過程中應注意避光和密封。

在各破壞條件下產生的雜質與主峰，以及雜質與雜質之間分離度均在1.5以上，能達到完全分離，主峰峰純度均在0.999以上，雜質峰峰純度基本均達0.99以上，峰降解平衡在95%～105%之間，結果表明該方法專屬性良好，能檢測出本品在儲藏和運輸過程的極端條件下產生的降解產物。

2.4 檢測限、定量限

取2.2項的混合溶液適量，用乙腈-水（35∶65，ν∶ν）稀釋至一定濃度，2.1項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖，同時走空白基線，以儀器基線噪音3倍峰高作為檢測限（S/N≥3），儀器基線噪音10倍峰高作為定量限（S/N≥10），得各雜質的定量限與檢測限見表3。

2.5 線性與范圍

精密稱取阿哌沙班及各雜質對照品適量，用乙腈-水（35∶65，ν∶ν）溶解并稀釋制成適宜濃度，按2.1項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖，以濃度-峰面積做曲線，結果見表4。

2.6 回收率試驗

取阿哌沙班各雜質對照品適量，加乙腈-水（35∶65，ν∶ν）溶解并稀釋制成每1 mL含各雜質10.0 μg的混合儲備液。再精密量取混合儲備液1.0 mL，置10 mL量瓶中，用乙腈-水（35∶65，ν∶ν）稀釋制刻度，搖勻，即得對照品溶液。

供試品溶液的制備：精密稱取阿哌沙班（130901）約10 mg，10份，一份加乙腈-水（35∶65，ν∶ν）溶解并稀釋至刻度搖勻，作為供試品溶液1；3份分別加入混合儲備液0.5 mL，再加乙腈-水（35∶65，ν∶ν）溶解并稀釋至刻度搖勻，作為50%供試品溶液2～4；3份分別加入混合儲備液1.0 mL，再加乙腈-水（35∶65，ν∶ν）溶解并稀釋至刻度搖勻，作為100%供試品溶液5～7；3份分別加入混合儲備液1.5 mL，再加乙腈-水（35∶65，ν∶ν）溶解并稀釋至刻度搖勻，作為150%供試品溶液8～10。取上述對照品溶液、供試品溶液按2.1項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖。以峰面積外標法計算各供試品中各雜質的含量，并計算回收率。結果見表5，各雜質回收率良好。

2.7 精密度試驗

取阿哌沙班對照品（130901）6份，加乙腈-水（35∶65，ν∶ν）溶解并稀釋制成每1 mL含阿哌沙班1 mg的供試品溶液，按2.1項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖。已知雜質按峰面積外標法計算含量，結果顯示6份樣品均只檢出雜質F和雜質G，6份樣品中雜質F和雜質G含量RSD分別為2.99%和1.30%和重復性良好。

由不同人員在不同時間、不同儀器上對同一批號樣品測定12次各雜質的平均含量分別為：雜質F 0.020 1%、雜質G 0.016 3%、未知單雜0.039%、總雜質0.167%；RSD分別為：雜質F 3.33%、雜質G 9.84%、未知單雜9.66%、總雜質9.61%，中間精密度良好。

2.8 穩定性試驗

取阿哌沙班及各雜質適量，加乙腈-水（35∶65，ν∶ν）溶解并稀釋制成每1 mL含阿哌沙班1 mg的供試品溶液、含各雜質1 μg的混合雜質對照品溶液；取上述供試品溶液和對照品溶液按2.1項下色譜條件進行測定，供試品溶液和對照品溶液在24 h內都未產生任何新的雜質，結果見表6和表7。

2.9 耐用性

柱溫、流動相、流量、緩沖鹽濃度發生微小改變，按2.1項下色譜條件進行測定，樣品中雜質個數和雜質量以及各成分峰之間的分離度幾乎無變化；但當色譜柱發生改變時，雜質分離度發生較大變化，但測定雜質含量變化不是很大（見表8），由此可證明在色譜柱不發生變化的情況下，本方法的耐用性良好。

2.10 樣品檢測結果

依據上述方法測定3批樣品中8個雜質的含量，結果見表9。由表可知，3批樣品中均只檢出雜質F、雜質G與未知單雜，且含量均符合規定。

3 討 論

3.1 測定波長的確定

在200～400 nm的波長范圍內阿哌沙班、各雜質進行波長掃描，結果具有不同的紫外特征峰，但在280 nm附近均有吸收，參考阿哌沙班片進口注冊標準（標準號：JX20120076）及文獻有關物質的檢測波長，最終選擇280 nm作為本品有關物質的檢測波長。

3.2 雜質檢測進樣濃度的確定

根據化學藥物研究技術指導原則對有關物質限度的要求，原料的雜質報告限度、鑒定限度、質控限度分別為0.05%，0.10%，0.15%（每日最大劑量<2 g），因此為了保證0.05%的雜質能檢出，根據本品的檢測限試驗結果，以進樣10 μL計算，有關物質檢查的質量濃度至少應為1.25 ng/10 μL/0.05%×10-3=0.25 mg/mL，為保證樣品中各雜質檢出的準確性，確定有關物質檢測質量濃度為1.0 mg/mL，進樣量為10 μL。

4 結束語

通過上述實驗結果表明：在優化阿哌沙班中8個已知雜質測定的色譜條件下，破壞產生的雜質與主峰，以及雜質與雜質之間分離度均在1.5以上，能達到完全分離，主峰峰純度均達到0.999 5，雜質峰峰純度基本均達0.99以上；各破壞樣品的物料平衡均在99.2%～102.8%之間，說明該方法專屬性良好，能檢測出阿哌沙班在儲藏和運輸過程的極端條件下產生的雜質。

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（編輯：莫婕）